CN115747100B - 一种暹罗芽孢杆菌n2及其在防治人参根腐病中的应用 - Google Patents
一种暹罗芽孢杆菌n2及其在防治人参根腐病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种暹罗芽孢杆菌N2及其在防治人参根腐病中的应用，属于农业微生物技术领域。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.25423，保藏日期2022年7月27日，所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2在防治人参根腐病中的应用。有益效果是暹罗芽孢杆菌N2及其菌剂对人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌的菌丝生长和分生孢子形成具有抑制作用，且有一定的增产作用，降低化学农药的使用，降低农药在人参中的残留量，并且对人参生长安全无药害，对环境无污染，对于人参有促生和增产的作用；还可与化学农药防治相结合，用于植物根腐病防治，降低农药残留量，有良好的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种暹罗芽孢杆菌N2及其在防治人参根腐病中的应用。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)，多年生宿根草本植物，人参属植物大约有一亿年的历史，有活化石之称，经过近400年的培植驯化，我国已具备人工种植的能力。作为名贵中药材，在我国栽培面积最大、产量最高。人参主要以其根部入药，具有延年益寿、益心复脉、镇定安神等功效。人参皂苷可以增强心肺功能，还可以降血糖、增强体质、改善应激能力，对癌症也有一定的缓解作用。我国吉林、辽宁、黑龙江为主产区，河北、山西、陕西等省也有栽培。我国已成为世界上主要的人参生产国和出口国，每年生产的人参产量占世界总产量的78％以上，出口量占国际市场的60％以上，但产生的经济效益却很低，这主要是由于防治人参病害尤其是根部病害过程中农药使用不合理，导致人参根中农药残留超标，人参产品质量不高造成的。
人参生育期较长，一般4～6年，同时人参对生产条件的要求较高，在其整个生长过程中极易遭受各种病原菌的侵袭，导致多种病害的发生。已有记载的人参病害有40余种，我国约25种以上。其中根部病害主要有人参立枯病、菌核病、锈腐病及镰孢菌根腐病，其中以人参镰孢型根腐病和人参锈腐型根腐病为主，极大降低了人参根的产量和品质。
人参镰孢型根腐病的病原主要为腐皮镰孢菌(F.solani)和尖镰孢菌(F.oxysporium)，属于半知菌类镰孢菌属真菌。根部及地下茎基部为受害部位，侵染后呈现淡褐色或黄褐色圆形或无规则病斑，后期呈黑褐色或红褐色，病斑可扩展至大半个根部甚至全部，导致人参根部呈褐色腐烂；根被侵染初期地上部不表现症状，后期严重时地上部人参叶片由下向上逐渐变黄或红色，萎蔫，直至死亡。
人参锈腐型根腐病(锈腐病)的病原为Cylindrocarpon destructans、C.panacis、C.obtusisporum和C.panicicola，属半知菌类菌物，丝孢纲，丝孢目，柱孢属真菌。其有性态为Ilyonectria，东北区域以强壮土赤壳菌(有性态名称Ilyonectria robusta；无性态名称C.obtusisporum)为优势种，主要危害人参的地下部分以及越冬芽。参根受到侵染后，初期显示为黄色至黄褐色小斑、逐渐发展为圆形、椭圆形或无规则形锈褐色病斑。后期发展为病斑周围稍有突起，中心凹陷，病健界限清晰的铁锈色病斑。后期有大量的锈粉状物在病斑处大量产生，停止侵染后呈现愈合状痕印。
近几年，由腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌引起的人参根腐病在我国人参主产区发病率逐年上升，且化学防治效果不理想，给人参生产造成严重的损失。
暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis属芽孢杆菌科芽孢杆菌属。已报道其对镰孢菌(Fusarium spp.)、茄立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、链格孢菌(Alternaria spp.)具有良好的抑菌活性，同时具有较好的促生作用和稳定性，是一种极具开发潜力的生防细菌。国外报道了暹罗芽孢杆菌在养殖和蔬菜等作物栽培上的促生作用。Meidong等用含有菌株的饲料喂食鲇鱼不仅无副作用，而且能促进鱼生长；Pastor-Bueis等以厌氧消化液为主要原料，加入暹罗芽孢杆菌研制生物肥料，施用后作物的氮素利用效率提高，产量也显著增加。在国内，张霞等发现暹罗芽孢杆菌ZHX-10，其菌悬液、挥发性气体和发酵液对白绢病菌菌丝的生长均有抑制作用，认为其应用潜力较大。目前，对于利用暹罗芽孢杆菌防治人参根腐病，尤其是对腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌引起的人参根腐病的抑制和应用尚未见报道。
