CN106397030A - 一种复合微生物菌肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌肥及其制备方法，具体是公开了一种防病促生的复合微生物菌肥及其制备方法，制备该复合微生物菌肥的原料由浑圆链霉菌粉，环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉，多孢木霉菌粉，巴氏梭菌菌粉，氨基酸原粉，黄腐酸钾，棉粕粉组成。本菌肥中的固氮菌环状芽孢杆菌与巴氏梭菌—能自动固定空气中的氮气，转化为农作物必需的氮肥。同时它们通过产酸与多糖物质能将大量沉积于土壤中的不可溶性磷钾，分解成农作物可以再吸收利用的磷肥和钾肥。浑圆链霉菌与多孢木霉菌抗病菌可使病菌受到抑制，可减少病害的发生；还可利用微生物削减、净化土壤中重金属或降低重金属毒性。

Description

一种复合微生物菌肥及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种防病促生的复合微生物菌肥及其制备方法。

背景技术

长期不合理地施用化肥、农药，造成资源浪费和生产成本增加，环境严重污染，农产品质量下降。国际农产品贸易的绿色壁垒只是农产品出口难度增加，农民面临增产不增收的严峻挑战。近年来，随着环保与健康意识的提高，全国范围内掀起了 “绿色食品” 热。同时，随着对外贸易的迅速发展，国际市场对无污染食品的需求也与日俱增。一些发达国家为了保护自国的农业，采取绿色贸易壁垒。即大量使用化肥和农药的农产品被拒之门外。因此，在农业生产上，具有重要经济效益，环境效益和社会效益的是开辟新的微生物药肥以减少甚至不用化肥与农药，生产出高产优质的农产品，提高国际竞争力，促进农村经济的可持续发展。

微生物菌肥是一种环境友好型肥料，也是未来农林业可持续发展的重要方向之一，能维持与提高土壤肥力，有利于微生物优势种的繁殖，保持生态平衡，减少环境污染，能源消耗低，运输量少，施用量少且使用方便等优点。因此，微生物肥料越来越受人类青睐。

目前国内对于微生物肥料的研究已经取得了一定的进展。但是，存在的主要问题也是制约微生物肥料发展的关键。主要有，一、品种单一，目前应用较多的有固氮菌、解磷菌、解钾菌等，很多微生物菌肥是单一菌种发酵，其应用效果受到限制。二、菌肥中微生物含量低。这是制约微生物菌肥发展的关键因素。目前国内生产水平在发酵液活菌总数1-5亿个/mL左右，发酵液中活菌数低是导致生产菌肥中微生物含量不足的瓶颈。三、生产工艺落后。四、市场混乱，鱼目混珠。等等。

另外，作物连作在农业生产中及其普遍，由此引起的土传病害非常严重，在设施栽培中土传病害尤为突出，而这些问题无法通过化肥或普通微生物肥料的施用加以克服。

发明内容

本发明的目的是为了弥补化肥和目前微生物肥料的上述不足，突破连作障碍，克服土传病害问题，根据以菌治菌的原理选择不同功效的优良菌种的组合，研制出具有营养、抗生和促生等功能的微生物菌肥。

为了达到上述目的，本发明的复合微生物菌肥，其特征在于，制备该复合微生物菌肥的原料按重量份为：浑圆链霉菌粉20-60份， 环状芽孢杆菌Bacillus circulans与崛越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii 混合发酵菌粉20-60份， 多孢木霉菌粉20-40份，巴氏梭菌菌粉20-40份，氨基酸原粉10-20份，黄腐酸钾10-20份，棉粕粉10-20份；

本发明选用了五个菌种组合。其中有的固氮，解磷，解钾，可以促进作物生长的菌株，也有分泌抗生素物质来抑制土壤中病原菌生长的菌株。与普通的化学肥料和化学农药不同，微生物菌肥并不是直接给作物提供营养，而是利用微生物菌肥里含有的活微生物的生命活动来改善作物根际生态环境，转化土壤中作物不可直接利用的营养元素为作物可利用的速效营养，菌株还可以分泌促生物质来刺激作物生长。在治病方面，微生物菌肥采用以菌治菌的原理，利用拮抗菌株分泌的抗生物质来抑制土壤中病原菌的生长，使病原菌在土壤中无法达到致病数量，从而无法侵染作物，使作物发病。经过大规模田间试验，结果表明该微生物菌肥在烟草，水稻、草莓和瓜类作物上，不但可以提高产量、改善品质，还可以很好地防治农作物的土传病害，在设施农业方面的功效更为显著。

