CN111235054A - 一种盐土改良菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种盐土改良菌剂及其制备方法，其制备方法包括如下步骤：S1、菌剂基质原料准备：将基质原料在121℃下灭菌20min，冷却备用；S2、制备种子液：将‑20℃保存的CC09菌株接种于装有50mL LB培养基的三角瓶中，于37℃、120r/min培养至OD600＝1.2；S3、发酵培养：按1％的接种量接种种子液于400mL改良LB培养基中，于30℃、120r/min培养48h；S4、菌剂制备：按1﹕4的比例混合菌液和基质，制备成含不同基质的菌剂；改良菌剂可由上述制备方法制备得到。本发明所制备的改良菌剂应用于盐土，可有效提高土壤有机质、全磷、碱解氮、速效磷、速效钾等营养指标，显著提高土壤蔗糖酶和尿酶活性，调节土壤微生物群落，促进植物的生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生物肥料技术领域，具体是一种盐土改良菌剂及其制备方法。
背景技术
盐土是指含有大量可溶性盐类且对植物生长造成抑制或危害的土壤。其中以 氯化钠(食盐)和硫酸钠(芒硝)为主。我国有近200万公顷的沿海滩涂和4000万 公顷的盐碱荒地,尚未得到充分利用，发展盐土农业对保障我国粮食安全战略具 有重要的意义。然而，由于高盐对植物的危害，盐土种植作物的产量普遍较低。 改良盐土、促进植物生长，是解决我国地少人多矛盾的重要途径之一。
目前已有多种盐土改良技术，包括水利工程法，振动深松技术，种稻法以及 利用微生物制剂的改良技术等，其中，利用微生物制剂改良盐土被认为是最有效 且环境友好的可行措施之一，应用前景广阔，如以多粘类芽孢杆菌为主要成分的 微生物改良剂已申请了中国发明专利(公开号：CN108863646A)。
然而，盐土生态环境特殊，目前用于盐土改良的微生物制剂产品还十分有限， 且功能单一，缺乏兼顾促生与抗病双重作用的微生物改良制剂，研发兼具促生与 抗病双重作用的盐土改良微生物制剂仍是现今乃至今后相对长一段时期内科研 工作关注的课题，开发拥有自主知识产权的盐土改良微生物制剂具有较强的国际 竞争能力。
发明内容
本发明的目的在于，针对盐土不利于植物生长的突出问题，提供一种能够改 善盐土品质、促进植物生长的盐土改良菌剂。
为实现上述目的，本发明提供了一种盐土改良菌剂的制备方法，包括如下步 骤：
S1、菌剂基质原料准备：将基质原料在121℃下灭菌20min，冷却备用；
S2、制备种子液：将-20℃保存的CC09菌株接种于装有50mL LB培养基的 三角瓶中，于37℃、120r/min培养至OD600＝1.2；
S3、发酵培养：按1％的接种量接种种子液于400mL改良LB培养基中，于 30℃、120r/min培养48h；
S4、菌剂制备：按1:4的比例混合发酵液和基质，制备成含不同基质的菌剂。
优选的，上述菌剂基质原料为米草渣和或腐殖酸的混合原料，配比为1：1。
优选的，步骤S3中，改良LB培养基的成分包括酵母粉3.75g、胰蛋白胨 11.25g、NaCl 1g、可溶性淀粉5g、蒸馏水1000mL，其pH值为6.5，并于121℃ 灭菌30min。
优选的，在步骤S3中，取培养后的发酵液用稀释倒平板法测得菌体数量大 于1×109CFU/mL。
优选的，CC09菌株为一株植物内生细菌—芽孢杆菌CC09菌株，该菌株分离 自樟树茎干。
一种盐土改良菌剂，该菌剂为包括发酵液1份和基质4份的混合物，所述发 酵液的菌种为芽孢杆菌CC09菌株；所述基质为米草渣与腐殖酸的等比例混合物。 优选的，所述发酵液中CC09菌株数量大于1×109CFU/mL。
优选的，该发酵液为根据上述的制备方法制备得到，该菌剂应用于盐土时， 按菌剂-盐土质量比1:25-1:15的比例混合。
本发明技术方案，具有如下优点：本发明通过芽孢杆菌CC09菌株的培养并 与米草渣-腐殖酸基质原料的混合制备了用于盐土改良的菌剂，能够显著改良土 壤的营养指标、提高土壤酶活，调节土壤微生物群落组成，对植物具有明显的促 生长作用；且菌剂对环境安全。
具体实施方式
本发明实施例中，一种盐土改良菌剂的制备方法，制备技术方案执行国标GB20287-2006的标准：
本发明实施例采用的菌种为芽孢杆菌CC09菌株，该芽孢杆菌CC09为本实验 室分离获得为樟树内生细菌，对多种植物病原菌有拮抗活性。
菌剂的基质原料为1:1的米草渣-腐殖酸混合原料。
芽孢杆菌CC09菌株的分离与鉴定见本申请人之前申请并且授权公开的发明 专利(公告号：CN 102199563 B)中记载的相关内容。
盐土改良菌剂的具体制备步骤如下：
