CN107964523B - 甲基营养型芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用，甲基营养型芽孢杆菌保藏登记号为GDMCC No.60242，本申请的甲基营养型芽孢杆菌对甘薯两大土传病甘薯黑斑病和甘薯根腐病的病原菌具有显著的拮抗作用。本申请制备的肥料可以显著改善甘薯因黑斑病和根腐病造成的减产问题，并且本申请的有机肥以腐熟有机质作为发酵培养基，既能为甘薯生长提供充足的养分，减少化学肥料的使用，同时腐熟有机质又能为功能菌种在田间的定殖营造良好的环境。

Description

甲基营养型芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
甘薯又名甜薯，旋花科薯蓣属，富含淀粉、糖类、蛋白质、维生素、纤维素以及各种氨基酸，兼具丰富营养和特殊的保健功效，又由于其适应性强、用途广泛的特点，甘薯在世界范围内种植历史悠久，种植面积广泛，被联合国粮农组织（FAO）认为是21世纪解决粮食短缺和能源问题的重要农作物之一。我国甘薯占世界甘薯种植面积的45.0%，年平均产量约1.0亿吨，占世界甘薯总产量的75.0%，其总产量在国内粮食作物中位居第四，仅次于水稻、小麦和玉米。
甘薯其块根生长于地下，极易受到甘薯土传病大面积的危害，这些病害不仅导致甘薯产量大幅减少，还严重降低了甘薯的品质及贮藏性。目前，影响我国甘薯产量的两大土传病害分别为甘薯黑斑病和甘薯根腐病。甘薯黑斑病又称黑疤病，是由子囊菌长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata Ellis.et Halsted）侵染所致，在各甘薯产区均有发生，其不仅在大田为害严重，在育苗期和贮藏期还会导致烂苗床和烂窖，减产严重。薯块受害，多在伤口（虫口或自然伤口等）处出现圆形、椭圆形或不规则形病斑，病斑中间凹陷，上生有黑色霉状物或刺毛状物，病部组织坚硬，薯肉呈墨绿色，味苦，不能食用。甘薯根腐病别名茄类镰孢甘薯专化型，属真菌半知菌，有性时代为子囊菌红球赤壳菌（Nectria haematococcaBerK.et Br），发病主要集中在大田生长期，病情较轻的植株结薯少而小，薯块品质低劣，严重的，地下根茎大部或全部变黑腐烂，整株枯死，减产严重。
长期以来，对于甘薯黑斑病和根腐病的防治主要是采用化学农药等化学防治措施，化学药物的长期使用不仅会使病原菌产生一定的耐药性，造成防治效果越来越差，而且化学农药的过量使用会严重破坏土壤的微生态环境，造成环境污染的同时也降低了甘薯的品质和营养价值，因此，采用生物防治技术来解决甘薯生产中常见的病害问题将越来越受到人们的青睐。
随着生物防治技术的快速发展，人们发现并筛选出了多种能够拮抗病原微生物的菌种，芽孢杆菌由于其具有能够抑制多种植物病原菌、无毒无害、在自然界尤其是土壤中分布广泛的特性，被作为生物防治中的重要微生物菌群受到深入广泛的研究。其中，甲基营养型芽孢杆菌作为生防菌种已经被应用于多种经济作物的病害防治中，但其应用于防治甘薯两大病害黑斑病和根腐病的研究还没有。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种甲基营养型芽孢杆菌，保藏号GDMCC No.60242;其命名为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3；保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心；保藏时间为2017年9月13日。保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本申请还公开了一种上述的甲基营养型芽孢杆菌在防治甘薯黑斑病或/和根腐病方面的应用。
本申请还公开了一种甲基营养型芽孢杆菌在肥料中的应用。
本申请还公开了一种甲基营养型芽孢杆菌制备有机肥的方法，所述有机肥中甲基营养型芽孢杆菌的菌数大于等于1亿cfu/g。
作为上述技术方案的改进，有机肥由腐熟有机质经甲基营养型芽孢杆菌发酵制得。
作为上述技术方案的改进，所述腐熟有机质为畜禽粪便和秸秆粉共同腐熟后的产物。
作为上述技术方案的改进，甲基营养型芽孢杆菌制备有机肥的方法包括以下步骤，
步骤一：将畜禽粪便和秸秆粉按质量比70%-85%：15%-30%混合均匀后腐熟得到腐熟有机质；