为了达到上述目的，所述的一种复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、浑圆链霉菌粉的制备

取出浑圆链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为浑圆链霉菌种子液；

二级种子扩培：将上述制备的浑圆链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为浑圆链霉菌二级种子液；

发酵：将上述制备的浑圆链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌固体发酵培养基上，菌种与浑圆链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的浑圆链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵4-6天，检测其孢子含量不低于40亿CFU/g，即可低温风干，即得到浑圆链霉菌菌粉；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；

其中，所述的浑圆链霉菌二级液体种子培养基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的浑圆链霉菌固体发酵培养基：啤糟渣80%，棉粕5%，玉米粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉

崛越氏芽孢杆菌种子液的制备

取出崛越氏芽孢杆菌保藏管，用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为320L/min，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于20亿cfu/ml，即可作为崛越氏芽孢杆菌种子液；

环状芽孢杆菌种子液的制备

取出环状芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为350L/min ，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于10亿cfu/ml，即可作为环状芽孢杆菌种子液；

发酵：将上述制备的崛越氏芽孢杆菌种子液与环状芽孢杆菌种子液以1：3-1：1的比例混匀，然后以总接种量的10%-20%的接种量加至芽孢固体发酵培养基中，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵36-48小时，待芽孢含量不低于100亿cfu/g，其中环状芽孢杆菌的芽孢含量不低于40亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，即得到环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖5g，磷酸氢二钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸钙0.1 g，碳酸钙5g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述液体种子培养基：糖蜜35 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，碳酸钙5.0 g/L，pH7.0；

其中，所述的芽孢固体发酵培养基：甘蔗渣57%，麸皮35%，棉粕5%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、多孢木霉菌粉的制备

多孢木霉种子液的制备：取出多孢木霉菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养6天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养4-6天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为多孢木霉种子液；

发酵：将上述制备的多孢木霉种子液以3%的接种量接种至灭菌的多孢木霉固体发酵培养基上，菌种与多孢木霉固体培养基混合均匀后，将接好种的多孢木霉固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-10cm，控温28-32℃，湿度保持为60%-75%，发酵4-6天，检测其总孢子含量不低于30亿CFU/g，即可低温风干，即得到多孢木霉菌粉；

其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；

其中，所述的多孢木霉固体发酵培养基：麸皮85%，芝麻渣粕2%，玉米芯5%，石粉4%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、巴氏梭菌菌粉的制备

取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有999mLRCM培养基的厌氧瓶中，37℃条件下静态厌氧活化64h，将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的99L巴氏梭菌发酵培养基中，37℃条件下静态厌氧培养64h~126h，芽孢含量超过30亿CFU/ml，即可加入轻质碳酸钙，喷雾干燥，调节巴氏梭菌芽孢含量30亿CFU/g，即为巴氏梭菌菌粉；

其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g /L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，

其中，所述的巴氏梭菌发酵培养基：:酵母膏20g/L，牛肉膏10g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min。

、将上述步骤中的浑圆链霉菌粉20-60份， 环状芽孢杆菌Bacillus circulans与崛越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii 混合发酵菌粉20-60份， 多孢木霉菌粉20-40份，巴氏梭菌菌粉20-40份，氨基酸原粉10-20份，黄腐酸钾10-20份，棉粕粉10-20份混匀，检测总菌含量不低于30亿CFU/ g，包装即为复合微生物菌肥。

本发明复合微生物菌肥中含有浑圆链霉菌，能产生灰霉素与白霉素的复合物等抗菌素，对植物病原菌有特别强大的抑制效果。链霉菌是产生抗生素的主要微生物来源。链霉菌的抗生作用体现在次级代谢产物即抗生素对病原菌直接的抑制和致死作用。抗生素对病原菌细胞和大分子物质合成的影响表现在抑制蛋白质、核酸和质膜的合成，或者干扰病原菌的代谢系统，从而抑制其生长。并且，浑圆链霉菌能产生磷酸酶，增溶土壤中的P元素，更好地促进植物吸收。

