CN104513802A - 一种玉米内生枯草芽孢杆菌及其生防应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种玉米内生枯草芽孢杆菌及其生防应用，属于玉米病害防治技术领域。本发明所述该菌株为Bacillus subtilis BS0521，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏起始日期为2014年11月16日，保藏号为CCTCC NO：M 2014566，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明菌株对健康玉米苗具有促生作用，同时能增加根系活力，可作为玉米苗期的生物肥料；在离体条件下对玉米多种病害的病原菌能产生抑制作用，可作为生物型种衣剂有效防治纹枯病，同时可作为玉米小斑病的诱抗剂；在防治玉米纹枯病和诱抗玉米小斑病中应用。

Description

一种玉米内生枯草芽孢杆菌及其生防应用
技术领域
本发明属于玉米病害防治技术领域，尤其涉及一种玉米内生枯草芽孢杆菌及其生防应用。
背景技术
玉米是我国主要的粮食作物之一，种植面积和总产量仅次于小麦和水稻，居第三位。近年来，玉米除供食用外，还用作发展畜牧业的优质饲料和轻工业、医药工业的重要原料，因此玉米在国民经济的发展中处于重要地位。
近年来，随着气候的变迁，栽培制度的变革和品种的更换以及高淀粉品种的大面积种植，玉米的土传病害，尤其是纹枯病有逐年加重的趋势。一般年份发病率大约在10％-30％，严重年份甚至可以达到60％以上，致使玉米产量显著降低，所以土传病害已成为玉米稳产、高产的主要制约因素之一。土传病害的综合防治方法主要有种子处理、清除病残体、选育抗病品种及轮作等措施。但由于土传病害很难获得抗性材料，所以种子处理显得尤为重要。在玉米叶斑病防治方面，除了应用抗性品种、保健栽培和化学防治之外，仍缺少更为有效的防治技术，尤其是生物防治技术。因此，生物农药以其安全、无残毒、对人畜无害和对环境无污染等特点备受国内外科学家的关注。而内生细菌以其存在于植物体内，生存环境稳定，不易受到外界环境的影响等优势，在生物防治植物病害方面比叶际、根际的细菌具有更大潜力。
目前国内外的玉米生物防治研究基本上只针对单种病害，且防效不稳定，所以，本领域技术人员迫切需要能够有效防治玉米相关病害的多功能微生物新制剂的出现。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种玉米内生枯草芽孢杆菌。所述的玉米内生枯草芽孢杆菌能够有效防治玉米纹枯病和诱抗玉米小斑病。
本发明的另一目的在于提供上述玉米内生枯草芽孢杆菌的生防应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种玉米内生枯草芽孢杆菌，该菌株为Bacillus subtilis BS0521，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏起始日期为2014年11月16日，保藏号为CCTCC NO：M 2014566，保藏地址：中国武汉武汉大学。
本发明玉米内生枯草芽孢杆菌对健康玉米苗具有促生作用，同时能增加根系活力，可作为玉米苗期的生物肥料应用。
上述的玉米内生枯草芽孢杆菌在防治玉米纹枯病和诱抗玉米小斑病中的应用。可作为生物型种衣剂有效防治纹枯病，同时可作为玉米小斑病的诱抗剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明公开了一种防治玉米纹枯病和诱抗玉米小斑病的枯草芽孢杆菌菌株，经鉴定命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS0521，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014566。本发明菌株对健康玉米苗具有促生作用，同时能增加根系活力，可作为玉米苗期的生物肥料；在离体条件下对玉米多种病害的病原菌能产生抑制作用，可作为生物型种衣剂有效防治纹枯病，同时可作为玉米小斑病的诱抗剂。
附图说明
图1为菌株BS0521对玉米小斑病病原菌的拮抗活性结果图；其中：A为仅接种病原菌的对照组，B为接种BS0521后的处理组。