步骤二：将培养好的甲基营养型芽孢杆菌菌液按腐熟有机质质量的0.5%-1.0%稀释后均匀接入步骤一中腐熟有机质中培养发酵，接种后腐熟有机质中水分为40%-45%，发酵温度为37-45℃，发酵时间为72小时；发酵完成后，检测甲基营养型芽孢杆菌活菌数大于等于1亿cfu/g；
步骤三：将步骤二中发酵好的物料干燥至水分15%以下，粉碎制粒。
本申请公开了一种上述方法制得的有机肥在防控甘薯黑斑病上的应用。
本发明的有益效果是：本申请的甲基营养型芽孢杆菌对甘薯两大土传病甘薯黑斑病和甘薯根腐病的病原菌具有显著的拮抗作用。本申请制备的肥料可以显著改善甘薯因黑斑病和根腐病造成的减产问题，并且本申请的有机肥以腐熟有机质作为发酵培养基，既能为甘薯生长提供充足的养分，减少化学肥料的使用，同时腐熟有机质又能为功能菌种在田间的定殖营造良好的环境。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
甲基营养型芽孢杆菌对甘薯黑斑病和根腐病病原菌的抑菌防治实验
将培养好的甲基营养型芽孢杆菌菌液8000 r/min 离心25分钟后收集上清液，用0.22μm无菌微孔滤膜过滤后滤液于4 ℃冰箱保存备用。无菌条件下，将灭菌后冷却至50 ℃左右的PDA培养基与上述滤液10:1混匀倒入直径为9cm的平板中冷却，分别于平板中央接种直径为0.5cm的甘薯黑斑病和根腐病病原菌菌盘，每处理三个重复，以不含滤液的PDA平板接种病原菌为对照，30 ℃培养5天后测定菌落直径，计算抑菌率。
菌落直径测定方法：采用十字交叉法测量两次菌落直径取平均值。
抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径x100
实验结果与分析如表1所示：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：（上表数据均为三次重复所取平均值）
由表1可以得出，甲基营养型芽孢杆菌对甘薯黑斑病和根腐病病原菌具有较强的抑制效果。
实施例2
一、甲基营养型芽孢杆菌制备有机肥的方法包括以下步骤，
步骤一：将畜禽粪便和秸秆粉按质量比70%-85%：15%-30%混合均匀后腐熟得到腐熟有机质；
步骤二：将培养好的甲基营养型芽孢杆菌菌液按腐熟有机质质量的0.5%-1.0%稀释后均匀接入步骤一中腐熟有机质中培养发酵，接种后腐熟有机质中水分为40%-45%，发酵温度为37-45℃，发酵时间为72小时；发酵完成后，检测甲基营养型芽孢杆菌活菌数大于等于1亿cfu/g；
步骤三：将步骤二中发酵好的物料干燥至水分15%以下，粉碎制粒。
二、甲基营养型芽孢杆菌在甘薯根际土壤的定殖试验
本实验分为如下A、B、C、D四个组，每组三个重复
表2
Figure 634751DEST_PATH_IMAGE002
① 抗性菌株筛选
将甲基营养型芽孢杆菌在NB培养基平板上划线培养，挑取单菌落转入含利福平5μg/mL的NB液体培养基中，于30 ℃、200 r/min 条件下培养24h，然后在含有利福平5 μg/mL的NB培养基平板上划线培养，然后挑取单菌落转入下一浓度梯度中，依次经过含利福平10、20、50、100、150、300 μg/mL 的NB培养基的诱导，直至筛选出在含有300 μg/mL 利福平的NB培养基平板上能够稳定生长且菌落形态与原菌株保持不变的菌株。
②抗性菌株菌液制备
将用利福平（300 μg/mL）标记过的甲基营养型芽孢杆菌接种于NB液体培养基中，于30 ℃、200 r/min 条件下培养24h，使菌液中菌数达到108 cfu/ml 水平。
③土壤接菌
将A、B、C、D四组中描述的土壤各1千克分别放置于相同大小的花盆中，每盆中栽入一颗生长状况良好且大小近似的无病薯苗，在每盆薯苗根部土壤接入10mL标记过的甲基营养型芽孢杆菌菌液，每组三个重复。
④取样检菌
接菌后每隔7天分离一次薯苗根际土壤中的细菌，直至第28天，菌数采用稀释涂布平板法计数，稀释梯度选择10-3、10-4、10-5、10-6，平板为含有300 μg/mL 利福平的NB培养基平板。
⑤实验结果
表3 7-28天各组甲基营养型芽孢杆菌在薯苗根际土壤定殖结果
Figure 158136DEST_PATH_IMAGE004
上述实验结果表明，28天后，甲基营养型芽孢杆菌在薯苗根际土壤定殖数量基本可以维持在104以上，说明甲基营养型芽孢杆菌在甘薯根际具有较强的定殖能力。相比之下，土壤中加入腐熟有机质的A组和C组甲基营养型芽孢杆菌的定殖数量要明显高于土壤中不加腐熟有机质的B组和D组，说明腐熟有机质可为甲基营养型芽孢杆菌在土壤中的定殖提供丰富的营养条件。