对于人参根腐病的防治，目前应用较多的主要有化学农药防治、农业防治和生物防治，其中生物防治具有无毒、无残留、病原菌不易产生抗药性等优点，应用前景广阔。
发明内容
本发明提供一种暹罗芽孢杆菌N2及其在防治人参根腐病中的应用，以解决目前化学农药防治时存在的人参农药残留量高，及化学防治效果不理想，给人参生产造成严重的损失的问题。
本发明采取的技术方案是：
一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.25423，保藏日期2022年7月27日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2在防治人参根腐病中的应用。
本发明所述人参根腐病由人参镰孢型根腐病菌腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖镰孢菌(F.oxysporium)和人参锈腐型根腐病菌强壮土赤壳菌(Ilyonectria robusta)所导致。
含有暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2的菌剂。
本发明所述菌剂的活菌数为108CFU/mL。
本发明含有暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2的菌剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)菌株活化：将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2接种于固体培养基上，于28℃下培养1-2天；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于26℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：将种子液接入发酵培养液中，于26℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2的菌剂。
本发明所述步骤(1)中所述固体培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
本发明所述步骤(2)中所述种子培养液体培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
本发明所述步骤(3)中所述菌剂配方为：葡萄糖20.0g，蛋白胨50.0g，甘油5.0g，K2HPO4·3H20 1.5g，MgSO4·7H20 1.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
本发明所述步骤(3)中种子液的接种量为4％。
含有暹罗芽孢杆菌N2的菌剂在防治人参根腐病中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2菌株是从烟草根际土壤中分离的生防菌株，暹罗芽孢杆菌N2及其菌剂对人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌的菌丝生长和分生孢子形成具有抑制作用，并且在大田防治中，对人参镰孢型根腐病和人参锈腐型根腐病具有良好的防治效果，且有一定的增产作用。有效防治东北道地人参根部病害的发生，降低化学农药的使用，降低农药在人参中的残留量，并且对人参生长安全无药害，对环境无污染，对于人参有促生和增产的作用；还可与化学农药防治相结合，用于植物根腐病防治，降低农药残留量，具有重要的实践意义和创新价值，有良好的应用开发前景。
附图说明
图1是本发明暹罗芽孢杆菌N2菌株形态图，图中A：在NA平板上的菌落形态；B：透射电镜观察N2的菌体形态；C：N2菌株革兰氏染色结果；
图2是本发明的暹罗芽孢杆菌N2菌株对人参腐皮镰孢菌(Fusarium solani)菌丝的生长和分生孢子萌发的抑制效果图，图中A：腐皮镰孢菌在PDA平板上的菌落形态；B：腐皮镰孢菌分生孢子的萌发状态；C：腐皮镰孢菌的菌丝形态；D：暹罗芽孢杆菌N2菌株对腐皮镰孢菌菌落生长的抑制作用；E：暹罗芽孢杆菌N2菌株对腐皮镰孢菌分生孢子萌发的抑制作用；F：暹罗芽孢杆菌N2菌株对腐皮镰孢菌菌丝生长的抑制作用；