图2为BS0521诱导后PAL、POD和PPO活性结果图；其中：A为BS0521诱导后PAL的活性结果图，B为BS0521诱导后POD的活性结果图，C为BS0521诱导后PPO的活性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
如未特殊说明，实施例中的操作方法均为常规方法。
实施例1：枯草芽孢杆菌BS0521的分离及鉴定
本发明菌株枯草芽孢杆菌BS0521分离自甜玉米种子，具体操作方式如下：
(1)样品处理：准备浙凤甜2号玉米种子，经清水冲洗后，用30℃无菌水浸泡30min；
(2)表面灭菌：经无菌水冲洗后置于95％的酒精3min，消毒结束后立即用无菌水漂洗4次，同时取最后一次漂洗水120μL涂布于NA培养基(牛肉浸膏1g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，蔗糖10g，琼脂20g，水1000mL)，28℃培养72h，检测表面灭菌效果；
(3)分离：用灭菌剪刀将表面无菌材料剪成小块后，转入盛有1mL无菌水的离心管中，充分震荡，吸取菌悬液0.2mL涂布于NA培养基上，重复3次，28℃培养2-3d；
(4)纯化：挑取培养特征相异的单个菌落，经培养纯化后作为供试菌株。
将待测内生细菌菌株接种到PDA(马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL)培养基中央，在平板四周接入纹枯病病原菌，以仅接种病原菌的处理为对照，每个处理重复3次，观察菌落的生长变化，以抑菌圈大小判断拮抗程度。
挑选抑菌圈均大于10mm的供试菌，转接至NA培养基试管斜面上，连续接种，传代5次，挑取仍对纹枯病菌有较强拮抗效力的菌株进行温室盆栽筛选实验。具体如下：先用浓度为108CFU/ml的拮抗菌悬液浸泡1h，然后播种于花盆中，覆盖3％纹枯病菌的菌土。以不同拮抗菌处理作对照1，以拮抗菌处理后不接纹枯菌作对照2。每处理播5盆，每盆保留10株，20天后观察发病情况，选择防效最好的一株菌株保存于NA斜面上。
上述分离得到的菌株主要菌落形态及生物学特征如下：菌落形态为规则圆型，灰白色无光泽，不透明，菌落表面皱褶粗糙，低拱起，中间呈火山口状，边缘不整齐。革兰氏阳性，镜下视野内呈长丝状或链状。液体发酵24h后有芽孢出现，在液体基质中呈均匀混浊，不形成菌膜和菌环。专性好氧，不具凝乳作用，过氧化氢酶实验、硝酸盐还原实验、V-P实验阳性；苯丙氨酸脱氨酶实验、卵黄卵磷脂酶实验阴性；分解葡萄糖产酸不产气，能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素、明胶、淀粉。
结合如下的16S rDNA序列测定，将该菌鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为Bacillus subtilis BS0521，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏起始日期为2014年11月16日，保藏号为CCTCC NO：M 2014566，保藏地址：中国武汉武汉大学。
枯草芽孢杆菌BS0521 16S rDNA的序列测定结果()如下：
GGGGATGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAAGTGAACCGAAAT
实施例2：枯草芽孢杆菌BS0521对玉米根系活力及生物量的影响
用三区划线法将BS0521菌株接种于NA培养基上，挑取单菌落接种于NB液体培养基中，30℃，170r/min振荡培养，过夜，待用。BS0521菌悬液10 000r/min离心20min，小心吸取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得BS0521无菌滤液，待用。
分别以BS0521菌悬液和无菌滤液浸泡玉米种子30min，播种，以清水浸种作为对照。每处理重复5次，每重复30粒种子。出苗7d后统计出苗率。带根收获玉米植株，将植株根围土壤洗净，吸干水分。利用α-萘胺的方法测定玉米苗期的根系活力。分离植株的根和茎，分别称其鲜重，记录。将同一株玉米苗的根茎装入同一个玻璃培养皿，放置于60℃烘箱内，3天后烘干，分别称取根茎的干重，记录。
