CN105733984A

CN105733984A - 枯草芽孢杆菌及其在防治玉米小斑病方面的应用

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Publication number: CN105733984A
Application number: CN201610127870.4A
Authority: CN
Inventors: 丁婷; 苏博; 顾双月; 江海洋
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2036-03-07
Also published as: CN105733984B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在防治玉米小斑病方面的应用。本发明的一种防治玉米小斑病的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株为DZSY21；保藏名称为枯草芽孢杆菌；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年11月27日；保藏编号:CGMCC NO.11749。所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；本发明具有生长速度快、产孢量大，抗逆性强，抗菌性强，在玉米植株的叶片中能够定量定殖。

Description

枯草芽孢杆菌及其在防治玉米小斑病方面的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及枯草芽孢杆菌及其在防治玉米小斑病方面的应用。

背景技术

玉米小斑病(Southerncornleafblight)是世界玉米产区普遍发生的重要病害之一。目前，对小斑病的防治主要采用种植抗性品种和化学防治等方法。其中化学防治是控制玉米病害的关键技术之一，然而，过度使用化学杀菌剂容易引起生态环境污染和食品安全等问题。因此生物防治已逐步发展成为玉米，尤其是鲜食玉米的重要绿色防控技术。近年来，植物内生菌重要的生理、生态作用，在农业和医药领域中的巨大应用潜力，逐渐引起人们的广泛关注和重视。因此，以植物内生菌及其代谢产物作为农用价值的菌株和化合物所开展的研究正在兴起，由此而开发新的生物农药正在成为研究的热点和重点。

植物内生菌是自然界微生物的一个重要类群，其数量庞大且与宿主植物以及其他生物之间具有紧密的生态关系。由于内生菌生境的特殊性，其次生代谢产物非常丰富，从中筛选能够产生生物活性的代谢产物的菌株将具有更大的可行性，对于解决农作物病害的发生发展以及提高其抗逆能力等也提供了新的思路。目前，植物内生菌的研究主要集中在药用植物、农作物以及特殊生境植物等，从药用植物中筛选内生菌或其次生代谢产物来控制植物病害，仍是当前内生菌研究的主流之一。已有多项研究表明植物内生菌或其代谢产物在玉米小斑病病害防治中发挥着重要的作用。如马佳等人将哈茨木霉SH2303孢子悬浮液均匀喷施在玉米叶片，能有效防治玉米小斑病。王霞等人在玉米小斑病发病前喷洒青霉TS67菌株的发酵液，对盆栽玉米小斑病的防治效率达到53.34％。叶云峰等人在番茄中分离的内生枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，能分泌出环脂抗菌多肽，该物质对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等多种植物病原真菌和病原细菌有较强抑制作用。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶,具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力，是土壤和植物微生态优势种群之一，较其他微生物更具有开发为生物防控菌剂的潜力。

目前，缺乏一种抗菌性强的枯草芽孢杆菌及其在防治玉米小斑病方面的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种抗菌性强的枯草芽孢杆菌及其在防治玉米小斑病方面的应用。

为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株为DZSY21；保藏名称为枯草芽孢杆菌；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年11月27日；保藏编号:CGMCCNO.11749。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌的16SrDNA基因序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；

所述芽孢杆菌菌株的单菌落在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上为圆形，暗白色，不透明，边缘整齐，表面粗糙有褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，35-37℃培养18-24h后，镜检，菌体细胞呈短杆状，能运动；经革兰氏染色呈紫色，为阳性。

本发明所述的枯草芽孢杆菌株制备的枯草芽孢杆菌菌剂。

进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

(a)权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵培养物；

(b)权利要求1所得枯草芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；

(c)权利要求1所得枯草芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。

本发明所述枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌种子液制备：将枯草芽孢杆菌DZSY21接种于培养液中，将培养液50mL置于250mL三角锥形瓶中，搅拌速率为160r/min，于35-37℃培养12-16小时，至培养液OD₆₀₀为0.8-1.0，获得种子液；

(2)发酵菌剂制备：将上述枯草芽孢杆菌DZSY21种子液接种于发酵液体培养基中，将培养液350mL置于1L三角锥形瓶中，所述种子液的接种量为1.5％-2.5％，搅拌速率为160r/min，于35-37℃培养8-10小时，调节发酵液中枯草芽孢杆菌DZSY21的菌体浓度至1.0×10⁶-10⁷CFU/mL，获得枯草芽孢杆菌菌剂。