S1、菌剂基质原料准备：将基质原料在在121℃下灭菌20min，冷却备用， 其中，米草渣是秋季收获自盐城大丰的米草地上部分经提取“生物矿质液”后干 燥粉碎后的产物，原料由东台市志东食用菌专业合作社提供；腐植酸为市售商品， 由北京中龙创科技有限公司提供。
S2、制备种子液：将-20℃保存的CC09菌株接种于装有50mL LB培养基的三角瓶中，于37℃、120r/min培养至OD600＝1.2，CC09菌株为一株植物内生细菌—芽孢杆菌CC09菌 株(Bacillus sp.CC09)，该菌株分离自樟树茎干，已于2011年3月15日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏号为CGMCC No.4669；
S3、发酵培养：按1％的接种量接种种子液于400m L改良LB培养基中，于 30℃、120r/min培养48h，取菌液用稀释倒平板法测得菌体浓度为1.7×109 CFU/mL，对于改良LB培养基，其制备原料包括酵母粉3.75g、胰蛋白胨11.25g、 NaCl 1g、可溶性淀粉5g、蒸馏水1000m L，其pH值6.5，并于121℃灭菌 30min；
S4、菌剂制备：按1:4的比例混合菌液和基质，制备成含不同基质的菌剂。
1.菌剂对盐土栽培番茄生长及土壤的影响的试验方法
(1)试验用土：基础土壤采集自江苏盐城大丰盐城师范学院实验基地，由 谱尼测试公司检测的营养成分含量见表1；盐土是在基础土壤中添加了氯化钠， 将基础土壤调整为含盐量为0.2％的盐土。
表1菌剂盆栽试验用土养分含量
(2)盆栽装土及施用菌剂：在试验用盆(上口径12cm，底部直径8cm，高 度10.5cm)中装土样500g，加入菌剂25g，与土壤混匀，每种菌剂装3个重复 盆。
(3)实验处理组：
CK：300g土。
MF：300g土里添加15g灭菌的米草渣腐植酸。
MFJ：300g土里添加15g米草渣腐植酸菌剂。
(4)生长指标：出苗率、株长、株重。
(5)土质检测：采集不同处理(CK、MF、MFJ)的盆栽番茄土样，送至中国 科学院红壤生态实验站测定土壤pH、盐度、总氮、总磷、总钾及碱解氮、速效 磷、速效钾等指标。
(6)酶活检测：蔗糖酶(SA)采用3,5-二硝基水杨酸比色法、纤维素酶(CEA) 活性采用硝基水杨酸比色法测定、蛋白酶(PRA)活性采用茚三酮比色法测定、 土壤脲酶(UA)活性采用苯酚钠—次氯酸钠比色法测定、土壤酸性磷酸酶(APA) 活性采用磷酸苯二钠法。
(7)土壤微生物分析：土样为不同处理(CK、MF、MFJ)的盆栽番茄土壤； 检测公司为诺禾致源科技服务有限公司；检测方法为DNA高通量测序分析。
2.菌剂对盐土栽培番茄生长及土壤的影响的试验结果
(1)菌剂对番茄生长的影响
与不施用基质和菌剂的空白对照组(CK)相比，米草渣腐殖酸处理组(MF) 的鲜重有显著提高；与CK和MF相比较，米草渣腐殖酸菌剂处理组(MFJ)在出 芽率、株高及鲜重都有显著性提高(表2)。结果表明米草渣腐殖酸基质及米草 渣腐殖酸菌剂对盐碱地番茄具有促生作用，且菌剂对番茄的促生作用更为显著。
表2米草渣腐殖酸菌剂对番茄出苗率及生长的影响
注：符号a,b代表不同处理组之间达到显著性差异(p<0.05)
(2)菌剂对土质的影响
在空白对照(CK)、米草渣腐植酸(MF)、米草渣腐植酸菌剂(MFJ)这三 个处理组中，有机质、全磷、碱解氮、速效磷、速效钾这5个指标存在显著性差 异(表3)。与CK相比，在MF、MFJ处理组中，有基质、全磷、碱解氮的含量 显著提高。米草渣腐植酸菌剂中的速效磷含量显著高于CK及MF组。MFJ中的速 效钾含量显著高于CK。
表3米草渣腐殖酸菌剂对盆栽番茄土质的影响
注：符号a,b代表不同处理组之间达到显著性差异(p<0.05)
(3)菌剂对土壤酶活的影响
与空白对照组(CK)相比，米草渣腐植酸(MF)和米草渣腐殖酸菌剂(MFJ) 处理组土壤的蔗糖酶和脲酶活性显著提高，而且，MFJ较MF处理组这两种酶活 性更高(表4)。
表4米草渣腐殖酸菌剂对番茄土壤酶活的影响
(4)菌剂对番茄土壤微生物组成的影响
土壤微生物高通量测序分析结果显示，与空白对照(CK)相比，米草渣腐殖 酸(MF)和米草渣腐殖酸菌剂(MFJ)处理组均未改变土壤细菌的多样性和丰富 度(表5)，但能够提高对植物生长有潜在促进作用的德沃斯氏菌属(Devosia)、 鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)的相对丰度(表6)。MFJ处理组土壤真菌的丰 富度和多样性显著提高(表7)，其中，毛壳菌属(Chaetomium)等促进植物促 生长的真菌丰度显著提高，而新赤壳属(Neocosmospora)、镰刀菌属(Fusarium)、 赤霉菌属(Gibberella)等植物病原真菌的相对丰度显著降低(表8)。
