RU2689530C2 - Новая бактерия рода bacillus и ее применение - Google Patents
Новая бактерия рода bacillus и ее применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2689530C2 RU2689530C2 RU2017108599A RU2017108599A RU2689530C2 RU 2689530 C2 RU2689530 C2 RU 2689530C2 RU 2017108599 A RU2017108599 A RU 2017108599A RU 2017108599 A RU2017108599 A RU 2017108599A RU 2689530 C2 RU2689530 C2 RU 2689530C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- shriramensis
- bacillus subtilis
- mtcc
- antimicrobial
- composition
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 82
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title description 8
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 257
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 214
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 137
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 130
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 66
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims description 92
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 72
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 69
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 34
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 27
- 239000012871 anti-fungal composition Substances 0.000 claims description 9
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- -1 tryptosis Substances 0.000 claims description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 abstract description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 62
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 56
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 51
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 50
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 47
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 47
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 47
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 47
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 46
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 36
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 36
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 36
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 36
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 34
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 34
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 34
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 34
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 34
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 34
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 32
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 28
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 28
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 28
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 27
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 description 22
- 241000985513 Penicillium oxalicum Species 0.000 description 21
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 21
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 21
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 20
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 239000006013 carbendazim Substances 0.000 description 16
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 15
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 15
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 12
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 11
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 11
- 241000193410 Bacillus atrophaeus Species 0.000 description 10
- 208000016444 Benign adult familial myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 8
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 8
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 8
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 8
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 8
- 208000016427 familial adult myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 8
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 8
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 7
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 6
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 6
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 5
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 4
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 230000004763 spore germination Effects 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 244000000008 fungal human pathogen Species 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 2
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 2
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 2
- 241001495426 Macrophomina phaseolina Species 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N Novobiocin Natural products O1C(C)(C)C(OC)C(OC(N)=O)C(O)C1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000800294 Sarocladium oryzae Species 0.000 description 2
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 2
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 2
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 2
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 2
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 2
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 2
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 description 2
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 description 2
- 229960004755 ceftriaxone Drugs 0.000 description 2
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 2
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 2
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960000740 enrofloxacin Drugs 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 2
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960002950 novobiocin Drugs 0.000 description 2
- YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N novobiocin Chemical compound O1C(C)(C)[C@H](OC)[C@@H](OC(N)=O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N 0.000 description 2
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 2
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 2
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000019086 sulfide ion homeostasis Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 2
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 1
- 241000860705 Alternaria tomato Species 0.000 description 1
- 101710083587 Antifungal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 101000658138 Homo sapiens Thymosin beta-10 Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 244000061323 Lycopersicon pimpinellifolium Species 0.000 description 1
- 101100492653 Oryza sativa subsp. japonica AT15 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000589157 Rhizobiales Species 0.000 description 1
- 241000736285 Sphagnum Species 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034998 Thymosin beta-10 Human genes 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 241000589652 Xanthomonas oryzae Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 1
- 235000011124 aluminium ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- UMEAURNTRYCPNR-UHFFFAOYSA-N azane;iron(2+) Chemical compound N.[Fe+2] UMEAURNTRYCPNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- NUHCTOLBWMJMLX-UHFFFAOYSA-N bromothymol blue Chemical compound BrC1=C(O)C(C(C)C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C(=C(Br)C(O)=C(C(C)C)C=2)C)=C1C NUHCTOLBWMJMLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010958 polyglycerol polyricinoleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000654 sulfafurazole Drugs 0.000 description 1
- 150000004763 sulfides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- KMUJXIPRPXRPTP-DZBHQSCQSA-N testolic acid Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(O)[C@@H](CCC(O)=O)[C@@H]3CCC2=C1 KMUJXIPRPXRPTP-DZBHQSCQSA-N 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к штамму бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, проявляющему противомикробную и/или противогрибковую активность и активность, стимулирующую рост растений. Предложенный штамм имеет номер поступления MTCС-5674. Также предложен экстракт, обладающий противомикробной и/или противогрибковой активностью и полученный с применением указанного штамма. Предложена также композиция, содержащая указанный штамм бактерии и/или экстракт. Группа изобретений может быть использована для обработки против различных патогенных грибков и/или бактерий и стимуляции роста растений. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 25 ил., 18 табл., 7 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к новой бактерии, принадлежащей к семейству Bacillus, обозначаемой как Bacillus subtilis ssp. shriramensis, проявляющей противомикробную и/или противогрибковую и стимулирующую рост растений активность, к выделению и идентификации экстракта нового микроба, проявляющего противомикробную и/или противогрибковую, протеолитическую, амилолитическую активность, к композиции, включающей новую бактерию и/или экстракт, к способу ингибирования роста патогенных микробов и/или грибков путем контактирования патогенных микробов и/или грибков с эффективным количеством новой бактерии и/или к противомикробной и/или противогрибковой стимулирующей рост растений композиции и/или агенту и к их применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Атмосфера Земли, как известно, взаимодействует с находящимися в воздухе микроорганизмами, несмотря на высокую интенсивность освещенности, резкие перепады температуры, низкие концентрации органических веществ и недостаток воды, делающими окружающую среду непригодной для размножения микробов. Биологический материал может составлять приблизительно 20%, 22% и 10% от общего количества содержащихся в воздухе частиц по объему в удаленных континентальных, заселенных континентальных и отдаленных морских условиях окружающей среды, соответственно. Большинство из них происходит из природных источников, таких как почва, озера, животные и человек. Кроме того, методы ведения сельского хозяйства, медицинские пункты и промышленные операции, такие как очистка сточных вод, выращивание животных, процессы ферментации и обработка растительных пищевых продуктов также являются источниками поступления жизнеспособных микроорганизмов в окружающую среду.
