CN114058556A - 复合微生物菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物菌剂的制备，特别是指一种复合微生物菌剂的制备方法。包括将解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵6～10小时制成发酵液，将胶冻样类芽孢杆菌接入发酵液内通气发酵，镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至35℃～37℃，在1～2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束等工艺步骤。本发明解决了现有技术存在的发酵周期长、容易染菌、发酵规模小等技术问题，具有发酵周期短、生产成本低、不易染菌且含菌量高等优点。

Description

复合微生物菌剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生物菌剂的制备，特别是指一种复合微生物菌剂的制备方法。
背景技术
微生物菌剂是一类含有特定活性微生物的肥料制品，微生物肥料种类繁多，功能各不相同，随着微生物菌剂产业的发展，复合微生物菌剂由于其具有功能更强、更全面，越来越受到用户的欢迎。
一般的，复合菌剂的制作均为两个或多个菌株单独纯种发酵，发酵完成后进行混合制成复合菌剂。此种方法需要至少两套发酵系统，生产周期长，容易造成交叉感染。
解淀粉芽孢杆菌HM9902是申请人2016年在定兴的山药试验田分离得到，其对重茬种植的山药真菌病害有很好的防效。申请人已于2016年8月8日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.12821。胶冻样类芽孢杆菌HM8841能分泌植物根际促生物质，并能将土壤中的矿质钾降解为可被作物利用的可溶性钾。此菌株已于2013年1月31日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7240。经对峙培养试验已证明二者无拮抗作用。
在发酵培养基的选择上解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌比较相似，碳源一般选择玉米粉、淀粉、蔗糖等物质，氮源一般选择玉米浆、豆饼粉、硫酸铵等物质。而麸皮是一种碳源、氮源兼具的发酵原料，且麸皮还含有大量微生物生长所需要的微量元素。红糖相对于蔗糖微量营养成分更丰富，经试验证明更有助于混菌发酵生物量的提高。
申请人检索的背景技术包括：
公开号为CN104402610B的专利文献中公开的玉米追肥专用复合微生物肥料，其中先按5％～10％的接种量将胶冻样芽孢杆菌XK的种子液在发酵罐中培养12～24h,然后再按5％～10％的接种量添加巨大芽孢杆菌C2的种子液，同时添加混合发酵产芽孢培养基在发酵罐中，进行混菌发酵培养24～48h，制得双菌株混合发酵菌液，混合发酵产芽孢培养基配方为：麸皮1.5％、豆粕1.5％、NaCl 0.5％、CaCL2 0.1％、CaCO3 0.02％、MnSO4·H2O0.02％、MgSO4·7H2O 0.02％，pH7.0～7.5。
将混合发酵菌液与灭菌的泥炭土按比例混合搅拌均匀，二者的比例为质量比1:1～2，吸附后得双菌株菌肥。
上述现有技术存在的主要问题是：
一是发酵规模小(只是实验室摇瓶的试验结果)，而从摇瓶发酵规模放大到发酵罐发酵培养并非简单的等比扩大，需反复试验调整培养基及工艺参数才能形成规模发酵工艺。
二是对比文件选用巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌两株肥效菌进行混菌发酵，仅具有较好的肥效。
三是对比文件采用先发酵种子液，而后混合一起发酵的方式，工艺周期长，生产成本高且容易染菌。
四是其制备的固体复合微生物肥料，肥料含菌量2亿/克，亩施50kg取得了很好的应用效果。
申请人未在现有技术中发现与本申请相同或相近似的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合微生物菌剂的制备方法，其生产工艺周期短，成本低且不易染菌，所制备的复合微生物菌剂含菌量高，具有较好的肥效及药效。
本发明的整体技术构思是：
复合微生物菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
A、将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵6～10小时制成发酵液；
B、将拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus，保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌接入步骤A中的发酵液内通气发酵；发酵初始温度30℃～32℃；
C、镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至35℃～37℃，在1～2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束；
步骤A中发酵培养基包括如下质量百分含量的原料：