表5土壤样品的细菌多样性指数分析
表6米草渣腐殖酸菌剂对番茄土壤优势细菌组成的影响
表7土壤样品的真菌多样性指数分析
表8米草渣腐殖酸菌剂对番茄土壤优势真菌组成的影响
(5)菌剂环境安全性检测
检测内容：米草渣菌剂和米草渣腐殖酸菌剂对溞类和鱼类的毒性检测。
检测单位：生态环境部南京环境科学研究所。
检测方法：根据《微生物农药环境风险评价试验准则第5部分：溞类毒性试验》(NY/T 3152.5-2017)的方法，本项目采用半静态法(换水频率为6d)测定了2亿CFU/克米草渣腐植酸菌剂对大型溞(Daphnia magna Straus)的毒性。
最大危害暴露量试验设置浓度为6.0×106CFU/mL的供试物处理组，并设空白对照组和 灭活对照组。每组设置4个平行，每个平行5只供试溞。试验开始后持续观察21d、记录每 个容器中试验用溞活动受抑制数。
根据《微生物农药环境风险评价试验准则第4部分：鱼类毒性试验》(NY/T 3152.4-2017) 的方法，本项目采用半静态法(换水频率为10d)测定了2亿CFU/克米草渣腐植酸菌剂对 斑马鱼(Brachydonio rerio)的毒性。
最大危害暴露量试验：设置处理组浓度为6.0×106单位/mL，同时设空白对照组和灭活 对照组，每组设置4个平行，每个平行10尾鱼。
检测结果：对米草渣腐植酸菌剂处理组、空白对照组和灭活对照组中的大型溞和斑马 鱼的逐天观察结果显示，21d内，大型溞无明显中毒症状和死亡，EC50>6.0×106CFU/mL； 30d内，斑马鱼无一死亡，LC50>6.0×106单位/mL。这些结果表明，本发明菌剂环境安全。
上述的实施例中，米草渣腐殖酸菌剂可改良土壤三大营养的营养指标，对植物具有明 显的促生长的作用，对土壤的酶活性和微生物群落组成具有良好的改良效果，同时检测表明， 本发明的菌剂毒性低，对环境友好。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还 包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种盐土改良菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、菌剂基质原料准备：将基质原料米草渣和腐殖酸在121℃下灭菌20min，冷却备用；
S2、制备种子液：将-20℃保存的CC09菌株接种于装有50mL LB培养基的三角瓶中，
于37℃、120r/min培养至OD600＝1.2；
S3、发酵培养：按1％的接种量接种种子液于400m L的改良LB培养基中，于30℃、120r/min培养48h；
S4、菌剂制备：按1:4的比例混合发酵液和基质，制备成菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种盐土改良菌剂的制备方法，其特征在于，基质原料的米草渣-腐殖酸配比为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种盐土改良菌剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中，改良LB培养基的成分包括酵母粉3.75g、胰蛋白胨11.25g、NaCl 1g、可溶性淀粉5g、蒸馏水1000mL，其pH值为6.5，并于121℃灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的一种盐土改良菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，采用稀释倒平板法测得发酵液中CC09菌株的数量大于1×109CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的一种盐土改良菌剂的制备方法，其特征在于，CC09菌株为一株植物内生细菌—芽孢杆菌CC09菌株，该菌株分离自樟树茎干。
6.一种盐土改良菌剂，其特征在于，该菌剂为包括发酵液1份和基质4份的混合物，所述发酵液的菌种为CC09菌株，所述基质为1﹕1的米草渣和腐殖酸混合物。
7.根据权利要求7所述的一种盐土改良菌剂，其特征在于，所述发酵液中CC09菌株的数量为1×109CFU/mL。
8.根据权利要求8所述的一种盐土改良菌剂，其特征在于，该菌剂可根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到，该菌剂应用于盐土时，按菌剂-盐土质量比1:25-1:15的比例混合。
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