CN111944705B

CN111944705B - 一种球毛壳菌的固态发酵方法、制备的菌剂及其应用

Info

Publication number: CN111944705B
Application number: CN202010908690.6A
Authority: CN
Inventors: 程仕伟; 张萍; 冯志彬; 葛宜和; 毛志远; 姜南; 缪静
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN111944705A

Abstract

本发明公开一种球毛壳菌的固态发酵方法、制备的菌剂及其应用，其采用球毛壳菌HY1进行菌种活化，再进行固体发酵，固体发酵终止后将固体培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，粉碎得农业复合生防菌剂，该菌剂用于农业根结线虫和土源植物病原菌防治中。本发明的工艺操作简单，参数容易控制，经固态发酵生产的复合生防菌剂具有高杀根结线虫及土源植物病原菌的能力，应用前景广阔，经济社会效益显著。

Description

一种球毛壳菌的固态发酵方法、制备的菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种球毛壳菌的固态发酵方法，及其制备的菌剂在农业根结线虫和土源植物病原菌防治中应用，属于微生物农药技术领域。

背景技术

在现代的农业规模化、集约化栽培种植过程中，由于作物连坐、施肥不当等原因，导致土传病原菌侵害经常发生，病原体在条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物，侵染病原包括真菌、细菌、放线菌、线虫等，给农业生产造成巨大损失，如腐霉菌引起苗腐和猝倒病、丝核菌引起苗立枯病，象尖孢镰和黄萎轮枝孢等引起作物萎蔫、枯死等。

除土源病原微生物的侵害外，植物根结线虫对农作物的危害也越来越严重，其危害仅次于真菌，超过细菌和病毒的危害，是农作物种植的四大病源生物之一，每年给全球的农业生产造成损失超过千亿美元，一旦区域性爆发就造成农作物减产甚至绝产，其危害防治刻不容缓。

土传病害防治主要是抑制根围系统病原物活动从而保护根系，化学农药施加虽有防治效果但存在农药残留问题，影响农产品质量安全。此外，采用栽培技术革新、培育抗性作物品种也具有一定的防治作用，但指标不治本，土源病害防治依然严峻。近年来，生物防治用于土源病害防治越来越受青睐，其对病原微生物和根结线虫具有拮抗、抑制和杀灭效果，还能增加土壤有益微生物多样性，且有土壤改良效果，农作物产品质量安全性高，适应农业可持续发展的需求。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一种球毛壳菌的固态发酵方法，制备能拮抗农业根结线虫和土源病原微生物的复合生防菌剂，可作为农业投入品用于减少农业病虫害的发生。

本发明的技术方案如下：

一种球毛壳菌的固态发酵方法，其特征在于包括如下具体步骤：

（1）菌种：球毛壳菌Chaetomiumglobosum，保藏名称为：HY1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10609；

（2）菌种活化：取试管斜面保存的球毛壳菌HY1菌种接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基按质量百分数计为：1～1.5%可溶性淀粉、0.4～0.6%酵母粉、0.2～0.4%玉米浆、0.1～0.2%硫酸锰、0.1～0.2%氯化镁，pH 7.5；

（3）固体发酵：灭菌后的固态发酵培养基，按照8～10%（v/v）的接种量接入活化种子液，机械搅拌将活化菌种与固态培养基混合均匀后，在28～32℃下静态培养，每间隔6-8h通入无菌空气1次，通气量按照1L培养基通3L无菌空气计；培养2～3d后至培养基料表层长满菌丝；再次经过机械搅拌将培养基料捣碎混匀，在30～32℃下静态培养，每间隔6-8 h通入无菌空气1次，继续培养4-5d后至培养基上长满浅黑色孢子后终止发酵；所述的固态发酵培养基按质量百分数计为：15～20%干啤酒糟、10～15%麸皮、0.5～1%甘油、0.8～1.2%胰蛋白胨、0.3～0.6% Na₂HPO₄、0.3～0.6% K₂HPO₄、1～1.2%几丁质粉末，料水比为1:0.82～1:1.5，pH自然；固体发酵培养基经搅拌均匀，在115～118℃下灭菌20～25min，冷却至室温即可使用。