图3是本发明的暹罗芽孢杆菌N2菌株对人参尖镰孢菌(F.oxysporium)菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用图；图中A：尖镰孢菌在PDA平板上的菌落形态；B：尖镰孢菌分生孢子的萌发状态；C：尖镰孢菌的菌丝形态；D：暹罗芽孢杆菌N2菌株对尖镰孢菌菌落的生长的抑制作用；E：暹罗芽孢杆菌N2菌株对尖镰孢菌分生孢子萌发的抑制作用；F：暹罗芽孢杆菌N2菌株对尖镰孢菌菌丝生长的抑制作用；
图4是本发明的暹罗芽孢杆菌N2菌株对强壮土赤壳菌(Ilyonectria robusta)菌丝的生长和分生孢子萌发的抑制作用图，图中A：强壮土赤壳菌在PDA平板上的菌落形态；B：强壮土赤壳菌分生孢子的萌发状态；C：强壮土赤壳菌的菌丝形态；D：暹罗芽孢杆菌N2菌株对强壮土赤壳菌菌落的生长的抑制作用；E：暹罗芽孢杆菌N2菌株对强壮土赤壳菌分生孢子萌发的抑制作用；F：暹罗芽孢杆菌N2菌株对强壮土赤壳菌菌丝生长的抑制作用。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2菌株的分离、筛选及鉴定
1.1细菌菌株的分离
采用平板稀释分离法对采集到的烟草根际土壤中样品进行分离。取3g土壤样品加入30mL无菌水中，以240r/min，28℃，振荡培养30min后取出待用。在无菌条件下将土壤悬浮液用无菌水逐级稀释为10-3、10-4、10-5三个浓度梯度。依次取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨NA培养基表面，每个处理设3次重复，置于26℃恒温培养箱培养48h。培养期间定期观察，选择优势菌落的细菌菌落进行纯化，保存备用。
牛肉膏蛋白胨NA培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
1.2暹罗芽孢杆菌N2菌株的筛选获得
初筛：采用平皿对峙培养法对1.1中分离纯化得到的各细菌菌株进行拮抗筛选。用内径为8mm的打孔器打取活化好的病原菌(人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌)置于PDA平板的中央，在距平板中心2.4cm处呈十字形交叉形分别用打孔器(内径8mm)打洞，用移液枪吸取30μL生防菌菌液于孔洞内。每处理设3次重复，25℃培养3-7d后测量抑菌带宽度，将具拮抗作用的菌株保存备用。
PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂16g，蒸馏水1000ml。
复筛：将初筛获得的拮抗菌株置牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48h，取各菌苔一环分别接入100mL种子培养液中培养24h作种子液，再分别吸取100μL种子液注入150ml菌剂发酵培养液中，于摇床中180r/min、26℃的条件下培养24h。取各培养液于10000r/min离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤得上清滤液，吸取各上清滤液与温度约为45℃的PDA培养基混合制成含上清滤液浓度为8％的平板，采用生长速率法筛选出对人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌菌丝生长抑制作用最强的菌株，得到目标菌株N2。
牛肉膏蛋白胨固体培养基配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
菌株发酵种子培养用液体培养基配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
菌剂发酵培养液配方：葡萄糖20.0g，蛋白胨50.0g，甘油5.0g，K2HPO4·3H20 1.5g，和MgSO4·7H20 1.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
1.3暹罗芽孢杆菌N2菌株的鉴定