本发明复合微生物菌肥中含有环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌；芽孢杆菌是一种较理想的生物肥料添加菌株，具有抗逆性强、营养简单、繁殖速度快，有效活菌数量高、性能稳定，储存期长等优势而成为近年来的研究热点。此外，多数菌种具有防病、促生、解磷、解钾、固氮作用，对于发展生态农业，具有重要的现实意义。本发明复合微生物菌肥中含有的环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时必定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长和抑制病菌等综合功能。崛越氏芽孢杆菌能够防治植物病害源于其能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物,这些抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒和菌原体等的正常生长。崛越氏芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期产生的脂肽类抗生素是其最重要的抗菌物质。脂肽类抗生素包括伊枯草菌素(iturins)、泛革素(fengycins)和表面活性素(surfactin),其中伊枯草菌素和泛革素具有很强的抗真菌活性，而表面活性素对病毒、肿瘤、支原体都有很高的抑制活性。

长期以来，根瘤菌和自生固氮菌等虽具有较强的固氮能力，但抗逆性低，不耐贮存，不利于我国生物固氮菌肥的商品化和推广使用。自1958年Hin首次在口本分离得到一株具有高固氮活性的芽抱杆菌后，土壤中新发现的具有固氮作用的芽抱杆菌越来越多。具有固氮作用的芽孢杆菌添加到生物肥料中，可使生物肥料耐酸、耐盐、耐高温和耐高压，为生物固氮肥料的研发、推广和应用将起着重要作用。本发明中的环状芽孢杆菌具有较强的固氮作用，并且具有明显的根迹促生作用。

本发明复合微生物菌肥中含有两类固氮菌，一类为好氧性的固氮菌--环状芽孢杆菌，其能够快速固定分子氮，为植物利用。另一类厌氧固氮菌—巴氏梭菌，也具有较强的固氮能力，能在土壤较深层的土壤中进行固氮（10-30cm）。环状芽孢杆菌在发酵过程中会产生大量的多糖物质以及巴氏梭菌会产生大量的酸性物质，其会降解土壤中固定的磷素与钾素原素；增加土壤中可溶性磷与钾，减少磷钾肥的施入。

本发明复合微生物菌肥中含有多孢木霉，多孢木霉在重寄生过程中产生立了一系列病原菌菌丝细胞壁的水解酶。木霉菌在侵入或穿透寄主菌丝细胞时，产生了几丁质酶(chitinases)、葡聚糖酶、纤维素酶(cellulases)、木聚糖酶(xylanaes)以及蛋白酶((proteinases)、脂酶等一系列水解酶类，来消解病原菌的细胞壁。它们大都由多糖和真菌细胞壁诱导，并受代谢降解物，如高浓度葡萄糖的阻遏。在这些细胞壁降解酶中，几丁质酶和葡聚糖酶被公认为是影响生防真菌重寄生能力的重要因子，并具有协同作用。几丁质酶包括内切酶和外切酶两类，其中外切酶为N一乙酰-氨基葡萄糖普酶(N-acetylglucosaminidase)和几丁二糖酶(chitobiosidase)。这两类酶对植物病原真菌的细胞壁有强烈的水解作用，从而抑制病原菌孢子萌发并引起菌丝以及抱子的消解，而且这两类酶之问具有协同作用，同时也具有与杀菌剂及细菌等生防因子协同作用的功效。许多木霉菌株产生挥发性或非挥发性的抗菌素类物质，如木霉素(trichoderlnin)、胶霉素(gliotoxin)、绿木霉素(viridin)、抗菌肽((peptideantibiotic)等。多孢木霉可产生的多种抗生物质，这些物质包括抗生素和一些酶类。这些抗生物质的化学性质各不相同，包括了戊酮、辛酮、类菇、多肤和氨基酸衍生物等几大类。这些代谢物可以破坏菌丝细胞壁，使细胞内物质外渗，引起立枯丝核菌菌丝的原生质凝聚，菌丝断裂解体，对病原菌菌落有不同程度的抑制作用，由于抗生物质的种类，化学性质以及作用方式的差异，病原菌往往难以发展抗药性。