所述的固态发酵方法制备的农业复合生防菌剂在农业根结线虫和土源植物病原菌防治中应用。本发明的有益效果是：

（1）抗菌谱广

本发明涉及的是球毛壳菌HY1的抗菌谱广，研究表明其对多种植物病原菌均有强抑制效果，对苹果炭疽病原真菌的抑制率100%。

（2）酶活力高

球毛壳菌HY1产多种代谢酶，尤其是几丁质酶活力高，能催化几丁质为几丁寡糖，提高作物抗病能力，并有营养效果。

（3）培养方法

球毛壳菌HY1的固态培养方法简单，对营养需求不高，方便易操作，过程易操控，活性孢子数量大，适合规模化生产。

（4）生产基料

本发明以工农业有机废弃物如啤酒糟、麸皮为发酵基料，固态发酵的原料成本降低，产品的市场竞争力显著。

（5）效果显著

球毛壳菌HY1固态发酵制备的农业复合生防菌剂，对土源植物病原菌以及对根结线虫为代表的病虫害拮抗效果显著，有限减少作物病害发生，丰产增收效果明显。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

菌种：球毛壳菌Chaetomiumglobosum，保藏名称为：HY1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10609；

实施例1：球毛壳菌HY1的浅盘固态培养

自试管斜面保存的球毛壳菌HY1菌种用接种环挑取一环，接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养26 h至菌体浑浊，制得活化种子液。活化培养基按质量百分数为：1.5%可溶性淀粉、0.6%酵母粉、0.4%玉米浆、0.1%硫酸锰、0.2%氯化镁，pH 7.5。

按照8%（v/v）的接种量将活化种子液接入灭菌的固体发酵培养基，活化菌种与固态培养基混合均匀后，置于无菌的浅盘培养器中，在28℃下静态培养，每间隔8 h通入无菌空气1次，通气量按照1L培养基通3L无菌空气计；培养3d后至培养基料表层长满菌丝；再次经过机械搅拌将培养基料捣碎混匀，在30℃下静态培养，每间隔6 h通入无菌空气1次，继续培养5 d后至培养基上长满浅黑色孢子后终止发酵。发酵终止后将固体培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，粉碎机粉碎即得农业复合生防菌剂。经测定，制备的农业根结线虫复合生防菌剂中，球毛壳菌HY1的活菌总数为2.12×10⁹ cfu/g。

所述固态发酵培养基按质量百分数为：15%干啤酒糟、10%麸皮、0.5%甘油、0.8%胰蛋白胨、0.3% Na₂HPO₄、0.6% K₂HPO₄、1%几丁质粉末，料水比为1:1， pH自然；固体发酵培养基经翻转搅拌均匀，116℃下灭菌24min，冷却至室温即可使用。

实施例2：球毛壳菌HY1的发酵罐固态培养

自试管斜面保存的球毛壳菌HY1菌种用接种环挑取一环，接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液。活化培养基按质量百分数为：1%可溶性淀粉，0.4%酵母粉，0.2%玉米浆，0.2%硫酸锰，0.1%氯化镁， pH 7.5。

固态发酵培养基以65%的装液量装入50 L固体发酵罐，118℃下原位灭菌20min，冷却至室温备用。所述固态发酵培养基按质量百分数为：20%干啤酒糟、15%麸皮、1%甘油、1.2%胰蛋白胨、0.6% Na₂HPO₄、 0.3% K₂HPO₄、1%几丁质粉末,料水比为1:1.5， pH自然。

按照10%（v/v）的接种量接入活化的种子培养液，启动机械搅拌将活化菌种与固态培养基混合均匀后，在30℃下静态培养，每间隔7 h通入无菌空气1次，通气量按照1L培养基通3L无菌空气计；培养2.5 d后至培养基料表层长满菌丝；再次经过机械搅拌将培养基料捣碎混匀，在32℃下静态培养，每间隔7h通入无菌空气1次，继续培养4.5 d后至培养基上长满浅黑色孢子后终止发酵。发酵终止后将固体培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，粉碎机粉碎即得农业复合生防菌剂。