进一步地，在步骤(1)中，所述培养液为：10g蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、蒸馏水1L，pH7.2；

在步骤(2)中，所述液体培养基配方为：20g葡萄糖，5gL-谷氨酸，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钾，1g磷酸二氢钾，0.15mg六水硫酸亚铁，5.0mg一水合硫酸锰，0.16mg五水硫酸铜，1L蒸馏水，pH7.0；所述枯草芽孢杆菌DZSY21的菌体具有与玉米叶片共生的特点。

本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21在生产用于防治玉米小斑病的产品中的应用。

本发明所述的枯草芽孢杆菌菌剂在生产用于防治玉米小斑病的产品中的应用。

进一步地，所述玉米小斑病是由玉蜀黍平脐蠕孢Bipolarismaydis引起的。

本发明所述的枯草芽孢杆菌菌剂的使用方法，其特征在于：每片健康玉米叶片上喷洒枯草芽孢杆菌菌剂，所述含菌量为1.0×10⁶-10⁷CFU/mL，体积为5mL。

有益效果：本发明所公布的枯草芽孢杆菌DZSY21具有生长速度快、产孢量大，抗逆性强，抗菌性强，在玉米植株的叶片中能够定量定殖，能够与玉米叶片共生的特点，具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)枯草芽孢杆菌DZSY21菌体具有与玉米叶片共生的特点，比暴露于如强烈的日光、紫外光、暴风雨等恶劣环境的附生细菌具有稳定的生存环境，可以减缓寄主植物的防卫反应作用，作用更稳定持久。

(2)通过体外植物活体试验表明，本发明所述的枯草芽孢杆菌制剂对防治玉米小斑病害方面有较好的作用，可以有效地控制玉米小斑病的发生，减少损失。

(3)本发明最显著的特征是该菌株对植物病原真菌玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)生长有明显的抑制作用，该菌株发酵菌剂在施用对象表面能形成一层保护膜阻止玉米小斑病菌侵入，有效减少玉米小斑病的发生。

附图说明

图1为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)的菌落图片，在牛肉膏蛋白胨培养基上；

图2为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)同源性的系统发育树图；

图3为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制作用的图片；A为玉米小斑病菌菌落正常生长情况，B为枯草芽孢杆菌DZSY21对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制作用；

图4为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)对玉米小斑病菌菌丝形态的影响的图片；A为玉米小斑病菌的正常菌丝形态，B为枯草芽孢杆菌DZSY21处理后玉米小斑病菌菌丝形态，其中，a箭头所示为玉米小斑病菌正常菌丝形态，b和c箭头所示均为菌丝生长受到抑制的玉米小斑病菌异常菌丝形态；

图5为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)发酵菌剂对大田种植的玉米植株玉米小斑病的防治效果图；

图6为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)发酵菌剂对大田种植的玉米植株玉米小斑病病情指数的影响图；

图7为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)菌体与玉米叶片共生情况的图片，a箭头所示为叶绿体，b箭头所示为淀粉粒，c箭头所示为枯草芽孢杆菌DZSY21。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

本发明的一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株为DZSY21；保藏名称为枯草芽孢杆菌；所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)是从安徽省合肥市安徽农业大学校园中采集的杜仲植物叶片组织中采用内生细菌微生物分离技术分离获得的，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年11月27日；保藏编号:CGMCCNO.11749。

所述枯草芽孢杆菌的16SrDNA基因序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；

所述芽孢杆菌菌株的单菌落在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上为圆形，暗白色，不透明，边缘整齐，表面粗糙有褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，37℃恒温培养24h后，镜检，菌体细胞呈短杆状，能运动；经革兰氏染色呈紫色，为阳性。

本发明所述的枯草芽孢杆菌株制备的枯草芽孢杆菌菌剂。它是由所述的枯草芽孢杆菌菌株经过发酵制成，包含有枯草芽孢杆菌菌体及其次生代谢产物。其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