Бактерии составляют большую долю одноклеточных, прокариотных микроорганизмов. Как правило, составляя несколько микрометров в длину, бактерии имеют широкий диапазон форм, начиная от кокков до палочек и спиралей. Бактерии широко распространены на Земле, размножаясь в почве, кислых горячих источниках, радиоактивных отходах, воде и глубоко в земной коре, а также в органическом веществе и живых организмах растений и животных. Бациллы представляют собой грамположительные, спорулирующиеся, аэробные или факультативно анаэробные бактерии в форме палочек. Большинство бацилл являются сапрофитами. Каждая бактерия создает только одну спору, которая устойчива к нагреванию, охлаждению, радиации, высыханию и дезинфицирующим средствам. Бациллы проявляют множество физиологических характеристик, что позволяет им жить в широком диапазоне сред обитания, включая многие экстремальные места обитания, такие как пески пустыни, горячие источники и арктические почвы. Штаммы Bacillus могут быть термофильными, холодолюбивыми, ацидофильными, алкалифильными, солеустойчивыми или галофильными и способными к росту при различных значениях рН, температуры и концентрации солей.
Продукция противомикробных агентов, как представляется, является общим феноменом для большинства бактерий. Эти бактерии продуцируют превосходный набор микробных защитных систем, включая широкий спектр классических антибиотиков, метаболические побочные продукты, такие как органические кислоты, а также литические агенты, такие как лизоцим. Кроме того, продуцируется также несколько типов белковых экзотоксинов и бактериоцинов, которые представляют собой биологически активные пептидные фрагменты с бактерицидным механизмом действия. Биологический арсенал микробов примечателен своим разнообразием и природным изобилием.
Поиск новых противомикробных агентов является областью первостепенной важности. Развитие резистентности к антибактериальным агентам растет с угрожающей скоростью. Существующие решения включают разработку более рационального подхода к использованию антибиотиков и открытие новых противомикробных агентов.
Близкородственные патенты
1. Новые бактериальные штаммы и способы контроля над грибковыми патогенами (WO/2000/015761).
ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является предоставление новой бактерии, проявляющей противомикробную и/или противогрибковую и стимулирующую рост растений активность.
Целью настоящего изобретения является выделение и идентификация экстракта новой бактерии, где экстракт проявляет противомикробную и/или противогрибковую, стимулирующую рост растений активность.
Целью настоящего изобретения является предоставление противомикробной и/или противогрибковой и стимулирующей рост растений композиции или агента, где композиция или агент включает новую бактерию и/или экстракт новой бактерии.
Целью настоящего изобретения также является предоставление способа ингибирования роста патогенных микробов и/или грибов путем контактирования патогенных микробов и/или грибков с эффективным количеством новой бактерии и/или противомикробной и/или противогрибковой и стимулирующей рост растений композиции или агента, где композиция или агент включает новую бактерию и/или экстракт новой бактерии, и/или смесь новой бактерии и ее экстракта.
Целью настоящего изобретения также является обеспечение применения новой бактерии, противомикробной и/или противогрибковой композиции или агента, где композиция или агент включает новую бактерию и/или экстракт новой бактерии, и/или смесь новой бактерии и ее экстракта, для подавления роста патогенных микробов и/или грибков.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один из аспектов настоящего изобретения связан с предоставлением выделенной новой бактерию, которая пригодна для продукции противомикробных и/или противогрибковых метаболитов или агентов.
Один из аспектов настоящего изобретения связан с предоставлением новой формы бактерии, принадлежащей к виду Bacillus, которая обозначается как Bacillus subtilis ssp. shriramensis, номер поступления (MTCG-5674). В частности, новая бактерия, раскрытая в данной работе, способна проявлять отличные противомикробные и/или противогрибковые и стимулирующие рост растений свойства.
Еще один аспект настоящего изобретения состоит в создании способа получения противомикробной и/или противогрибковой и стимулирующей рост растений композиции или агента, где композиция или агент включает Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и/или экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Предлагается композиция Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). Композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемые наполнители, разбавители и/или носители.
Предлагается композиция, содержащая экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). Предлагается также композиция, содержащая водный экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). Композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемые наполнители, разбавители и/или носители.
Предлагается способ ингибирования роста патогенных микробов и/или грибков путем контактирования патогенных микробов и/или грибков с эффективным количеством Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) или экстракта Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и/или экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) может необязательно содержать один или более дополнительных противомикробных и/или противогрибковых и стимулирующих рост растений агентов.
В настоящем изобретении предлагается Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и/или экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) для составления противомикробной и/или противогрибковой и стимулирующей рост растений композиции или агента для подавления роста патогенных микробов и/или грибов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагается новый микроорганизм, принадлежащий к семейству Bacillus, обозначаемый как Bacillus subtilis ssp. shriramensis и имеющий номер поступления (MTCC-5674) и способ получения противомикробной и/или противогрибковой и стимулирующей рост растений композиции или агента, где композиция или агент включает Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и/или экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
В настоящем изобретении также предлагается способ ингибирования патогенных микробов и/или грибков путем контактирования микробов и/или грибков с эффективным количеством новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и/или композиции, включающей новую бактерию или ее экстракт.
В настоящем изобретении также предлагается применение Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и/или противомикробной и/или противогрибковой и стимулирующей рост растений композиции или агента, включающих новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и/или экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) для ингибирования патогенных микробов или грибков.