形态观察结果表明，菌株N2在NA培养基上形成乳白色菌落，不透明，菌落中心突出，质地湿润且边缘平滑。N2菌株革兰氏染色阳性，细胞呈短杆状，大小0.7～0.8×1.0～2.0μm，能产生椭圆形芽孢，如图1所示。N2菌株能液化明胶，水解淀粉、V-P试验、硝酸盐还原、葡萄糖氧化发酵等反应呈阳性；接触酶试验、丙二酸盐利用、吲哚产生、苯丙氨酸脱氨酶等反应呈阴性。16S rDNA和gyrB序列分析结果表明，该菌的16S rDNA和gyrB序列与已报道的暹罗芽孢杆菌具有较高的99％相似性。此外，采用BD Phoenix-100微生物自动鉴定系统对菌株N2进行鉴定，根据微生物鉴定专家数据库信息设计鉴定反应最佳组合进行鉴定，置信度值为99％。综上，通过形态特征、生理生化反应、分子鉴定及BD Phoenix-100微生物自动鉴定系统对菌株N2进行鉴定，将菌株N2鉴定为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。
实施例2暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2菌剂的制备
(1)菌株活化：将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2接种于固体培养基上，于28℃下培养1-2天；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于26℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：按4％的接种量，将上述种子液接入发酵培养液中，于26℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得暹罗芽孢杆菌N2的菌剂(活菌数约为6.0×108CFU/mL)。
菌株活化培养用固体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
菌株发酵种子培养用液体培养基配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
菌剂发酵培养液配方：葡萄糖20.0g，蛋白胨50.0g，甘油5.0g，K2HPO4·3H20 1.5g，和MgSO4·7H20 1.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
实施例3暹罗芽孢杆菌N2菌株对人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌菌丝生长以及分生孢子形成的抑制作用
采用平板对峙培养法测定暹罗芽孢杆N2菌株对上述3种人参根腐病菌的拮抗作用：采用直径8mm的打孔器将活化好的上述病原菌菌落制成相应尺寸的菌饼，无菌接种至PDA平板(直径90mm)的正中央，同时将已高温灭菌的移液枪枪头在距离中心部位25mm处对称两边打孔(直径8mm)，继而将菌株N2制成菌悬液(浓度约为108CFU/mL)，每孔点接20μL菌悬液，作为处理组；将只接靶标菌设置为对照组，在对照组的打孔处点接20μL无菌水，每个处理重复3次，放于25℃恒温培养箱中培养7天，待对照组病原菌菌落长满平板，测量处理组病原菌菌落直径(单位：mm)，并按照如下公式计算抑菌率，并观察和记录各培养皿产生的孢子量数目。每种病原菌重复3次，结果取平均值。
抑菌率(％)＝[(对照直径-处理直径)/对照直径]×100。
注：对照直径为对照组病原菌菌落直径；处理直径为处理组病原菌菌落直径。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的制备方法：称取去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加入水1000mL，调节pH为7.0。在沸水浴上加热20min，纱布过滤后加琼脂22g熔化后定容至1000mL，分装湿热灭菌(121℃，30min)。
上述用于接种到平板上的菌悬液的制备方法：保藏的暹罗芽孢杆(Bacillussiamensis)N2菌株通过平板划线方式活化1～2天后，用接种环取4块直径1cm的细菌菌落，接入到200mL含50mL牛肉膏蛋白胨培养液的三角锥形瓶中，于摇床中180r/min、26℃的条件下培养24h，制成浓度约为108cfu/mL的菌悬液。牛肉膏蛋白胨液体培养基配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。结果如图2、3、4和表1所示；
表1暹罗芽孢杆菌N2菌株对供试病原菌产孢量和菌丝生长的影响
从试验结果可以看出，N2对人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌均具有明显的抑制作用。特别是对强壮土赤壳菌菌丝生长抑制率达到67.25％，对腐皮镰孢菌和尖镰孢菌的菌丝生长抑制率为56.40～60.27％，且在N2菌株的作用下对3种病菌分生孢子的形成均有抑制作用，抑制率高达95.08％以上，反映出暹罗芽孢杆N2菌株对这3种病菌的菌丝生长具有明显的抑制作用，特别是对分生孢子的产生具有强烈抑制作用，针对强壮土赤壳菌的分生孢子产生抑制率达到99.70％，在N2的作用下，强壮土赤壳菌几乎不产孢，将减弱其扩散和传播的能力。