麸皮1.5％～3.0％，红糖0.5％～1.0％，硫酸铵0.01％～0.03％，碳酸钙0.1％～0.3％，豆饼粉0.1％～0.5％，磷酸氢二钾0.01％～0.03％，余量为水，pH＝7.0；
发酵培养基在发酵罐中的装料系数60％～70％。
本发明的具体及技术构思还有：
为便于通气发酵中控制通风量，便于菌种生长以及形成终产物，优选的技术实现手段是，所述的步骤A通气发酵的通风量条件为通风比＝1：0.6。
所述的步骤B中通气发酵的条件为：7～12小时通风比1：1.2，12～24小时通风比为1：1.5，24小时～发酵结束通风比为1：1.2。
为便于配制培养基，优选的技术实现手段是，所述的发酵培养基采用如下步骤配制：
麸皮加水煮沸保持20～40分钟，过滤取滤液置于发酵罐，再依次加入制备发酵培养基的其他原料成分混匀，高温灭菌后将其降温至30℃～32℃。
为便于实现工业化生产，优选的技术方案是，还包括扩大培养步骤，即将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌，以及拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus、保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌分别制成克氏瓶种子。
更为优选的技术实现手段是，所述的解淀粉芽孢杆菌克氏瓶培养基选用BPY培养基；胶冻样类芽孢杆菌克氏瓶培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨0.1％～0.15％；葡萄糖0.1％～0.15％；酵母汁0.02％～0.07％；硫酸铵0.01％～0.02％；硫酸镁0.01％～0.02％；磷酸氢二钾0.005％～0.01％；碳酸钙0.05％～0.1％；余量为水；pH＝7.0。
优选的扩大培养的接种条件是，取生长丰满的解淀粉芽孢杆菌250mL克氏瓶种子1～2个，用无菌水洗下斜面孢子，压差接种法接入步骤A发酵罐内的发酵培养基中。
将生长丰满的胶冻样类芽孢杆菌250mL克氏瓶种子2～3个接入步骤A中的发酵液内。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明采用具有生防功能和肥效功能的菌株混菌发酵，所制备的复合微生物菌剂不仅具有肥效显著，而且具有抗病效果较好。经申请人试验证实，本发明所制备的复合微生物菌剂应用于小白嘴山药，不仅能够实现抗病增产，而且大幅度提高了山药的品质。
2、本发明的方法发酵生物量高，所制备的微生物菌剂含菌量高，在与现有产品肥效相同的前提下用量小。
3、本发明采用混菌发酵工艺，培养基残存营养少，所制备的微生物菌剂染菌率大幅度降低。
4、本发明采用芽孢错时接种的方式，使两个菌株协同发酵，在缩短发酵周期的同时发酵效果好。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
复合微生物菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
A、将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵10小时制成发酵液；
B、将拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus，保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌接入步骤A中的发酵液内通气发酵；发酵初始温度32℃；
C、镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至37℃，在1～2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束；
步骤A中发酵培养基包括如下质量百分含量的原料：
麸皮3.0％，红糖1.0％，硫酸铵0.03％，碳酸钙0.3％，豆饼粉0.5％，磷酸氢二钾0.03％，余量为水，pH＝7.0；
发酵培养基在发酵罐中的装料系数70％。
所述的步骤A通气发酵的通风量条件为通风比＝1：0.6。
所述的步骤B中通气发酵的条件为：7～12小时通风比1：1.2，12～24小时通风比为1：1.5，24小时～发酵结束通风比为1：1.2。
所述的发酵培养基采用如下步骤配制：
麸皮加水煮沸保持40分钟，过滤取滤液置于发酵罐，再依次加入制备发酵培养基的其他原料成分混匀，高温灭菌后将其降温至32℃。
还包括扩大培养步骤，即将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaci ens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌，以及拉丁文名称为Baci llus mucilaginosus、保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌分别制成克氏瓶种子。
所述的解淀粉芽孢杆菌克氏瓶培养基选用BPY培养基；胶冻样类芽孢杆菌克氏瓶培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨0.15％；葡萄糖0.15％；酵母汁0.07％；硫酸铵0.02％；硫酸镁0.02％；磷酸氢二钾0.01％；碳酸钙0.1％；余量为水；pH＝7.0。