Новая Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) может быть использована для массированного получения противомикробной и/или противогрибковой и стимулирующей рост растений композиции/препарата/агента путем культивирования Bacillus subtilis ssp. shriramensis в подходящей ростовой среде в благоприятных условиях.
С помощью глубоких и тщательных исследований авторы изобретения неожиданно нашли, выделили и культивировали новую бактерию, которая может продуцировать новый агент. С помощью детально разработанных экспериментальных исследований авторы настоящего изобретения изобрели способ получения указанного нового агента из указанного нового микроорганизма.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СОПРОВОДИТЕЛЬНЫХ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 - Чашка, демонстрирующая выделение и очистку Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (A) Чашка с материнской культурой, демонстрирующая рост бактерии совместно с мицелием гриба; (B) Очистка Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) из бактериальных колоний в (A). Стрелка указывает предполагаемую бактериальную колонию.
Фиг. 2 - Клон одной из очищенных колоний Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), демонстрирующий ингибирование роста мицелия Fusarium oxysporum.
Фиг. 3 - Микроскопическое изображение вегетативных бактериальных клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) вместе со спорами.
Фиг. 4 - Чашка, демонстрирующая рост колоний Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 5 - Палочковидная Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) под световым микроскопом.
Фиг. 6 - Изображение, демонстрирующее результаты теста с каталазой: (A) негативный контроль; (B) позитивный контроль и (C) Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), демонстрирующая позитивные результаты в отношении активности каталазы.
Фиг. 7 - Чашка, демонстрирующая амилолитическую активность культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 8 - Чашка, демонстрирующая результаты теста O/F (окисления-ферментации) (A) негативный контроль; (B) Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), демонстрирующая изменение цвета только в верхней части среды; (C) позитивный контроль.
Фиг. 9 - Изображение, демонстрирующее результаты теста на продукцию сероводорода, (A) негативный контроль; (B) Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и (C) позитивный контроль.
Фиг. 10 - Изображение, демонстрирующее результаты SDS-PAGE концентрированного культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 11 - Культуральные чашки, демонстрирующие противомикробную и/или противогрибковую активность, проявляемую (A) колонией Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и (B) культуральным фильтратом Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). Культуру Fusarium oxysporum culture использовали в качестве тестируемого грибка.
Фиг. 12 - Изображение, демонстрирующее результаты определения MIC противомикробного и/или противогрибкового соединения с помощью метода разведения в пробирке. C 1 по C-2: изображения спор Fusarium oxysporum (наблюдаемых под световым микроскопом), после инкубации в PDB, содержащим различные концентрации противомикробного и/или противогрибкового агента. 1-18 (разведения с 1:1 до 1:100), C-1 - споры в противомикробном и/или противогрибковом агенте (неочищенные); C-2 - контроль (споры в бульоне без противомикробного и/или противогрибкового агента).
Фиг. 13 - Изображение, демонстрирующее результаты определения MIC противомикробного и/или противогрибкового агента методом диффузии в агаре. с 1 по С-2: изображения мицелия Fusarium oxysporum, растущего на чашках для тестирования. 1-28 Разведения противомикробного и/или противогрибкового агента от 1:1 до 1:100 (об./об.), C1 - лунка, содержащая противомикробный и/или противогрибковый агент (неочищенный); C2 - контрольная лунка, содержащая PDB; C3 - контрольная лунка, содержащая 70% насыщенный сульфат аммония.
Фиг. 14 - Изображение, демонстрирующее действие противомикробного и/или противогрибкового агента на споры Aspergillus niger. (A, B и C) Споры Aspergillus niger, демонстрирующие нормальное прорастание в средах PDB; (D) споры Aspergillus niger, не способные прорастать в средах PDB, содержащих экстракт Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 15 - Чашка, демонстрирующая противомикробную и/или противогрибковую активность клеточного лизата в отношении Fusarium oxysporum; (1) лунка, содержащая только лизоцим (для проверки действия лизоцима на грибок Fusarium oxysporum) и (2) лунка, содержащая клеточный лизат Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 16 - Чашка, демонстрирующая противомикробную и/или противогрибковую активность клеток/экстракта Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в отношении различных видов грибковых и бактериальных патогенов растений. A. Fusarium oxysporum, B. Sarocladium oryzae, C. Trichoderma viridae, D. Colletotrichum capsicii, E. Exerohilum turcicum, F. Rhizoctonia solani, G. Macrophomina phaseolina, H. Xanthomonas oryzae.
Фиг. 17 - Чашка, демонстрирующая результаты противомикробной и/или противогрибковой активности экстракта Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в отношении прорастания семян риса в присутствии Fusarium oxysporum. (A) Семена риса, обработанные грибковыми спорами Fusarium oxysporum; (B и C) семена риса, обработанные грибком Fusarium Oxysporum и экстрактом Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 18 - Чашка, демонстрирующая результаты экспериментов по демонстрации отсутствия патогенности Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в отношении различных видов растений. (А) рис, (B) хлопок, (С) табак, (D) кукуруза и (Е) томаты.