本发明的有益效果：本发明中的浑圆链霉菌，环状芽孢杆菌，崛越氏芽孢杆菌，多孢木霉，巴氏梭菌，五种菌是从500多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能在植株的根，茎，叶以及土壤中能够生长繁殖，能产生多种抗菌素如灰霉素与白霉素的复合物等来抑制植物病原菌；本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，以及通过次级代谢产物诱导植物产生抗病性，增强其防病效果；再次，本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，具有固氮，解磷，解钾与根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果；本发明复合微生物菌肥对人、畜安全，属于环境友好型，利用本发明方法防治植物病害不易产生抗药性，本发明制备方法稳定、成本低、使用简单。

本菌肥中的固氮菌环状芽孢杆菌与巴氏梭菌—能自动固定空气中的氮气，转化为农作物必需的氮肥。同时它们通过产酸与多糖物质能将大量沉积于土壤中的不可溶性磷钾,分解成农作物可以再吸收利用的磷肥和钾肥。浑圆链霉菌与多孢木霉菌抗病菌可使病菌受到抑制,可减少病害的发生；还可利用微生物,削减、净化土壤中重金属或降低重金属毒性,并且微生物肥料施入土壤后使有益微生物增加,有害微生物明显减少。

下面结合试验说明本发明复合微生物菌肥的田间效果。（下面简称菌肥）

一、复合微生物菌肥在烟草上的应用效果

1．试验地点：湖南省隆回县滩头镇龙竹村某农户种植地；试验时间：2015年3-8月。

2．试验方法：烤烟品种：中烟99-10-1，烤烟移栽苗时，用菌肥500倍稀释液灌根一次；缓苗后20天用菌肥250倍液喷施第一次，然后连续每隔20天喷施第二次和第三次（总共每亩用菌肥4公斤）。对照区在每次用菌肥250倍液喷施的同时，用同样用量的清水喷洒。

3．试验结果：

施用复合微生物菌肥后， 株高、茎围、节距、有效叶数、最大叶面积均大于喷施清水的对照，说明可以有效改善烟株的农艺性状，促进烟株健壮生长。施用的烟株发病率和发病程度显著降低，可以有效提高烟株的抗病性，特别对花叶病有很好的控制效果；

从表1可以看出，根据田间调查的主要病害发生情况，黑胫病的发病率和病情指数明显降低；青枯病在处理区上没有发现，在对照上仅有少量发生；花叶病发病率和病情指数处理区非常的低，仅为5.3%和1.1，达到极显著的控制效果。

表1复合微生物菌肥对烟草病防治效果

施用复合微生物菌肥后烟草提早成熟、提高品质，很大程度上提高烟叶的产量、均价、产值、上中等烟比例。从表可以分析得出，试验示范区烟叶产量、产值、均价分别比对照区域高出58.1公斤/亩、1923.1元/亩、4.18元/公斤。减去增加的成本430元（其中人工310元），可净增1493.1元/亩。

表2复合微生物菌肥对烟草产量产值增收效果。

处理	产量（公斤/亩）	产值（元/亩）	均价（元/公斤）
				对照区	208.2	2902.3	13.94
处理区	266.3	4825.4	18.12

二、复合微生物菌肥在水稻上的试验效果

1．试验地点：湖南省隆回县滩头镇龙竹村某农户良田

2．试验方法：

⑴．用100倍复合微生物菌肥稀释液浸种6-8小时；

⑵．在秧苗期、分蘖期、孕穗期分别用1kg/亩的复合微生物菌肥施入水田中；

3．试验结果：

⑴.对水稻发芽率的影响 效果最好.能促进种子发芽、生根、提高发芽势和发芽率，发芽势增幅在10.78%，发芽率增幅为8.2%，发芽快而整齐，根系发达，粗白根多，成秧率高；

⑵.对水稻育秧和大田生长发育、提高单产均有明显效果，尤其对提高秧苗素质，高成活秧，提高千粒重等有显著作用。小区试验随着施用时期不同，每亩可增产稻谷88千克，增产幅度为15%，增加收益176元，扣除成本90元，亩净增收益86元；