取生长丰满的解淀粉芽孢杆菌250mL克氏瓶种子2个，用无菌水洗下斜面孢子，压差接种法接入步骤A发酵罐内的发酵培养基中。
将生长丰满的胶冻样类芽孢杆菌250mL克氏瓶种子3个接入步骤A中的发酵液内。
实施例2
复合微生物菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
A、将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵6小时制成发酵液；
B、将拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus，保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌接入步骤A中的发酵液内通气发酵；发酵初始温度30℃；
C、镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至35℃，在1～2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束；
步骤A中发酵培养基包括如下质量百分含量的原料：
麸皮1.5％，红糖0.5％，硫酸铵0.01％，碳酸钙0.1％，豆饼粉0.1％，磷酸氢二钾0.01％，余量为水，pH＝7.0；
发酵培养基在发酵罐中的装料系数60％。
所述的步骤A通气发酵的通风量条件为通风比＝1：0.6。
所述的步骤B中通气发酵的条件为：7～12小时通风比1：1.2，12～24小时通风比为1：1.5，24小时～发酵结束通风比为1：1.2。
所述的发酵培养基采用如下步骤配制：
麸皮加水煮沸保持20分钟，过滤取滤液置于发酵罐，再依次加入制备发酵培养基的其他原料成分混匀，高温灭菌后将其降温至30℃。
还包括扩大培养步骤，即将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaci ens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌，以及拉丁文名称为Baci llus mucilaginosus、保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌分别制成克氏瓶种子。
所述的解淀粉芽孢杆菌克氏瓶培养基选用BPY培养基；胶冻样类芽孢杆菌克氏瓶培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨0.1％；葡萄糖0.1％；酵母汁0.02％；硫酸铵0.01％；硫酸镁0.01％；磷酸氢二钾0.005％；碳酸钙0.05％；余量为水；pH＝7.0。
取生长丰满的解淀粉芽孢杆菌250mL克氏瓶种子1个，用无菌水洗下斜面孢子，压差接种法接入步骤A发酵罐内的发酵培养基中。
将生长丰满的胶冻样类芽孢杆菌250mL克氏瓶种子2个接入步骤A中的发酵液内。
实施例3
复合微生物菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
A、将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵8小时制成发酵液；
B、将拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus，保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌接入步骤A中的发酵液内通气发酵；发酵初始温度31℃；
C、镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至36℃，在1～2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束；
步骤A中发酵培养基包括如下质量百分含量的原料：
麸皮2.2％，红糖0.7％，硫酸铵0.02％，碳酸钙0.2％，豆饼粉0.3％，磷酸氢二钾0.02％，余量为水，pH＝7.0；
发酵培养基在发酵罐中的装料系数65％。
所述的步骤A通气发酵的通风量条件为通风比＝1：0.6。
所述的步骤B中通气发酵的条件为：7～12小时通风比1：1.2，12～24小时通风比为1：1.5，24小时～发酵结束通风比为1：1.2。
所述的发酵培养基采用如下步骤配制：
麸皮加水煮沸保持30分钟，过滤取滤液置于发酵罐，再依次加入制备发酵培养基的其他原料成分混匀，高温灭菌后将其降温至31℃。
还包括扩大培养步骤，即将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaci ens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌，以及拉丁文名称为Baci llus mucilaginosus、保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌分别制成克氏瓶种子。