Фиг. 19 - Чашка, демонстрирующая результаты экспериментов по демонстрации действия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в качестве агента биологической защиты. (A) Растение томата инфицировали грибком Rhizoctonia solani (NFCCI-3194). (B) Растение томата с Rhizoctonia solani (NFCCI-3194) и Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и (С) контрольное растение томата (без Rhizoctonia solani fungus и Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 20 - Чашки, демонстрирующие (1) колонии грибков Penicillium oxalicum (NFCCI-1997) и (2) чистые колонии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 21 - Чашка, демонстрирующая зерна кукурузы, покрытые различными составами противомикробного/противогрибкового агента Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). 1. (Контроль-1) Семена, обработанные составом, в котором не содержится грибкового патогена и агента биологической защиты; 2. (Контроль-2) Семена, обработанные составом, в котором не содержится агента биологической защиты; 3. (Контроль-3) Семена, обработанные составом, который содержит коммерческий фунгицид «карбендазим WP50»; 4a. Семена, обработанные составом, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×104 КОЕ); 4b. Семена, обработанные составом, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×105 КОЕ); 4c. Семена, обработанные составом, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×106 КОЕ); 4d. Семена, обработанные составом, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×107 КОЕ); и 5. Семена, обработанные составом, который содержит клетки только Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×107 КОЕ).
Фиг. 22 - Чашка, демонстрирующая результаты активности в отношении биологической защиты через 2 недели инкубации. 1. (Контроль-1) Семена, обработанные составом-1, в котором не содержится грибкового патогена и противогрибкового агента; 2. (Контроль-2) Семена, обработанные составом-2, в котором не содержится агента биологической защиты; 3. (Контроль-3) Семена, обработанные составом-3, который содержит коммерческий фунгицид «карбендазим WP50»; 4a. Семена, обработанные составом-4a, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×104 КОЕ); 4b. Семена, обработанные составом-4b, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×105 КОЕ); 4c. Семена, обработанные составом-4c, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×106 КОЕ); 4d. Семена, обработанные составом-4d, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×107 КОЕ); и 5. Семена, обработанные составом-5, который содержит клетки только Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×107 КОЕ).
Фиг. 23 - Чашка, демонстрирующая результаты активности агента биологической защиты через 4 недели инкубации. 1. (Контроль-1) Семена, обработанные составом-1, в котором не содержится грибкового патогена и противогрибкового агента; 2. (Контроль-2) Семена, обработанные составом-2, в котором не содержится агента биологической защиты; 3. (Контроль-3) Семена, обработанные составом-3, который содержит коммерческий фунгицид «карбендазим WP50»; 4a. Семена, обработанные составом-4a, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×104 КОЕ); 4b. Семена, обработанные составом-4b, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×105 КОЕ); 4c. Семена, обработанные составом-4c, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×106 КОЕ); 4d. Семена, обработанные составом-4d, который содержит клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×107 КОЕ); и 5. Семена, обработанные составом-5, который содержит клетки только Bacillus subtilis ssp. shriramensis (5×107 КОЕ).
Фиг. 24 - Тест на противогрибковую и/или противомикробную активность против различных штаммов патогенных грибков человека. A, B и C - Тест на противогрибковую и/или противомикробную активность против Penicillium spp. (A) грибковые колонии Penicillium spp., (B) мицелий и (C) действие культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). D, E и F - Тест на противогрибковую и/или противомикробную активность против Aspergillus flavus (D) грибковые колонии (E) мицелий и (F) действие культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674). G, H и I - Тест на противогрибковую и/или противомикробную активность против Aspergillus niger. (G) грибковые колонии (H) мицелий и (I) действие культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674. J, K и L - Тест на противогрибковую и/или противомикробную активность против неизвестного грибка, вызывающего инфекцию кожи. (J) грибковые колонии (K) конидии и (L) действие культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Фиг. 25 - Действие состава Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) на рост и развитие кукурузы. Зерна кукурузы, обработанные составом, содержащим Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), характеризовались более высокой скоростью роста, биомассой и урожайностью зерна.
Выделение и идентификация новой бактерии
Авторы собрали образцы воздуха из 18 разных мест в Хайдарабаде и Патанчеру (Telangana, India) при проведении исследования флоры воздуха. Одноразовые чашки Петри, содержащие среду (T3 Medium, Travers, et al., 1987), готовили в лаборатории и подвергали воздействию воздуха в разных местоположениях. Экспонированные чашки герметизировали и инкубировали при 30°С в лабораторном инкубаторе. В одной из чашек, экспонированной с воздухом в области Патанчеру, наблюдалась колония бактерий, окруженная грибковым мицелием (фиг. 1A). Несмотря на продолжительную инкубацию, полоса безопасности поддерживалась, и рост мицелия грибов оставался ограниченным периферией полосы безопасности. Микроорганизмы из этой колонии были подвергнуты очистке с использованием стандартных методов микробиологии (фиг. 1B). Индивидуальные колонии тестировали против обычного грибка Fusarium oxysporum (фиг. 2).
Одна из колоний продемонстрировала ингибирование роста грибков, и была выявлена полоса безопасности (фиг. 2). Микроскопическое исследование бактерий из колонии выявило палочковидные подвижные бактерии (фиг. 5). Через шесть дней инкубации в культуральной среде бактерии продуцировали споры. Колонии бактерий были слизистыми, приподнятыми, круглыми, гладкими и от кремоватого до беловатого цвета (фиг. 4), и клетки показали вариабельную окраску по Граму (фиг. 5).
Проводили ряд биохимических тестов, включая сбраживание углеводов, активность каталазы, тест на окисление-ферментацию, гидролиз крахмала, тест на продукцию сероводорода, тест на активность оксидазы, тест на дезоксихолатном агаре. Результаты этих тестов подтвердили, что бактерия является позитивной в отношении каталазы, обладает активностью амилазы, сильно аэробна, не вырабатывает сероводород, позитивна в отношении оксидазы и вариабельна по окраске по Граму.