(a)权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵培养物；

(b)权利要求1所得枯草芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；

(c)权利要求1所得枯草芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。

本发明所述枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌种子液制备：将枯草芽孢杆菌DZSY21接种于培养液中，将培养液50mL置于250mL三角锥形瓶中，搅拌速率为160r/min，于35℃培养12小时，至培养液OD600为0.8，获得种子液。所述培养液配方为：10g蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、蒸馏水1L，pH7.2；

(2)发酵菌剂制备：将上述枯草芽孢杆菌DZSY21种子液接种于发酵液体培养基中，将培养液350mL置于1L三角锥形瓶中，所述种子液的接种量为1.5％，搅拌速率为160r/min，于35℃培养8小时，调节发酵液中枯草芽孢杆菌DZSY21的菌体浓度至1.0×10⁶CFU/mL，获得枯草芽孢杆菌菌剂。所述发酵液体培养基配方为：20g葡萄糖，5gL-谷氨酸，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钾，1g磷酸二氢钾，0.15mg六水硫酸亚铁，5.0mg一水合硫酸锰，0.16mg五水硫酸铜，1L蒸馏水，pH7.0；所述枯草芽孢杆菌DZSY21的菌体具有与玉米叶片共生的特点。

本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21在生产用于防治玉米小斑病的产品中的应用。所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)对玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)具有明显的抑制作用，能够高效地抑制植物病原真菌的生长。

本发明所述的枯草芽孢杆菌菌剂在生产用于防治玉米小斑病的产品中的应用。所述玉米小斑病是由玉蜀黍平脐蠕孢Bipolarismaydis引起的。

本发明所述的枯草芽孢杆菌菌剂的使用方法，每片健康玉米叶片上喷洒枯草芽孢杆菌菌剂，所述含菌量为1.0×10⁶-10⁷CFU/mL，体积为5mL。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于：

本发明所述枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

在步骤(1)中，枯草芽孢杆菌种子液制备：将枯草芽孢杆菌DZSY21接种于培养液中，将培养液50mL置于250mL三角锥形瓶中，搅拌速率为160r/min，于36℃培养14小时，至培养液OD₆₀₀为0.9，获得种子液；所述培养液配方为：10g蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、蒸馏水1L，pH7.2。

在步骤(2)中，发酵菌剂制备：将上述枯草芽孢杆菌DZSY21种子液接种于发酵液体培养基中，将培养液350mL置于1L三角锥形瓶中，所述种子液的接种量为2.0％，搅拌速率为160r/min，于36℃培养9小时，调节发酵液中枯草芽孢杆菌DZSY21的菌体浓度至3.0×10⁶CFU/mL，获得所述枯草芽孢杆菌菌剂。所述发酵液体培养基配方为：20g葡萄糖，5gL-谷氨酸，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钾，1g磷酸二氢钾，0.15mg六水硫酸亚铁，5.0mg一水合硫酸锰，0.16mg五水硫酸铜，1L蒸馏水，pH7.0。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于：

本发明所述枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

在步骤(1)中，枯草芽孢杆菌种子液制备：将枯草芽孢杆菌DZSY21接种于培养液中，将培养液50mL置于250mL三角锥形瓶中，搅拌速率为160r/min，于37℃培养16小时，至培养液OD600为1.0，获得种子液；所述培养液配方为：10g蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、蒸馏水1L，pH7.2。

在步骤(2)中，发酵菌剂制备：将上述枯草芽孢杆菌DZSY21种子液接种于发酵液体培养基中，将培养液350mL置于1L三角锥形瓶中，所述种子液的接种量为2.5％，搅拌速率为160r/min，于37℃培养10小时，调节发酵液中枯草芽孢杆菌DZSY21的菌体浓度至1.0×10⁷CFU/mL，获得所述枯草芽孢杆菌菌剂。所述发酵液体培养基配方为：20g葡萄糖，5gL-谷氨酸，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钾，1g磷酸二氢钾，0.15mg六水硫酸亚铁，5.0mg一水合硫酸锰，0.16mg五水硫酸铜，1L蒸馏水，pH7.0。

试验1

枯草芽孢杆菌DZSY21分离、纯化及鉴定

本发明的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)是从健康杜仲植物叶组织采用稀释平板法和平板划线法分离纯化获得的，分离方法为：