实施例4暹罗芽孢杆菌N2菌株对人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌分生孢子萌发的抑制作用
将暹罗芽孢杆菌N2菌株与培养基混合制成含菌PDA培养基(比例为1:9)，对照为加入相同体积的无菌水的无N2菌的PDA培养基中。采用高温灭菌的移液枪枪头在供试的人参病原菌的菌落边缘处打取菌饼，置于PDA平板中心。所有处理均置于25℃恒温箱培养至对照菌丝长满平板。将培养皿里的人参根部病原真菌用10毫升无菌水洗脱，用滤纸将菌丝过滤，将其放置在超景深显微镜下利用血球计数板，计算分生孢子产生量，并用无菌水配制浓度为1×104个/mL的上述3种人参根腐病菌孢子悬浮液。取不同浓度生防细菌的菌悬液与等量人参根腐病菌孢子悬浮液混合，空白对照为加无菌水的孢子悬浮液，装入4mL无菌管中，各处理重复3次。间隔一定时间镜检观察这3种病原菌的分生孢子的萌发的情况，当对照组孢子萌发率达到80％时，开始镜检处理组的孢子萌发情况，计算孢子萌发率及抑菌率。结果如图2、3、4和表2所示；
表2暹罗芽孢杆菌N2菌株对供试病原菌分生孢子萌发的影响
从试验结果可以看出，暹罗芽孢杆N2菌株对人参腐皮镰孢菌、尖镰孢菌和强壮土赤壳菌3种病菌的分生孢子萌发均有抑制作用，其中对强壮土赤壳菌的抑制效果最好，抑制率达到100％，对人参腐皮镰孢菌和尖镰孢菌的抑制效果分别达到59.19％和95.34％。在N2的作用下，强壮土赤壳菌的分生孢子完全丧失了萌发的能力，将减弱其再侵染循环的能力。
实施例5暹罗芽孢杆N2菌剂提高人参种子出苗率和对人参的促生作用
制备暹罗芽孢杆菌N2菌剂(26℃、180r/m培养24h，浓度约为3.0×108CFU/mL，制备方法同实施例2)。对照化学药剂为50％二氯异氰尿酸钠WP(四川润尔科技有限公司)，对照的生物菌剂为50亿CFU/g多黏类芽孢杆菌WP(山西省临猗中晋化工有限公司)。供试人参品种：大马牙种子及两年生栽子。人参种子试验设在吉林省抚松县抽水乡和吉林省长春市吉林农业大学人参试验基地。田间试验每个小区面积为5m2，小区排列为随机区组排列，每个试验设3次重复。药剂处理每小区喷液量5.0L，对照喷等量清水。细菌悬浮液采用分光光度计测OD600值，代入标准曲线后计算出其浓度，然后稀释至浓度为3.0×l08 CFU/mL。处理1：暹罗芽孢杆菌N2菌剂60mL/667m2；处理2：暹罗芽孢杆菌N2菌剂90mL/667m2；处理3：暹罗芽孢杆菌N2菌剂120mL/667m2处理4：50亿CFU/g多黏类芽孢杆菌WP 40mL/667m2，为生物菌剂对照；处理5：50％二氯异氰尿酸钠WP 90mL/667m2，为化学药剂对照，处理6：清水对照。选择人参连作地块，保证土壤中有足够的镰铇菌和锈腐菌。在种子播种和种栽前进行土壤消毒处理，每处理按照各处理用量精准施药，将药剂与干细土按1:10比例混合均匀制成药土，均匀撒施入参床，施药后立即用旋耕机将苗床土壤与药土混合均匀，然后播种。种子每小区播种100克，种栽每小区1500克。
检测暹罗芽孢杆菌N2菌剂对人参出苗率的影响。分别于对照出全苗后，每小区间隔取5点，每点2行取样约0.5m2，调查出苗株数并计算出苗率。出苗率(％)＝(出苗数/总株数)×100。结果如表3所示，
表3暹罗芽孢杆菌N2菌剂不同处理对人参种子出苗的影响(长春和抚松)
注：处理1：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·g-1，菌剂用量60mL/667m2；处理2：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·g-1，菌剂用量90mL/667m2；处理3：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·g-1，菌剂用量120mL/667m2；处理4：对照的生物菌剂为50亿CFU·g-1多黏类芽孢杆菌WP，菌剂用量40mL/667m2。处理5：对照化学药剂为50％二氯异氰尿酸钠WP，菌剂用量90mL/667m2；处理6：无菌水对照。
从试验结果可以看出，暹罗芽孢杆N2菌株对人参种子出苗具有一定促进作用，平均出苗率69.35％～71.65％，高于空白对照和对照的化学药剂和生物菌剂。其中在暹罗芽孢N2菌剂施药剂量为90mL/667m2的条件下在抚松和长春两地平均出苗率分别达到71.65％和61.89％，表现最佳。因此，暹罗芽孢杆N2菌剂对人参种子的出苗具一定促进作用。