Для идентификации бактерии выполняли секвенирование 16S ДНК и анализ FAME. Результаты обоих исследований показали, что бактерия характеризуется 0,37% отличием в последовательности 16S ДНК и сходным показателем FAME 0,827 с Bacillus subtilis ssp. subtilis и 0,84% отличием в последовательности 16S ДНК и сходным показателем FAME 0,749 с Bacillus atrophaeus. Таким образом, эти результаты предполагают, что эта бактерия относится к Bacillus subtilis и Bacillus atrophaeus, но не идентична каким-либо штаммам бактерий, зарегистрированным в коллекции АТСС.
Результаты сравнения последовательностей 16S ДНК
Совпадение | % различий | Длина | Название при поступлении в библиотеку |
1 | 0,19 | 535 | Bacillus subtilis ssp. subtilis |
2 | 0,84 | 535 | Bacillus atrophaeus |
3 | 1,03 | 535 | Bacillus amyloliquifaciens |
Результаты сравнения с помощью анализа FAME
S. No. | Индекс сходства | Название при поступлении в библиотеку |
1 | 0,827 | Bacillus subtilis |
2 | 0,749 | Bacillus atrophaeus |
Выделенная бактерия является новым членом подвида рода Bacillus. В соответствии с бактериальной номенклатурной конвенцией новый бактериальный штамм был назван Bacillus subtilis ssp. shriramensis. Бактерия положена на хранение в коллекцию типов микробных культур (MTCC) в IMTECH, Chandigarh, India. Номером депозита этого нового штамма является (MTCC-5674).
Характерные свойства нового микроба, имеющего номер поступления/депозита (MTCC-5674), определенные с помощью настоящего изобретения
Бактерия является палочковидной с величиной 2,45×0,88 мкм, подвижной, спорообразующей, вариабельной при окраске по Граму; колонии являются гладкими, слизистыми, от беловатого до кремоватого цвета на ранних стадиях, но становятся морщинистыми при длительной инкубации. Бактерия превращается в спору при снижении питательных веществ в среде, как правило, процесс споруляции происходит при инкубации в течение 4 дней в 10 мл среды, содержащей 100 мкл 5×108 инокулированных клеток в культуральной пробирке 25×130 мм при 30°C и встряхивании при 200 об/мин.
Новая бактерия Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющая номер поступления (MTCC-5674), обладает противомикробной и/или противогрибковой активностью. Экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), обладает противомикробной и/или противогрибковой активностью. Диапазон потенциального применения и использования бактерии обширен.
В настоящем изобретении предлагается способ получения противомикробного и/или противогрибкового экстракта из новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674).
Получение и выделение противомикробного и противогрибкового агента
Состав культуральной среды для роста Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), является следующим
1. | Триптон | : 0,32% (масс./об.) |
2. | Триптоза | : 0,24% (масс./об.) |
3. | Экстракт дрожжей | : 0,18% (масс./об.) |
4. | NaH2PO4.H2O | : 0,044 M |
5. | Na2HPO4 | : 0,062 M |
6. | MnCl2 | : 0,0005% (масс./об.) |
pH=6,8
1. Среду получали согласно способу, представленному в приложении -I (I) и 100 мл аликвоты переносили в 500 мл конические колбы. Среду стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 15 минут.
2. В каждую колбу инокулировали единственную чистую колонию Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и инкубировали при 30°С, 200 об/мин в течение 60 часов.
Выделение противомикробного и противогрибкового агента из культуральной среды
После выращивания бактерий в T3 бульоне в течение 60 часов культуру центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Супернатант собирали и фильтровали с использованием 0,22 мкм фильтровальных дисков (Millipore/Sartorius). Фильтрат консервировали при подходящих условиях хранения для подробных экспериментов по изучению противомикробной и/или противогрибковой активности.
В настоящем изобретении конкретно предлагается новый микроорганизм Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющий номер поступления (MTCC-5674), и способ получения противомикробной и/или противогрибковой композиции из новой бактерии и/или ее экстракта или из смеси новой бактерии и/или ее экстракта.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается выделенная новая бактерия Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющая номер поступления (MTCC-5674), проявляющая противомикробную и/или противогрибковую активность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается новая бактерия, обозначаемая как Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющая номер поступления (MTCC-5674).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается чистая культура новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), где экстракт проявляет противомикробную и/или противогрибковую активность.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), где экстракт, проявляющий противомикробную и/или противогрибковую активность, представляет собой водный экстракт. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения экстракта новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), где способ включает выращивание новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), в питательной среде и выделение экстракта, проявляющего противомикробную и/или противогрибковую активность.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения экстракта новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), где способ включает выращивание новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), в аэробных условиях.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения экстракта новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), где способ включает выращивание новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis в питательной среде, выделение экстракта, проявляющего противомикробную и/или противогрибковую активность, и необязательно включает концентрирование экстракта с использованием традиционных методов.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющую номер поступления (MTCC-5674), где композиция проявляет противомикробную и/или противогрибковую активность.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), где композиция проявляет противомикробную и/или противогрибковую активность.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющую номер поступления (MTCC-5674), и экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), где композиция проявляет противомикробную и/или противогрибковую активность.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющую номер поступления (MTCC-5674), и/или экстракт указанной новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, или их сочетание, которая необязательно включает один или более противомикробных и/или противогрибковых агентов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), которая необязательно включает один или более противомикробных и/или противогрибковых агентов.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая сочетание новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), и ее экстракта, которая необязательно включает один или более противомикробных и/или противогрибковых агентов.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющую номер поступления (MTCC-5674), или экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), или их сочетание, которая необязательно включает сельскохозяйственно или фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющую номер поступления (MTCC-5674), которая необязательно включает сельскохозяйственно или фармацевтически приемлемый носитель.