(1)细菌分离：健康杜仲植物叶组织的采集，安徽省合肥市安徽农业大学校园内采集杜仲植物的叶部组织。采集样品均保存在牛皮纸袋中，标明采集地点、时间和采集人。采集结束后当天直接用新鲜杜仲叶部组织进行分离。将采集的叶依次在浓度75％的酒精中浸泡30秒、在浓度1％的次氯酸钠溶液中浸泡1min；将浸泡过的叶用无菌水冲洗3-5次，阴干，得到消毒后的叶。将消毒后的叶定量称取1g，加入0.01mol/LPBS缓冲液定容至10mL，研磨至浆状，得到10^-1稀释倍数的样品悬浮液，继而将样品悬浮液稀释成10^-2、10^-3、10^-4倍稀释液，分别吸取10^-3、10^-4倍稀释液100uL溶液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，37℃恒温培养24h后挑取牛肉膏蛋白胨固体培养基上的不同形态的细菌菌落于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化细菌菌株，分别编号保存。

(2)玉米小斑病高效拮抗细菌的筛选

采用平板对峙培养法，用打孔器在玉米小斑病菌菌丝边缘打取直径为6mm的菌饼，接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中央，四周2.5cm处接种杜仲内生细菌，置28℃生化培养箱培养。逐日观察内生细菌对玉米小斑病菌的抑制作用，筛选抑菌作用最强的菌株，结果得到一株对玉米小斑病菌有很强拮抗作用的菌株，获得的杜仲内生细菌经过鉴定为枯草芽孢杆菌，编号为DZSY21，命名为BacillussubtilisDZSY21，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上生长，37℃恒温培养24h后，菌落圆形，暗白色，不透明，边缘整齐，表面粗糙有褶皱，如图1所示，斜面保存备用；图1为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)的菌落图片(在牛肉膏蛋白胨培养基上)；

所述枯草芽孢杆菌DZSY2116SrDNA基因序列已提交Genbank，登记号KP777560。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在Genbank中找到同源性非常高的相近菌株序列，与DZSY21菌株相似度最高的是Bacillussp.JU2(2010)(GU566326.1)，ITS序列同源性达到99％，表明菌株DZSY21为芽孢杆菌属微生物。在此基础上，对菌株DZSY21的gyrB基因序列进行分析，用BLAST软件将DZSY21菌株的gyrB基因序列与GenBank中己知序列进行比对，与DZSY21菌株相似度最高的是BacillussubtilisstrainSTC51，ITS序列同源性达到100％。在gyrB基因序列分析的基础上，通过MEGA4.1软件对枯草芽孢杆菌DZSY21与相关种构建系统发育树，进行系统发育分析，确定分离菌株的分类地位，图2为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)同源性的系统发育树图；结果如图2所示，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值。

所述0.01mol/LPBS缓冲液配方为：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾、蒸馏水1L，pH7.4；牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为：10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g氯化钠、15g琼脂，蒸馏水1L、pH7.2；马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方为：去皮马铃薯200g(洗净去皮,200g马铃薯切成小块，加水煮沸20-30min，八层纱布过滤，取汁液备用)，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水1000mL，pH值自然。使用前牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基均在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌20-30min。

试验2

枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)对玉米小斑病菌的抑菌活性

(1)枯草芽孢杆菌DZSY21的培养

将杜仲内生细菌枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)斜面接种至牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基活化，置于37℃恒温培养箱恒温培养24h。

(2)玉米小斑病菌的培养

取植物病原真菌玉米小斑病菌Bipolarismaydis的斜面培养物，接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上活化，在28℃恒温培养箱培养5天，待用。

(3)平板对峙培养法测定枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌活性

用内径为6mm的打孔器在培养了5天的玉米小斑病菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基边缘打孔，将打孔获得的菌饼置于未培养任何微生物的空白马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板(平板直径90mm)的中央，28℃恒温培养3天，然后在距该菌饼25mm处接种划线杜仲内生细菌枯草芽孢杆菌DZSY21，植物病原真菌玉米小斑病菌的对峙培养平板28℃恒温培养3天，实验中以不接种枯草芽孢杆菌作为对照，3个重复。枯草芽孢杆菌DZSY21与植物病原真菌玉米小斑病菌的对峙培养形态特征如图3所示。