出苗率结果显示，BS0521菌悬液及其无菌滤液不影响玉米种子的出苗率(表1)。而BS0521菌悬液及其无菌滤液能显著提高玉米植株的根系活力，根对α-萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切关系，其氧化能力越强，表示根系活力越旺盛。生物量的评价以玉米植株根茎的鲜重和干重作为指标。根系越健壮，说明该作物的生长能力越旺盛；其地下部分/地上部分，即根茎比越大，说明该作物抗病害能力越强。表1实验结果显示：与清水对照相比，经BS0521菌悬液处理之后，玉米植株的鲜重和干重根茎比值有明显提高，且经无菌滤液处理后，其干重根茎比也显著提高。
表1 BS0521菌株处理对玉米植株出苗率、根系活力和生物量的影响
实施例3：枯草芽孢杆菌BS0521抑菌活性的广谱性测定
枯草芽孢杆菌BS0521抑菌活性的广谱性测定的病原靶标菌为大斑病菌、小斑病菌、茎腐病菌和纹枯病菌。该四种病害是目前玉米植株上主要流行的叶斑病和土传病害。具体操作方法如下：将病原菌在PDA培养基中间划直线培养，直线两边接种BS0521(如图1所示)，以仅接种病原菌的处理为对照，每个处理重复4次，观察菌落的生长变化，以抑菌圈大小判断拮抗程度。
结果显示，BS0521对玉米大斑病、小斑病和纹枯病菌均能产生显著的抑制效果，最大抑菌圈直径达33.71mm。可见，BS0521具有成为高效生防菌的巨大潜力。
实施例4：枯草芽孢杆菌BS0521对玉米小斑病的诱导抗性
按照实施例2的方法，待玉米苗长至2叶1心期时喷雾浓度为108CFU/mL的BS0521菌悬液和无菌滤液，以未处理玉米作为对照。5d后喷雾接种孢子浓度为107个/mL的小斑病病原菌菌悬液。在接种病原菌之后1d、3d、5d、7d采集玉米叶片，-20℃保存。每份样品中称取0.5g叶片，加入3.0mL磷酸缓冲液(50mmol/L；pH 7.8；含0.2mol/L EDTA，1％PVP)研磨均匀。12000rpm离心20min。取上清液，利用比色法测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性。
图2结果显示BS0521菌株处理对小斑病玉米苗的PAL活性没有影响；处理5天后，POD的活性显著高于对照，可见BS0521处理对小斑病玉米苗的POD活性能产生显著影响；处理3天后，PPO活性显著高于对照，但到第7天，处理与对照之间无显著差异，可见BS0521菌株对小斑病玉米苗PPO活性也能产生一定的影响。由此可见，BS0521菌株作为玉米小斑病的诱抗剂有广阔的开发前景。
实施例5：小区条件下枯草芽孢杆菌BS0521的防效测定
玉米种子用108CFU/ml浓度的BS0521菌悬液处理2小时后在温室育苗，操作方法参考实施例2。待玉米苗长至2叶1心期时，将玉米苗移栽至玉米纹枯病和小斑病高发地块，在移栽时每穴加100ml BS0521菌悬液(107CFU/ml)，对照处理加100ml无菌水，同时在玉米喇叭口期均匀喷雾接种浓度为108CFU/mL的BS0521菌悬液，喷雾量控制在5-10ml每株，对照处理喷无菌水。每处理50株玉米苗，肥水管理同正常年份，同时不使用任何化学农药处理。在玉米乳熟期调查并计算BS0521菌悬液的防效。
实验结果显示，对照处理的纹枯病和小斑病的病情指数分别为36.8和33.2，而经BS0521菌悬液处理的玉米植物，其纹枯病和小斑病的病情指数分别为16.0和15.4，由此可见，BS0521菌悬液对玉米纹枯病和小斑病的防治效果分别达到56.5％和53.6％以上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种玉米内生枯草芽孢杆菌，其特征在于：该菌株为Bacillus subtilisBS0521，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏起始日期为2014年11月16日，保藏号为CCTCC NO：M 2014566，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的玉米内生枯草芽孢杆菌作为玉米苗期的生物肥料应用。
3.权利要求1中所述的玉米内生枯草芽孢杆菌在防治玉米纹枯病和诱抗玉米小斑病中应用。
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