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), которая необязательно включает сельскохозяйственно или фармацевтически приемлемый носитель.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая сочетание новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), и экстракта указанной новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, которая необязательно включает сельскохозяйственно приемлемый носитель (смотри приложение III).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий, где указанный способ включает контактирование патогенных грибков и/или бактерий с эффективным количеством новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), или с композицией, включающей указанную новую бактерию или ее экстракт или их сочетание.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий, где указанный способ включает контактирование патогенных грибков и/или бактерий с эффективным количеством новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий, где указанный способ включает контактирование патогенных грибков и/или бактерий с эффективным количеством композиции, включающей новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющую номер поступления (MTCC-5674).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий, где указанный способ включает контактирование патогенных грибков и/или бактерий с эффективным количеством композиции, включающей экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), где экстракт проявляет противомикробную и/или противогрибковую активность.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий, где указанный способ включает контактирование патогенных грибков и/или бактерий с эффективным количеством композиции, включающей новую бактерию Bacillus subtilis ssp. Shriramensis (MTCC-5674) и экстракт указанной новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, где экстракт проявляет противомикробную и/или противогрибковую активность.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается применение новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), или композиции, включающей указанную новую бактерию, или ее экстракта или их сочетания для получения противомикробной и/или противогрибковой композиции для ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается применение новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674), для получения противомикробной и/или противогрибковой композиции для ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается применение композиции, включающей новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), для получения противомикробной и/или противогрибковой композиции для ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается применение композиции, включающей экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), для получения противомикробной и/или противогрибковой композиции для ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается применение композиции, включающей экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и экстракт указанной новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, для получения противомикробной и/или противогрибковой композиции для ингибирования роста патогенных грибков и/или бактерий.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается фармацевтически и сельскохозяйственно эффективная композиция, включающая новую бактерию Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющую номер поступления (MTCC-5674).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается фармацевтически и сельскохозяйственно эффективная композиция, включающая экстракт новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения указанной эффективной композиции из новой бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющей номер поступления (MTCC-5674).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения стадии и время, требуемое для получения указанной композиции/экстракта, характеризуются минимальной продолжительностью, связанной с максимальным выходом соединения.
Другие достоинства и преимущества настоящего изобретения
Бактерия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) вместе с противомикробным и/или противогрибковым агентом также продуцирует сильную термофильную протеазу и амилазу, которые активны даже после экспозиции при высокой температуре, т.е. 121°С в течение 15 мин.
Настоящее изобретение дополнительно объясняется с помощью последующих примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами каким-либо образом. Последующие примеры предназначены для иллюстрации осуществления изобретения и не предназначены для узкого применения любых ограничений объема настоящего изобретения. Специалисты в данной области техники должны понимать, что эквивалентные замены описанных в настоящем документе конкретных веществ или соответствующие улучшения рассматриваются как входящие в объем изобретения.
Подробные методы объясняются в последующих примерах:
Методы, применяемые в настоящей работе, хорошо известны в микробиологии, причем соответствующие параметры варьируются и оптимизируются для настоящего исследования.
Пример 1
1.1 Сбор и предварительный скрининг образцов
Отбирали образцы воздуха из разных местах в Хайдарабаде и Патанчеру (Telangana, India). Одноразовые чашки Петри, содержащие среду T3, готовили в лаборатории и подвергали воздействию воздуха в разных местоположениях. Экспонированные чашки герметизировали и инкубировали при 30°С в лабораторном инкубаторе. В одной из чашек, экспонированной с воздухом в области Патанчеру, наблюдалась колония бактерий, окруженная мицелием грибка.
1.2 Предварительный скрининг образцов воздуха на противомикробную и/или противогрибковую активность
Несмотря на продолжительную инкубацию, полоса безопасности поддерживалась, и рост мицелия грибов оставался ограниченным периферией полосы безопасности. Микроорганизмы из этой колонии были подвергнуты очистке с использованием стандартных методов микробиологии (фиг. 1B). Индивидуальные колонии тестировали против обычного грибка Fusarium oxysporum (фиг. 2). Одна из колоний продемонстрировала ингибирование роста грибков, и была выявлена полоса безопасности (фиг. 2).
Скрининг нового изолята
Микроскопическая оценка бактерий выявила, что они представляют собой палочковидные подвижные бактерии (фиг. 5). Через шесть дней инкубации в культуральной среде бактерии продуцировали споры.
Колонии бактерий были слизистыми, приподнятыми, круглыми, гладкими и от кремоватого до беловатого цвета (фиг. 4), и клетки показали вариабельную окраску по Граму.
Пример 2
2.1 Характеристика и идентификация нового микроорганизма
2.1.1 Характеристика нового изолята Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющего номер поступления (MTCC-5674)
Проводили ряд биохимических тестов, включая сбраживание углеводов, тест на активность каталазы, тест на окисление-ферментацию, гидролиз крахмала, тест на продукцию сероводорода, тест на активность оксидазы. Результаты этих тестов подтвердили, что бактерия является позитивной в отношении каталазы, позитивной в отношении амилазы, позитивной в отношении оксидазы и является сильно аэробной.
2.1.1.1 Морфология колонии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Колонии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) являются слизистыми, приподнятыми, круглыми, гладкими и от кремоватого до беловатого цвета (фиг. 4).