测定暹罗芽孢杆菌N2菌剂对产量的影响。在收获期，采用五点取样的调查方式，每小区间隔取5点，每点2行取样约0.5m2，将人参挖出，称取各个处理人参鲜重，与对照相比有无增产效果。结果如表4所示；
表4暹罗芽孢杆菌N2菌剂对人参的促生作用(长春和抚松)
注：处理1：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量60mL/667m2；处理2：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量90mL/667m2；处理3：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量120mL/667m2；处理4：对照的生物菌剂为50亿CFU·g-1多黏类芽孢杆菌WP，菌剂用量40mL/667m2。处理5：对照化学药剂为50％二氯异氰尿酸钠WP，菌剂用量90mL/667m2；处理6：无菌水对照。
从试验结果可以看出，3.0×108CFU·mL-1暹罗芽孢杆菌N2菌剂以120mL/667m2剂量处理土壤，不同程度提高了人参根鲜重，与空白对照相比，增产率均有小幅增长，特别在抚松基地，N2处理后的增产率均略高于对照的生物菌剂50亿CFU·g-1多黏类芽孢杆菌WP和对照化学药剂50％二氯异氰尿酸钠WP。
实施例6暹罗芽孢杆N2菌剂对人参镰孢型根腐病的田间防治效果
实验处理同实施例5。播种出苗后1个月调查人参镰孢型根腐病的发生情况，每小区取5点，每点2行，记载发病株数，计算病株率(公式6-1)和防治效果(公式6-2)。病株率(％)＝[(播种的总株数-发病株数)/播种的总株数]×100(公式6-1)。防治效果(％)＝[(对照区发病率-防治区发病率)/对照区发病率]×100(公式6-2)。
暹罗芽孢杆N2菌剂对人参镰孢型根腐病田间防治效果试验结果见表5。
表5暹罗芽孢杆菌N2菌剂对人参镰孢型根腐病的田间防效(长春和抚松)
注：处理1：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量60mL/667m2；处理2：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量90mL/667m2；处理3：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量120mL/667m2；处理4：对照的生物菌剂为50亿CFU·g-1多黏类芽孢杆菌WP，菌剂用量40mL/667m2。处理5：对照化学药剂为50％二氯异氰尿酸钠WP，菌剂用量90mL/667m2；处理6：无菌水对照。
由表5可知，不同浓度处理N2菌剂对人参镰孢型根腐病均有一定防效。例如在抚松基地，120mL/667m2罗芽孢杆菌N2菌剂处理的防效最高，为75.49％，高于50亿cfu/g多黏类芽孢杆菌WP 40mL/667m2处理的防治效果，二者之间差异显著；与化学药剂50％二氯异氰尿酸钠WP的防治效果相当。长春和抚松实验基地的实验结果均显示120mL/667m2罗芽孢杆菌N2菌剂处理的防效较好，均优于对照的生防菌剂50亿CFU·g-1多黏类芽孢杆菌WP的防治效果，差异显著。表明暹罗芽孢杆N2菌剂对人参镰孢型根腐病具有较好的田间生物防治效果。
实施例7暹罗芽孢杆N2菌剂对人参锈腐型根腐病的田间防治效果
实验处理同实施例5。做货时每小区取5点，每点2行约0.5m2，将参根挖出，按以下分级标准记载，按公式(7-1)计算病害的病情指数和公式(7-2)防治效果。
分级标准如下：
0级：植株主根完整，无病斑；
1级：主根上有少量病斑(占根面积的1％～5％)；
3级：主根上病斑较多(占根面积的25％～50％)；
5级：主根上病斑数量多且大(占根面积的50％～75％)；
7级：主根上病斑连片，形成烧根现象，但植株并未死亡(占根面积的75％～100％)；
9级：根腐烂死亡，植株地上部分萎蔫或死亡。
病情指数＝Σ(各级病根数×各级代表值)/(调查总根数×最高级代表值)×100(7-1)
EF＝1-(CK-T)/CK(7-2)。其中EF为病害防治效果，T为防治区终期病情指数，CK为对照区病情指数。
暹罗芽孢杆N2菌剂对人参锈腐型根腐病的田间防治效果试验结果见表6。
表6暹罗芽孢杆菌N2菌株对人参锈腐型根腐病的田间防效(长春和抚松)