实施例3
本申请制备的有机肥对甘薯黑斑病的防控应用效果
本实验选用大小长势一致且健康的高剪脱毒薯苗，试验分为三个处理：①空白对照组：自然土壤，薯苗用无菌清水浸根30分钟；②病原菌对照组：自然土壤，薯苗用浓度为1x107cfu/ml的甘薯黑斑病病原菌菌液浸根30分钟；③生物有机肥处理组：自然土壤和一定量的本发明生物有机肥混匀，薯苗用浓度为1x107cfu/ml的甘薯黑斑病病原菌菌液浸根30分钟。每个处理30株薯苗，实验期间，各处理薯苗管理措施一致，每天观察记录各处理的发病情况，直到病原菌对照组薯苗发病率达到75%以上时，拔苗统计计算相对防效。根据观察记录，空白对照组没有发病现象，14天时病原菌对照组开始发病，19天时生物有机肥处理组开始发病，32天时病原菌对照组薯苗发病率达到75%以上，具体试验结果见表4。
病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100
相对防效（%）=（对照病情指数—处理病情指数）/ 对照病情指数×100
表4 本申请制备的有机肥对甘薯黑斑病的防控效果
Figure DEST_PATH_IMAGE005
从上述试验结果可以看出，本发明的生物有机肥能对甘薯黑斑病起到有效的防控效果。
实施例4
本申请制备的有机肥对甘薯根腐病的防控应用
本实验选用大小长势一致且健康的高剪脱毒薯苗，试验分为三个处理：①空白对照组：自然土壤，薯苗用无菌清水浸根30分钟；②病原菌对照组：自然土壤，薯苗用浓度为1x107cfu/ml的甘薯根腐病病原菌菌液浸根30分钟；③生物有机肥处理组：自然土壤和一定量的本发明生物有机肥混匀，薯苗用浓度为1x107cfu/ml的甘薯根腐病病原菌菌液浸根30分钟。每个处理30株薯苗，实验期间，各处理薯苗管理措施一致，每天观察记录各处理的发病情况，直到病原菌对照组薯苗发病率达到75%以上时，拔苗统计计算相对防效。根据观察记录，空白对照组没有发病现象，12天时病原菌对照组开始发病，15天时生物有机肥处理组开始发病，28天时病原菌对照组薯苗发病率达到75%以上，具体试验结果见表5。
表5 本发明所述生物有机肥对甘薯根腐病的防控效果
Figure 712614DEST_PATH_IMAGE006
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3在防治甘薯黑斑病或/和根腐病的应用，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌保藏号GDMCC No.60242；保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心；保藏时间为2017年9月13日。
2.一种如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌在制备防治甘薯黑斑病或/和根腐病有机肥料中的应用。
3.一种如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌制备防治甘薯黑斑病或/和根腐病有机肥的方法，其特征在于：所述有机肥中甲基营养型芽孢杆菌的菌数大于等于1亿cfu/g。
4.根据权利要求3所述制备防治甘薯黑斑病或/和根腐病有机肥的方法，其特征在于：有机肥由腐熟有机质经甲基营养型芽孢杆菌发酵制得。
5.根据权利要求4所述制备防治甘薯黑斑病或/和根腐病有机肥的方法，其特征在于：所述腐熟有机质为畜禽粪便和秸秆粉共同腐熟后的产物。
6.根据权利要求3-5任一项所述制备防治甘薯黑斑病或/和根腐病有机肥的方法，其特征在于：
步骤一：将畜禽粪便和秸秆粉按质量比70%-85%：15%-30%混合均匀后腐熟得到腐熟有机质；
步骤二：将培养好的甲基营养型芽孢杆菌菌液按腐熟有机质质量的0.5%-1.0%稀释后均匀接入步骤一中腐熟有机质中培养发酵，接种后腐熟有机质中水分为40%-45%，发酵温度为37-45℃，发酵时间为72小时；发酵完成后，检测甲基营养型芽孢杆菌活菌数大于等于1亿cfu/g；
步骤三：将步骤二中发酵好的物料干燥至水分15%以下，粉碎制粒。
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