2.1.1.2 Характеристики культуры
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) демонстрируют оптимальный рост при 30°С (могут расти при от 15°С до 55°С). Так как они являются аэробными бактериями, для их роста требуется адекватное снабжение кислородом, необходимо постоянное перемешивание для культивирования в бульоне.
2.1.1.3 Клеточная морфология
Клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) являются палочкообразными, диплобацилльными и подвижными (фиг. 5).
2.1.1.3.1 Сравнение роста и морфологии колонии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) с ростом и морфологией колоний Bacillus subtilis и Bacillus atrophaeus
B. subtilis ssp. shriramensis | B. subtilis ssp, subtilis | B. atrophaeus | |
Морфология колонии | Слизистая, круглая, гладкая (неровная после длительной инкубации), 2,0-4,0 мм в диаметре. | Слизистая, круглая, однородная, непрозрачная, 2,0-4,0 мм в диаметре. | Непрозрачная, гладкая, круглая, однородная и 1,0-2,0 мм в диаметре (Nakamura L.K. 1989). |
Цвет колонии | От кремового до беловатого | От беловатого до коричневого | От темно-коричневого до черного |
2.1.1.4 Тест на каталазу
Материал
Культуральные пробирки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Перекись водорода
Метод
Три пробирки, содержащие среду LB, были помечены как «тест», «позитивный контроль» и «негативный контроль», петли, заполненные Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), Escherichia coli и Streptococcus pneumonia, инокулировали в соответствующие пробирки. После инкубации при 30°С в течение 24 часов добавляли несколько капель перекиси водорода во все пробирки и наблюдали за образованием пузырьков.
Результат
Пузырьки газа образовывались как в «тесте» так и в «позитивном контроле», указывая на то, что Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) является положительной в отношении каталазы (фиг. 6).
2.1.1.5 Гидролиз крахмала
Материал
Культуральный фильтрат Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Чашки крахмала-агара
Йод
Инкубатор
Метод
Крахмал-агаровую среду готовили согласно методу, приведенному в приложении - I (VI). Две лунки создавали на равных расстояниях в чашке, содержащей крахмал-агаровую среду, и помечали как «тест» и «негативный контроль». Аликвоты по 500 мкл каждого из Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), культурального фильтрата и стерильной дистиллированной воды вносили в лунки с надписью «тест» и «негативный контроль». Чашку инкубировали при 50°С в течение 4-х часов.
Результат
После 4 часов инкубации синий цвет, окружающий тестируемую лунку исчезал, указывая на то, что культуральный фильтрат Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) имеет амилолитическую активность. Никаких изменений в синем цвете не наблюдалось в области, окружающей контрольную лунку (фиг. 7).
2.1.1.6 Тест O/F (оксиления-ферментации)
Материал
Окислительно-ферментативная(ОФ)базальная среда Хью и Лейфсона
Пробирки для тестирования
Культура E. coli
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Инкубатор
Метод
Три пробирки, содержащие (ОФ)базальную среду Хью и Лейфсона (OFBM) (приложение - I (VII)), помечали как «негативный контроль», «позитивный контроль» и «тест», и петли, заполненные Alcaligenes faecalis, Escherichia coli и Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), инокулировали в соответствующие пробирки. Пробирки инкубировали при 30°С в течение 48 часов и наблюдали за изменением цвета.
Результат
Из наблюдений заключается, что тестируемый организм (Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)) строго аэробный, поскольку он не сбраживал углеводы (ни с образованием газа, ни с изменением цвета) глубоко внутри среды. Благодаря доступности кислорода, на поверхности среды наблюдалось некоторое изменение цвета. В то время как E. coli росла очень хорошо глубоко внутри среды и ферментировала углеводы (как с образованием газа, так и с изменением цвета среды), указывая на то, что она является факультативно анаэробной (фиг. 8). В негативном контроле не наблюдалось ни образования газа, ни изменения цвета.
2.1.1.7 Тест на продукцию сероводорода
Материал
Среда SIM (для определения сульфида, индола, подвижности)
Культуральные пробирки
Культура E. coli
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Инкубатор
Метод
Пробирки, содержащие среду SIM [среду для определения сульфида, индола, подвижности, {приложение - I (VII)}], были помечены как «отрицательный контроль» и «тест», и петли, заполненные E. coli и Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), инокулировали в соответствующие пробирки и инкубировали при 30°С в течение 24 часов и наблюдали за изменением цвета.
Результат
Из наблюдений заключается, что тестируемый организм является негативным в отношении продукции H2S, так как среда не чернеет. Тот же результат наблюдался для негативного контроля (фиг. 9).
2.1.1.8 Влияние рН на рост Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Культуральные пробирки, содержащие стандартную культуральную среду (LB), доведенную до различных значений рН в пределах от 3,4 до 11,0 (от кислой к основной), использовали для выращивания Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в стандартных условиях. Рост Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) наблюдался в диапазоне рН от 6,4 до 7,2 и оптимальный рН, как установлено, составлял 7,0.
2.1.1.9 Тест на чувствительность к антибиотикам Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
24-часовую культуру Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) распределяли по всей поверхности агара T3. Диски с различными антибиотиками помещали на поверхности чашек с агаром Т3, меченных соответствующим антибиотиком. Чашки инкубировали при 30°С в течение 24 часов.