注：处理1：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量60mL/667m2；处理2：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量90mL/667m2；处理3：暹罗芽孢杆菌N2菌剂3.0×108CFU·mL-1，菌剂用量120mL/667m2；处理4：对照的生物菌剂为50亿CFU·g-1多黏类芽孢杆菌WP，菌剂用量40mL/667m2；处理6：无菌水对照。
由表6可知，长春和抚松实验基地的实验结果均显示不同浓度处理N2菌剂对人参的锈腐型根腐病菌强壮土赤壳菌具有一定防效。120mL/667m2罗芽孢杆菌N2菌剂处理的防效最高，均约为65％，高于有效成分含量为40mL/667m2的50亿cfu/g多黏类芽孢杆菌WP，差异显著。处理1：60mL/667m2罗芽孢杆菌N2菌剂、处理2：90mL/667m2罗芽孢杆菌N2菌剂的防效稍低，但是也具备一定的防效，均为61％以上，高于有效成分含量为40mL/667m2的50亿cfu/g多黏类芽孢杆菌WP，差异显著。长春和抚松的实验结果均表明暹罗芽孢杆N2菌剂不同处理浓度均对人参锈腐型根腐病具有较好的田间生物防治效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可对此作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2，其特征在于：其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.25423，保藏日期2022年7月27日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.如权利要求1所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2在防治人参根腐病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述人参根腐病由人参镰孢型根腐病菌腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖镰孢菌(F.oxysporium)和人参锈腐型根腐病菌强壮土赤壳菌(Ilyonectria robusta)所导致。
4.含有如权利要求1所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2的菌剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂的活菌数为108CFU/mL。
6.如权利要求4或5所述菌剂的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)菌株活化：将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2接种于固体培养基上，于28℃下培养1-2天；
(2)发酵种子培养：将活化菌株接种于液体培养基中，于26℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：将种子液接入发酵培养液中，于26℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)N2的菌剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述固体培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
步骤(2)中所述液体培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
步骤(3)中所述发酵培养液配方为：葡萄糖20.0g，蛋白胨50.0g，甘油5.0g，K2HPO4·3H20 1.5g，MgSO4·7H20 1.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中种子液的接种量为4％。
9.如权利要求4或5所述菌剂在防治人参根腐病中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述人参根腐病由人参镰孢型根腐病菌腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖镰孢菌(F.oxysporium)和人参锈腐型根腐病菌强壮土赤壳菌(Ilyonectria robusta)所导致。
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