所述的解淀粉芽孢杆菌克氏瓶培养基选用BPY培养基；胶冻样类芽孢杆菌克氏瓶培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨0.12％；葡萄糖0.12％；酵母汁0.045％；硫酸铵0.015％；硫酸镁0.015％；磷酸氢二钾0.007％；碳酸钙0.07％；余量为水；pH＝7.0。
取生长丰满的解淀粉芽孢杆菌250mL克氏瓶种子1个，用无菌水洗下斜面孢子，压差接种法接入步骤A发酵罐内的发酵培养基中。
将生长丰满的胶冻样类芽孢杆菌250mL克氏瓶种子3个接入步骤A中的发酵液内。
实施例4
复合微生物菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
A、将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵7小时制成发酵液；
B、将拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus，保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌接入步骤A中的发酵液内通气发酵；发酵初始温度31℃；
C、镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至35℃，在1～2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束；
步骤A中发酵培养基包括如下质量百分含量的原料：
麸皮1.8％，红糖0.6％，硫酸铵0.015％，碳酸钙0.15％，豆饼粉0.2％，磷酸氢二钾0.015％，余量为水，pH＝7.0；
发酵培养基在发酵罐中的装料系数63％。
所述的步骤A通气发酵的通风量条件为通风比＝1：0.6。
所述的步骤B中通气发酵的条件为：7～12小时通风比1：1.2，12～24小时通风比为1：1.5，24小时～发酵结束通风比为1：1.2。
所述的发酵培养基采用如下步骤配制：
麸皮加水煮沸保持25分钟，过滤取滤液置于发酵罐，再依次加入制备发酵培养基的其他原料成分混匀，高温灭菌后将其降温至31℃。
还包括扩大培养步骤，即将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaci ens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌，以及拉丁文名称为Baci llus mucilaginosus、保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌分别制成克氏瓶种子。
所述的解淀粉芽孢杆菌克氏瓶培养基选用BPY培养基；胶冻样类芽孢杆菌克氏瓶培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨0.11％；葡萄糖0.11％；酵母汁0.03％；硫酸铵0.011％；硫酸镁0.012％；磷酸氢二钾0.006％；碳酸钙0.06％；余量为水；pH＝7.0。
取生长丰满的解淀粉芽孢杆菌250mL克氏瓶种子2个，用无菌水洗下斜面孢子，压差接种法接入步骤A发酵罐内的发酵培养基中。
将生长丰满的胶冻样类芽孢杆菌250mL克氏瓶种子2个接入步骤A中的发酵液内。
实施例5
复合微生物菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
A、将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵9小时制成发酵液；
B、将拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus，保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌接入步骤A中的发酵液内通气发酵；发酵初始温度31℃；
C、镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至37℃，在2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束；
步骤A中发酵培养基包括如下质量百分含量的原料：
麸皮2.5％，红糖0.9％，硫酸铵0.025％，碳酸钙0.25％，豆饼粉0.4％，磷酸氢二钾0.025％，余量为水，pH＝7.0；
发酵培养基在发酵罐中的装料系数68％。
所述的步骤A通气发酵的通风量条件为通风比＝1：0.6。
所述的步骤B中通气发酵的条件为：7～12小时通风比1：1.2，12～24小时通风比为1：1.5，24小时～发酵结束通风比为1：1.2。
所述的发酵培养基采用如下步骤配制：
麸皮加水煮沸保持35分钟，过滤取滤液置于发酵罐，再依次加入制备发酵培养基的其他原料成分混匀，高温灭菌后将其降温至32℃。
还包括扩大培养步骤，即将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaci ens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌，以及拉丁文名称为Baci llus mucilaginosus、保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌分别制成克氏瓶种子。