当对照菌落直径达到60mm时，测量抑菌带宽度，观察抑菌带边缘和对照的玉米小斑病菌的菌丝形态，结果如图4所示。图4为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)对玉米小斑病菌菌丝形态的影响；A为玉米小斑病菌的正常菌丝形态，B为枯草芽孢杆菌DZSY21处理后玉米小斑病菌菌丝形态，其中，a箭头所示为玉米小斑病菌正常菌丝形态，b和c箭头所示均为菌丝生长受到抑制的玉米小斑病菌异常菌丝形态；

培养7d后观察，对抑菌带边缘的玉米小斑病菌菌丝进行显微观察，结果显示，图4为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制作用；A为玉米小斑病菌菌落正常生长情况，B为枯草芽孢杆菌DZSY21对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制作用；玉米小斑病菌菌丝部分产生畸形，节间缩短、变粗，菌丝顶端有膨大现象，生长受阻(图4-b和图4-c)，而正常的玉米小斑病菌菌丝体细长、光滑且均匀(图4-a)。

本发明试验1的牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基制备均同试验2。

内生细菌枯草芽孢杆菌DZSY21对病原真菌的拮抗性用拮抗指数来表示：

拮抗指数(％)＝[(对照组病原真菌半径—处理组病原真菌半径)/对照组病原真菌半径]×100％

试验结果见表1，枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)对供试的植物病原真菌玉米小斑病菌具有显著的抑菌作用。本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21对玉米小斑病菌的抗菌结果如表1所示，本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21对玉米小斑病菌的拮抗指数；

表1

试验3

枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)对大田栽培玉米植株小斑病的防治情况。

将玉米种子(昌7-2)依次用1％的次氯酸钠表面消毒10min，用无菌水冲洗3-5遍，然后置于铺有无菌湿滤纸的培养皿内，于25℃的恒温培养箱内催芽，待种子萌发后备用。实验田设于安徽农业大学教学实习基地农萃园(土壤为黄棕壤土)中，种植方式为垄栽种植，垄面宽70cm，垄距30cm，株距30cm，行距60cm，每垄栽植30粒处理过的玉米种子，共栽植6垄。待6垄玉米均长至抽雄期，分别于每垄选取长势相当的20棵玉米植株进行如下六种处理：

1.空白对照处理(CK)：玉米长至抽雄期，分别在20棵长势相当的玉米植株健康叶片上定量喷洒枯草芽孢杆菌DZSY21的发酵液体培养基，每个叶片表面喷洒5mL，24h后正常水肥管理。

2.植物病原菌玉米小斑病菌分生孢子液处理(B)：玉米长至抽雄期，分别在20棵长势相当的玉米植株健康叶片上喷洒浓度为1×10⁶cfu/mL玉米小斑病菌分生孢子悬浮液，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，正常水肥管理。

3.枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理组(S)：玉米长至抽雄期，分别将枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂(含菌量为1.0×10⁶CFU/mL)直接喷洒于20棵长势相当的玉米植株健康玉米叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，正常水肥管理。

4.在玉米叶片上先进行枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理，再接种玉米小斑病菌分生孢子悬浮液的混合处理组(SB)：玉米长至抽雄期，分别将枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂(含菌量为1.0×10⁶CFU/mL)直接喷洒于健康玉米叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，然后将玉米小斑病菌分生孢子悬浮液(含菌量为1.0×10⁸CFU/mL)分别接种于20棵玉米叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，对玉米植株进行正常水肥管理。

5.在玉米叶片上先接种玉米小斑病菌分生孢子悬浮液，再进行枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理的混合处理组(BS)：玉米长至抽雄期，分别将玉米小斑病菌分生孢子悬浮液(含菌量为1.0×10⁸CFU/mL)接种于20棵玉米植株的健康叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，再分别喷洒枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂(含菌量为1.0×10⁶CFU/mL)于玉米叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，对玉米植株进行正常水肥管理。

6.在玉米叶片上先进行多菌灵处理，再接种玉米小斑病菌分生孢子悬浮液的混合处理组(Y)：玉米长至抽雄期，分别将75％多菌灵可湿性粉剂用无菌水稀释500倍，将稀释500倍的多菌灵溶液直接喷洒于健康玉米叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，然后将玉米小斑病菌分生孢子悬浮液(含菌量为1.0×10⁸CFU/mL)分别接种于20棵玉米叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养24h后，对玉米植株进行正常水肥管理。

枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂按如下方法制备：

枯草芽孢杆菌DZSY21液体培养的发酵液体培养基制备：20g葡萄糖，5gL-谷氨酸，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钾，1g磷酸二氢钾，0.15mg六水硫酸亚铁，5.0mg一水合硫酸锰，0.16mg五水硫酸铜，1L蒸馏水，pH7.0；

枯草芽孢杆菌DZSY21的培养条件：枯草芽孢杆菌DZSY21种子液按1.5％接种量接种到枯草芽孢杆菌DZSY21的发酵液体培养基中，37℃培养10h，搅拌速率160r/min，得到的液体培养液即为含有枯草芽孢杆菌DZSY21的发酵菌剂。

每种处理重复20株健康玉米植株，每棵玉米植株选取上、中、下三部位的3片玉米叶片分别进行上述不同的六种处理。玉米小斑病病情级别分级标准：

0级：不发病；

1级：叶片上无病斑或仅在穗位下部叶片上有零星病斑，病斑占叶面积少于或等于5％；

3级：穗位下部叶片上有少量病斑，占叶面积6％-10％，穗位上部叶片有零星病斑；

5级：穗位下部叶片上病斑较多，占叶面积11％-30％，穗位上部叶片有少量病斑；

7级：穗位下部叶片或穗位上部叶片有大量病斑，病斑相连，占叶面积31％-70％；

9级：全株叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死。

发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)×100％；

病情指数＝∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100；

接种7天后对6种不同处理进行玉米小斑病发病率及病情指数调查。6种不同处理对玉米植株小斑病的防治效果如图5所示，图5为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisstrainDZSY21)发酵菌剂对大田种植的玉米植株玉米小斑病的防治效果；

经枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理的玉米叶片(S)与空白对照处理(CK)中的玉米叶片均生长健康，没有受到玉米小斑病菌的感染，且在玉米叶片上先进行枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理，再接种玉米小斑病菌分生孢子悬浮液的混合处理组(SB)能有效降低玉米小斑病的发病率，减少玉米小斑病对玉米的危害。

6种不同处理对玉米小斑病病情指数的影响如图6所示，经枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理的玉米叶片(S)与空白对照处理(CK)中的玉米叶片均生长健康，没有受到玉米小斑病菌的感染，病情指数均为0％，此外，在玉米叶片上先进行枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理，再接种玉米小斑病菌分生孢子悬浮液的混合处理组(SB)玉米小斑病的病情指数为11.56％，明显低于单独接种植物病原菌玉米小斑病菌分生孢子液处理(B)玉米小斑病的病情指数(41.45％)，显著优于经多菌灵可湿性粉剂和玉米小斑病菌混合处理的病情指数(23.26％)以及在玉米叶片上先接种玉米小斑病菌分生孢子悬浮液，再进行枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理的混合处理组(BS)玉米小斑病的病情指数(19.02％)，说明在玉米叶片上先进行枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理，在玉米叶片表面能形成一层保护膜阻止玉米小斑病菌侵入，有效减少玉米小斑病的发生。

试验4

枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)菌体在玉米叶片组织中的共生检测。

将玉米种子(昌7-2)依次用1％的次氯酸钠表面消毒10min，用无菌水冲洗3-5遍，然后置于铺有无菌湿滤纸的培养皿内，于25℃的恒温培养箱内催芽，待种子萌发后备用。实验田设于安徽农业大学教学实习基地农萃园(土壤为黄棕壤土)中，种植方式为垄栽种植，垄面宽70cm，垄距30cm，株距30cm，行距60cm，每垄栽植20粒处理过的玉米种子，共栽植2垄。待2垄玉米均长至抽雄期，分别于每垄选取长势相当的10棵玉米植株进行如下2种处理：

1.空白对照处理(CK)：玉米长至抽雄期，分别在10棵长势相当的玉米植株健康叶片上定量喷洒枯草芽孢杆菌DZSY21的发酵液体培养基，每个叶片表面喷洒5mL，12h后正常水肥管理。

2.枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理组(S)：玉米长至抽雄期，分别将枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂(含菌量为1.0×10⁶CFU/mL)直接喷洒于10棵长势相当的玉米植株健康玉米叶片上，每个叶片表面喷洒5mL，保湿培养12h后，正常水肥管理。

枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂制备方法同试验3中的枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂制备方法。