发酵终止后将固体培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，粉碎机粉碎即得农业复合生防菌剂。经测定，制备的农业根结线虫复合生防菌剂中，球毛壳菌HY1的活菌总数为6.97×10¹⁰ cfu/g。

实施例3：球毛壳菌HY1的通风发酵池固态培养

自试管斜面保存的球毛壳菌HY1菌种用接种环挑取一环，接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液。活化培养基按质量百分数为：1.2%可溶性淀粉，0.5%酵母粉，0.3%玉米浆，0.15%硫酸锰，0.15%氯化镁， pH 7.5。

固态发酵培养基以75%的装液量装入1m³固体发酵池中，115℃下原位灭菌25min，冷却至室温备用。所述固态发酵培养基按质量百分数为：18%干啤酒糟、12%麸皮、0.8%甘油，1%胰蛋白胨、0.5% Na₂HPO₄、0.5% K₂HPO₄、1.2%几丁质粉末，料水比为1:0.82， pH自然。

灭菌后的固态发酵培养基，按照9%（v/v）的接种量接入活化的种子培养液，机械搅拌将活化菌种与固态培养基混合均匀后，在32℃下静态培养，每间隔6h通入无菌空气1次，通气量按照1L培养基通3L无菌空气计；培养2d后至培养基料表层长满菌丝；再次经过机械搅拌将培养基料捣碎混匀，在31℃下静态培养，每间隔8 h通入无菌空气1次，继续培养4 d后至培养基上长满浅黑色孢子后终止发酵。

发酵终止后将固体培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，粉碎机粉碎即得农业复合生防菌剂。经测定，制备的农业根结线虫复合生防菌剂中，球毛壳菌HY1的活菌总数为4.17×10¹⁰ cfu/g。

实施例4：制备的农业生防菌剂施用效果评价

蛇龙珠葡萄种植试验：以实施例1中制备的农业复合生防菌剂为实验组，采用根穴施加方式，年度以两个月为一间隔施肥1次，每次每亩施加30公斤。设立空白对照组，为未发酵的灭菌培养基并事先经干燥处理。实验组与对照组相比，亩增产16.42%，根结线虫病害未见发生，土源病原菌减少87.38%，根际土样的微生物丰度增加31.55%。

番茄栽培种植试验：以实施例2中制备的农业复合生防菌剂为实验组，采用根穴施加方式，年度以1个月为一间隔施肥1次，每次每亩施加20公斤。设立空白对照组，为未发酵的灭菌培养基并事先经干燥处理。实验组与对照组相比，亩增产11.3%，根结线虫病害减少94.56%，土源病原菌减少83.56%，根际土样的微生物丰度增加26.39%。

苦瓜栽培种植试验：以实施例3中制备的农业复合生防菌剂为实验组，采用根穴施加方式，年度以1个月为一间隔施肥1次，每次每亩施加20公斤。设立空白对照组，为未发酵的灭菌培养基并经干燥处理。实验组与对照组相比，亩增产13.75%，根结线虫病害减少92.27%，土源病原菌减少81.2%，根际土样的微生物丰度增加33.79%。

所述的亩增产采用亩均产量统计法，根结线虫病害检测采用番茄根际样品的显微镜镜检观察计数法。根际土样的微生物多样性采用平板涂布的活菌计数法，其中细菌计数采用LB培养基，放线菌计数采用高氏1号培养基（每300 mL培养基中加入3％重铬酸钾1毫升，用以抑制细菌生长），真菌计数采用孟加拉红选择性培养基（添加1%氯霉素抑制细菌生长）。

综上所述，采用本发明制备的农业复合生防菌剂对丰产增收效果显著，固态发酵方法简单，对操作人员要求不高，适合规模化生产，在作为农业投入品用于植物土源病害防治方面，具有广阔的应用前景。

Claims

1.球毛壳菌（Chaetomium globosum）HY1在农业根结线虫和土源植物病原菌防治中的应用，其特征在于球毛壳菌（Chaetomium globosum）HY1的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10609。