所述的解淀粉芽孢杆菌克氏瓶培养基选用BPY培养基；胶冻样类芽孢杆菌克氏瓶培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨0.14％；葡萄糖0.14％；酵母汁0.06％；硫酸铵0.018％；硫酸镁0.018％；磷酸氢二钾0.009％；碳酸钙0.08％；余量为水；pH＝7.0。
取生长丰满的解淀粉芽孢杆菌250mL克氏瓶种子2个，用无菌水洗下斜面孢子，压差接种法接入步骤A发酵罐内的发酵培养基中。
将生长丰满的胶冻样类芽孢杆菌250mL克氏瓶种子3个接入步骤A中的发酵液内。
为验证实施例1-5的技术效果，申请人进行了如下实验：
(一)生物量
采用稀释涂平板法对混菌发酵液计数，发酵液含菌量可达5.0╳109cfu/mL以上，其中解淀粉芽孢杆菌不低于3.5╳109cfu/mL，胶冻样类芽孢杆菌不低于1.5╳109cfu/mL。
(二)两种方式下灌装前发酵液营养成分比较
采用分别发酵后混合(方式一)和混菌发酵(方式二，本发明方法)两种方式生产，制成相同含菌量的复合微生物菌剂。灌装后分别取3批次灌装产品，每批次取3瓶，测定产品残糖和残氮的含量。DNS法检测残糖；凯氏定氮法检测发酵液氨基氮含量。结果为3批次试验的平均值。
表1两种方式下产品内残糖和残氮含量比较
Figure BDA0003409011950000101
Figure BDA0003409011950000111
由表1可见，解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌分别发酵后按比例混合灌装，测定发酵液残糖和残氮含量分别是0.85％～0.99％和0.07mg/mL～0.12mg/mL。而混菌发酵的残糖和残氮的量大大降低，尤其残糖含量降低了89.80％～90.59％。上述实验说明本发明中所制备的复合微生物菌剂利于后期产品的保存。
(三)保存实验
取第(二)项中方式一(发酵后混合)制成的复合菌剂和方式二制得的菌剂(实施例1～5中的复合微生物菌剂)各500瓶，连续取5批次。进行保存实验，室温保存半年。观察变黑变臭及涨瓶等情况，计算染菌率。分别在0d，7d，15d，30d，60d，90d，180d平板计数考察菌体存活率。
表2发酵液保存实验结果(染菌率/％)
处理 方式一 方式二
第一批 3.82 1.00
第二批 3.15 0.53
第三批 3.87 0.71
第四批 3.74 0.76
第五批 3.55 0.83
由保存试验结果可见，经过6个月的室温保存，采用方式一生产的五批次产品染菌率分别为3.82％、3.15％、3.87％、3.74％和3.55％。而方式二制得的菌剂五批次的染菌率均不高于1％。可见混菌发酵由于更充分的利用了发酵液中的残存营养，使发酵菌种芽孢形成率大大提高，发酵结束弱菌较少，同时也减少了在灌装过程进入瓶内杂菌的存活率。近而大大降低产品的染菌率。
表3菌株存活情况(×108/g)
Figure BDA0003409011950000121
由表3的菌体存活试验可见，方式一制得的菌剂保存7d测定功能菌株含量，含菌量略有增加，这跟发酵液中残存营养使一些弱菌体存活有关，而7～15天弱菌体或形成芽孢或自溶死掉，含菌量下降了5.00％～8.69％；而采用方式二生产的菌剂产品在这一时期含菌量下降0.57％～1.76％，远远低于方式一制得的菌剂。可见在方式二制得的菌剂中弱菌体远低于方式一制得菌剂。180天后，混菌发酵生产的菌剂菌体存活率可达93.09％～94.56％，高于分别发酵混合制得产品菌体存活率7.43～10.70个百分点。微生物菌剂中功能菌株含量是保证产品质量和产品应用效果的关键指标，采用混菌发酵方式更好的消耗了发酵液的营养，芽孢形成率高，芽孢在保存过程中损失很小，产品的功能菌株含量更高，应用效果更好。
(四)田间应用试验
田间应用试验参照《微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南(NY/T1536-2007)执行。试验地在定兴县北田村，山药品种为小白嘴。2021年5月2日播种，10月29日收获。试验地为重茬2年，第三年种植地块，选择位置较远的两块地分别试验。
3.1试验设计
试验设三个处理，T1基肥减半+单独发酵混合菌剂处理；T2基肥减半+混菌发酵菌剂处理；CK常规施肥处理。每组试验均采用随机区组设计。菌剂含菌量均为5.0×109cfu/mL，用量均为75kg/hm2，每处理4次重复，小区面积60m2。各处理浇水、追肥等其他管理条件一致。
3.2试验方法
将复合菌剂按450kg/hm2加水稀释，用喷雾器均匀喷洒到播好种的山药种薯上，随即覆土封沟。
3.3试验调查
山药发病率调查：山药定植出苗后30d开始病害初次调查。以后每隔15天调查一次，记录病死颗数，计算发病率。
山药产量调查：各处理分别采收，每个处理随机挖取30株，进行调查，称总重，计算产量。