⑶．提高水稻的抗旱、抗病、抗倒伏等抗逆性，对各种土传病害与细菌性病害，尤其对稻瘟病、纹枯病、立枯病等病害的发生有较强的抑制和预防的作用。

三、复合微生物菌肥在草莓上试验效果

1．试验地点：湖南省隆回县桃洪镇某种植户

2．试验方法：在定植期，将苗栽好，用菌肥500倍稀释液灌根1次，

在草莓生长期间，叶面喷施1：250倍菌肥，10d（天）1次，连喷3次；

3．试验结果：

结果发现，提前开花结果，果实大而饱满，结果数多，异形果少，口感好，着色鲜亮，草莓（丰香）的单株产量平均为127．26g，较对照（不喷菌肥）提高28．17％而且喷用菌肥后草莓果实的可溶性固形物含量达10.22％，较对照相对高14.2％，同时，施用菌肥后，酸含量降低，Vc含量提高，果实的风味和品质得到明显改善，并且耐储存，比不使用菌肥的草莓多储存10天以上，草莓根部肥壮，消灭了草莓的白粉病和根腐病。使用菌肥的地块比对照区提高产量28%，糖度比对照区提高2-3度。

四、复合微生物菌肥在西红柿的应用效果

1．试验时间：2011年6月-9月

2．试验地点：河北省沧县杜林乡某种植户

3．试验方法：在移植前将幼苗用200倍菌肥稀释液沾根30分种，在定植后10天后，用菌肥500倍稀释液灌根1次，在西红柿生长期间，叶面喷施1：250倍菌肥，20天1次，连喷3次；

4．试验结果：结果发现，提前开花结果，果实大而饱满，结果数多，异形果少，口感好，着色鲜亮，西红柿平均株高较对照（不喷菌肥）提高11％，产量比对照增高23%，相比对照，可以有效地预防由缺钙引起的西红柿果实脐腐病。

具体实施方式

实施例1

一种复合微生物菌肥，其特征在于，制备该复合微生物菌肥的原料按重量份为：浑圆链霉菌粉40份， 环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉40份， 多孢木霉菌粉30份，巴氏梭菌菌粉30份，氨基酸原粉15份，黄腐酸钾15份，棉粕粉15份；

为了达到上述目的，该复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、浑圆链霉菌粉的制备

取出浑圆链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为浑圆链霉菌一级种子液；

二级种子扩培：将上述制备的浑圆链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为浑圆链霉菌二级种子液；

发酵：将上述制备的浑圆链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌固体发酵培养基上，菌种与浑圆链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的浑圆链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵5天，检测其孢子含量为48亿CFU/g，即可低温风干，即得到浑圆链霉菌菌粉；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；

其中，所述的浑圆链霉菌二级液体种子培养基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的浑圆链霉菌固体发酵培养基：啤糟渣80%，棉粕5%，玉米粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉

崛越氏芽孢杆菌种子液的制备

取出崛越氏芽孢杆菌保藏管，用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为320L/min，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于20亿cfu/ml，即可作为崛越氏芽孢杆菌种子液；

环状芽孢杆菌种子液的制备

取出环状芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为350L/min ，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于10亿cfu/ml，即可作为环状芽孢杆菌种子液；

发酵：将上述制备的崛越氏芽孢杆菌种子液与环状芽孢杆菌种子液以1：2的比例混匀，然后以总接种量的15%的接种量加至芽孢固体发酵培养基中，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵44小时，检测芽孢含量为115亿cfu/g，其中环状芽孢杆菌的芽孢含量为48亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，即得到环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖5g，磷酸氢二钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸钙0.1 g，碳酸钙5g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述液体种子培养基：糖蜜35 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，碳酸钙5.0 g/L，pH7.0，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

其中，芽孢固体发酵培养基：甘蔗渣57%，麸皮35%，棉粕5%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、多孢木霉菌粉的制备

多孢木霉种子液的制备：取出多孢木霉菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养6天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养4-6天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为多孢木霉种子液；

发酵：将上述制备的多孢木霉种子液以3%的接种量接种至灭菌的多孢木霉固体发酵培养基上，菌种与多孢木霉固体培养基混合均匀后，将接好种的多孢木霉固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-10cm，控温28-32℃，湿度保持为60%-75%，发酵5天，检测其总孢子含量为44亿CFU/g，即可低温风干，即得到多孢木霉菌粉；

其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；

其中，所述的多孢木霉固体发酵培养基：麸皮85%，芝麻渣粕2%，玉米芯5%，石粉4%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、巴氏梭菌菌粉的制备

取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有999mLRCM培养基的厌氧瓶中，37℃条件下静态厌氧活化64h。将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的99L巴氏梭菌发酵培养基中。37℃条件下静态厌氧培养116h，检测其芽孢含为40亿CFU/ml，即可加入轻质碳酸钙，喷雾干燥，调节巴氏梭菌芽孢含量35亿CFU/g，即为巴氏梭菌菌粉；