分别选取玉米植株的上、中、下三部位的叶片进行上述不同的二种处理，于18h对上述两种处理的玉米叶片进行取样，切取10mm×10mm组织，置入预冷的2.5％戊二醛固定液中，4℃预固定20min后，捞出置于灭菌的培养皿内(培养皿内已滴有预冷的2.5％戊二醛固定液)，在固定液中将组织切成2-5mm长，2-3mm宽，1mm厚的细条，将细条移入盛有预冷的2.5％戊二醛固定液的离心管中(离心管规格为2mL)，4℃固定过夜。

2.5％戊二醛固定液制备：10mL25％戊二醛溶液和50mL0.2M磷酸缓冲液(0.2M磷酸缓冲液的配制:磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.H₂O)2.6g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.12H₂O)29g，重蒸馏水定容至500mL，pH7.4)混合，加双蒸水定容到100mL，pH自然，4℃保存备用。

样本于安徽农业大学生物技术中心进行透射电镜观察(HT-7700透射电镜，加速电压80kV)，观察枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)菌体在玉米叶片组织中的生长情况。观察结果如图7所示，玉米叶片喷洒枯草芽孢杆菌DZSY21发酵菌剂处理组(S)18h后，与空白对照组(CK)相比，枯草芽孢杆菌DZSY21菌体能侵入玉米叶组织内部，在叶组织中广泛定殖(图7-S中箭头c所示)，而在未接种对照根组织中未发现该菌存在(图7-CK)。

图6为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)发酵菌剂对大田种植的玉米植株玉米小斑病病情指数的影响；

图7为本发明所述的枯草芽孢杆菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)菌体与玉米叶片共生情况，a箭头所示为叶绿体，b箭头所示为淀粉粒，c箭头所示为枯草芽孢杆菌DZSY21。

此外，枯草芽孢杆菌DZSY21的定殖对玉米叶组织和细胞结构无显著影响(图7-S中箭头a和b所示，对照为图7-CK)，叶绿体、淀粉粒均正常，说明枯草芽孢杆菌DZSY21与玉米叶组织能够形成和谐的共生关系。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims

1.一种防治玉米小斑病的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株为DZSY21；保藏名称为枯草芽孢杆菌；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年11月27日；保藏编号:CGMCCNO.11749。

2.根据权利要求1所述的防治玉米小斑病的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的16SrDNA基因序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；

3.权利要求1所述的防治玉米小斑病的枯草芽孢杆菌菌株制备的枯草芽孢杆菌菌剂。

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

(a)权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵培养物；

(b)权利要求1所得枯草芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；

(c)权利要求1所得枯草芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。

5.权利要求3所述枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌种子液制备：将枯草芽孢杆菌DZSY21接种于培养液中，将培养液50mL置于250mL三角锥形瓶中，搅拌速率为160r/min，于35-37℃培养12-16小时，至培养液OD₆₀₀为0.8-1.0，获得种子液。

(2)发酵菌剂制备：将上述枯草芽孢杆菌DZSY21种子液接种于发酵液体培养基中，1L三角锥形瓶装发酵液体培养基350mL，所述种子液的接种量为1.5％-2.5％，搅拌速率为160r/min，于35-37℃培养8-10小时，调节发酵液中枯草芽孢杆菌DZSY21的菌体浓度至1.0×10⁶-10⁷CFU/mL，获得枯草芽孢杆菌菌剂。

6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述培养液为：10g蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、蒸馏水1L，pH7.2；

在步骤(2)中，所述发酵液体培养基配方为：20g葡萄糖，5gL-谷氨酸，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钾，1g磷酸二氢钾，0.15mg六水硫酸亚铁，5.0mg一水合硫酸锰，0.16mg五水硫酸铜，1L蒸馏水，pH7.0。

7.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌DZSY21在生产用于防治玉米小斑病的产品中的应用。

8.权利要求3所述的枯草芽孢杆菌菌剂在生产用于防治玉米小斑病的产品中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，所述玉米小斑病是由玉蜀黍平脐蠕孢Bipolarismaydis引起的。

10.权利要求3或4所述的枯草芽孢杆菌菌剂的使用方法，其特征在于：每片健康玉米叶片上喷洒枯草芽孢杆菌菌剂，所述含菌量为1.0×10⁶CFU/mL，体积为5mL。