山药品质调查：在两块试验地中选取长势较好的地块进行山药品质调查。选取粗细均匀、无病虫害、无机械损伤、非畸形的各处理的新鲜山药块茎，去除山药芦头后，收集备用。每处理山药需1.0kg，测定山药块茎主要的营养成分，包括水分、淀粉、蛋白质等指标。水分参照GB 5009.3-2016进行测定；淀粉参照GB 5009.9-2016进行测定；蛋白质参照GB5009.5-2016进行测定；总糖参照NY/T 1278-2007进行测定；荧光法测定维生素C含量。
3.4试验结果
采用SPSS2.0软件对试验结果进行统计分析。
表4各施肥处理山药发病率及产量
Figure BDA0003409011950000131
由表4可知，重茬2年地块，常规施肥处理发病率最高，地块一发病率高达16.3％。这也是一般山药种植户在一块地连续种植两年后就不在此地块种植山药的原因。而将基施化肥减半增施复合微生物菌剂后，两个地块的发病率均显著降低。两种菌剂进行比较，采用方式二生产的菌剂防病效果更好。尤其在地块二，T2处理的山药发病率显著低于T1。从产量结果来看，基肥减半、增施菌剂处理的产量均显著高于对照；两种菌剂处理比较，在地块二T2处理的产量显著高于T1，可见施用复合微生物菌剂可以达到减肥和抗病的效果，采用混菌发酵制得的菌剂产品应用效果更好。
表5各施肥处理山药营养成分比较
Figure BDA0003409011950000141
由表5可知，基肥减半，增施菌剂处理的淀粉、蛋白质、可溶性糖等营养成分含量均显著高于对照，水分含量常规施肥处理最高，达79.4％。这说明施用菌剂有助于山药干物质的累积。两个菌剂处理比较，除蛋白质外，淀粉、可溶性糖、维生素C含量T2处理含量均显著高于T1，而水分则显著低于T1处理。可见复合菌剂处理对山药品质提高有显著效果，施用混菌发酵生产的菌剂产品T2处理营养成分含量增加更显著。

Claims (8)

1.复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
A、将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接入发酵罐内的发酵培养基，通气发酵6～10小时制成发酵液；
B、将拉丁文名称为Bacillus mucilaginosus，保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌接入步骤A中的发酵液内通气发酵；发酵初始温度30℃～32℃；
C、镜检观察芽孢形成率达到50％时，将发酵罐内温度升高至35℃～37℃，在1～2小时内罐内芽孢形成率达99％时发酵结束；
步骤A中发酵培养基包括如下质量百分含量的原料：
麸皮1.5％～3.0％，红糖0.5％～1.0％，硫酸铵0.01％～0.03％，碳酸钙0.1％～0.3％，豆饼粉0.1％～0.5％，磷酸氢二钾0.01％～0.03％，余量为水，pH＝7.0；
发酵培养基在发酵罐中的装料系数60％～70％。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤A通气发酵的通风量条件为通风比＝1：0.6。
3.根据权利要求1或2所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤B中通气发酵的条件为：7～12小时通风比1：1.2，12～24小时通风比为1：1.5，24小时～发酵结束通风比为1：1.2。
4.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基采用如下步骤配制：
麸皮加水煮沸保持20～40分钟，过滤取滤液置于发酵罐，再依次加入制备发酵培养基的其他原料成分混匀，高温灭菌后将其降温至30℃～32℃。
5.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于还包括扩大培养步骤，即将拉丁文名称为Bacillus amyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌，以及拉丁文名称为Bacillus mucil aginosus、保藏编号为CGMCC No.7240的胶冻样类芽孢杆菌分别制成克氏瓶种子。
6.根据权利要求5所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述的解淀粉芽孢杆菌克氏瓶培养基选用BPY培养基；胶冻样类芽孢杆菌克氏瓶培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨0.1％～0.15％；葡萄糖0.1％～0.15％；酵母汁0.02％～0.07％；硫酸铵0.01％～0.02％；硫酸镁0.01％～0.02％；磷酸氢二钾0.005％～0.01％；碳酸钙0.05％～0.1％；余量为水；pH＝7.0。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于取生长丰满的解淀粉芽孢杆菌250mL克氏瓶种子1～2个，用无菌水洗下斜面孢子，压差接种法接入步骤A发酵罐内的发酵培养基中。
8.根据权利要求5或6中任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于将生长丰满的胶冻样类芽孢杆菌250mL克氏瓶种子2～3个接入步骤A中的发酵液内。
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