其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g /L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，

其中，所述的巴氏梭菌发酵培养基：:酵母膏20g/L，牛肉膏10g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min。

、将上述步骤中的浑圆链霉菌粉40份， 环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉40份， 多孢木霉菌粉30份，巴氏梭菌菌粉30份，氨基酸原粉15份，黄腐酸钾15份，棉粕粉15份混匀，检测其总菌含量为45亿CFU/g，包装即为复合微生物菌肥。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (2)

1.一种复合微生物菌肥，其特征在于，制备该复合微生物菌肥的原料按重量份为：浑圆链霉菌粉20-60份， 环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉20-60份， 多孢木霉菌粉20-40份，巴氏梭菌菌粉20-40份，氨基酸原粉10-20份，黄腐酸钾10-20份，棉粕粉10-20份。

2.根据权利要求1所述的一种复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

、浑圆链霉菌粉的制备

取出浑圆链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为浑圆链霉菌种子液；

二级种子扩培：将上述制备的浑圆链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为浑圆链霉菌二级种子液；

发酵：将上述制备的浑圆链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌固体发酵培养基上，菌种与浑圆链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的浑圆链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵4-6天，检测其孢子含量不低于40亿CFU/g，即可低温风干，即得到浑圆链霉菌菌粉；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；

其中，所述的浑圆链霉菌二级液体种子培养基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的浑圆链霉菌固体发酵培养基：啤糟渣80%，棉粕5%，玉米粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉

崛越氏芽孢杆菌种子液的制备

取出崛越氏芽孢杆菌保藏管，用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为320L/min，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于20亿cfu/ml，即可作为崛越氏芽孢杆菌种子液；

环状芽孢杆菌种子液的制备

取出环状芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为350L/min ，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于10亿cfu/ml，即可作为环状芽孢杆菌种子液；

发酵：将上述制备的崛越氏芽孢杆菌种子液与环状芽孢杆菌种子液以1：3-1：1的比例混匀，然后以总接种量的10%-20%的接种量加至芽孢固体发酵培养基中，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵36-48小时，待芽孢含量不低于100亿cfu/g，其中环状芽孢杆菌的芽孢含量不低于40亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，即得到环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖5g，磷酸氢二钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸钙0.1 g，碳酸钙5g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述液体种子培养基：糖蜜35 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，碳酸钙5.0 g/L，pH7.0；

其中，所述的芽孢固体发酵培养基：甘蔗渣57%，麸皮35%，棉粕5%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、多孢木霉菌粉的制备

多孢木霉种子液的制备：取出多孢木霉菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养6天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养4-6天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为多孢木霉种子液；

发酵：将上述制备的多孢木霉种子液以3%的接种量接种至灭菌的多孢木霉固体发酵培养基上，菌种与多孢木霉固体培养基混合均匀后，将接好种的多孢木霉固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-10cm，控温28-32℃，湿度保持为60%-75%，发酵4-6天，检测其总孢子含量不低于30亿CFU/g，即可低温风干，即得到多孢木霉菌粉；

其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；

其中，所述的多孢木霉固体发酵培养基：麸皮85%，芝麻渣粕2%，玉米芯5%，石粉4%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、巴氏梭菌菌粉的制备

取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有999mLRCM培养基的厌氧瓶中，37℃条件下静态厌氧活化64h，将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的99L巴氏梭菌发酵培养基中，37℃条件下静态厌氧培养64h~126h，芽孢含量超过30亿CFU/ml，即可加入轻质碳酸钙，喷雾干燥，调节巴氏梭菌芽孢含量30亿CFU/g，即为巴氏梭菌菌粉；

其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g /L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，

其中，所述的巴氏梭菌发酵培养基：:酵母膏20g/L，牛肉膏10g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min；

、将上述步骤中的浑圆链霉菌粉20-60份， 环状芽孢杆菌Bacillus circulans与崛越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii 混合发酵菌粉20-60份， 多孢木霉菌粉20-40份，巴氏梭菌菌粉20-40份，氨基酸原粉10-20份，黄腐酸钾10-20份，棉粕粉10-20份混匀，检测总菌含量不低于30亿CFU/ g，包装即为复合微生物菌肥。