Таблица 1. Исследование чувствительности к антибиотикам Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) RES - устойчива, INT - промежуточная чувствительность, SEN - чувствительна
S. No. | Антибиотик | Код | Зона | Результат | Стандарты | ||
RES | INT | SEN | |||||
1 | Ампициллин | A10 | 0 | RES | 13 | 14-16 | 17 |
2 | Гентамицин | G10 | 20 | SEN | 12 | 13-14 | 15 |
3 | Тобрамицин | TB10 | 15 | SEN | 12 | 13-14 | 15 |
4 | Карбенициллин | CB100 | 15 | RES | 19 | 20-22 | 23 |
5 | Ванкомицин | VA30 | 20 | SEN | <15 | 15 | |
6 | Оксациллин | OX1 | 11 | INT | 10 | 11-12 | 13 |
7 | Новобиоцин | NV30 | 24 | SEN | 17 | 18-21 | 22 |
8 | Сульизоксазол | SF300 | 33 | SEN | 12 | 13-16 | 17 |
9 | Амикацин | AK30 | 15 | INT | 14 | 15-16 | 17 |
10 | Канамицин | K10 | 13 | RES | 13 | 14-17 | 18 |
11 | Стрептомицин | S10 | 12 | INT | 11 | 12-14 | 15 |
12 | Цефалотин | CH30 | 40 | SEN | 14 | 15-17 | 18 |
13 | Хлорамфеникол | C30 | 25 | SEN | 12 | 13-17 | 18 |
14 | Эритромицин | E15 | 16 | INT | 13 | 14-22 | 23 |
15 | Энрофлоксацин | EX10 | 41 | RES | N/A | N/A | N/A |
16 | Линкомицин | L10 | 12 | RES | N/A | N/A | N/A |
17 | Амоксициллин | AC30 | 0 | RES | 19 | 20 | |
18 | Клиндамицин | CD2 | 10 | RES | 14 | 15-20 | 21 |
19 | Цефтриаксон | CI30 | 28 | SEN | 13 | 14-20 | 21 |
20 | Бацитрацин | B10 | 21 | SEN | 8 | 9-12 | 13 |
21 | Неомицин | N30 | 12 | RES | 12 | 13-16 | 17 |
22 | Азитромицин | AT15 | 10 | RES | 13 | 14-17 | 18 |
Результат
Из наблюдений заключается, что Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) устойчива к антибиотикам - ампициллину, карбенициллину, канамицину, энрофлоксацину, линкомицину, амоксициллину, клиндамицину, неомицину, азитромицину. Тестируемая бактерия чувствительна к гентамицину, тобрамицину, ванкомицину, новобиоцину, сульфизоксазолу, цефалотину, хлорамфениколу, цефтриаксону и бацитрацину и демонстрирует промежуточную устойчивость к оксациллину, амикацину, стрептомицину и эритромицину.
2.1.2 Идентификация нового изолята Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Для идентификации бактерии осуществляли секвенирование 16S ДНК и анализ FAME. Результаты обоих исследований показали, что бактерия характеризуется 0,37% отличием в последовательности 16S ДНК и сходным показателем FAME 0,827 с Bacillus subtilis ssp. subtilis и 0,84% отличием в последовательности 16S ДНК и сходным показателем FAME 0,749 с Bacillus atrophaeus. Таким образом, эти результаты предполагают, что эта бактерия относится к Bacillus subtilis и Bacillus atrophaeus, но не идентична каким-либо штаммам бактерий, зарегистрированным в коллекции АТСС.
2.1.2.1 Результаты сравнения последовательностей 16S ДНК
Совпадение | % различий | Длина | Название при поступлении в библиотеку |
1 | 0,19 | 535 | Bacillus subtilis ssp. subtilis |
2 | 0,84 | 535 | Bacillus atrophaeus |
3 | 1,03 | 535 | Bacillus amyloliquifaciens |
2.1.2.2 Результаты сравнения с помощью анализа FAME
S. No. | Индекс сходства | Название при поступлении в библиотеку |
1 | 0,827 | Bacillus subtilis |
2 | 0,749 | Bacillus atrophaeus |
Выделенная бактерия является новым членом рода Bacillus. В соответствии с бактериальной номенклатурной конвенцией новый бактериальный штамм был назван Bacillus subtilis ssp. shriramensis. Бактерия положена на хранение в коллекцию типов микробных культур (MTCC) в IMTECH, Chandigarh, India. Номером депозита этого нового штамма является (MTCC-5674).
Пример 3
3.1 Получение и скрининг противомикробного и/или противогрибкового агента
3.1.1 Получение противомикробного и/или противогрибкового агента
Материал
Бульон T3-1 л
Коническая колба - емкость 2 л
Канамицин (30 мкг/мл)
Инокулят Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Инкубатор-качалка (установленный на температуру 30°С и перемешивание при 200 об/мин)
Метод
Бульон T3 получали в соответствии с методом, описанным в приложении - I (1). 1 мл культуры Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) инокулировали в стерильный бульон T3 и инкубировали в инкубаторе-качалке при 30°С в течение 60 часов при перемешивании при 200 об/мин. После выращивания Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в бульоне T3 в течение 60 часов культуральную среду отделяли центрифугированием при 12000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Супернатант собирали и пропускали через 0,22 мкм фильтры для отделения каких-либо оставшихся бактериальных клеток. Фильтрат хранили при 4°С.
3.1.2 Скрининг культурального фильтрата, собранного на стадии 3.1.1, представленной выше, на противомикробную и/или противогрибковую активность
Материал
Культуральный фильтрат Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), содержащий противомикробный и/или противогрибковый агент
Чашки PDA
Канамицин (30 мкг/мл)
Тестируемый гриб Fusarium oxysporum
Инкубатор
Метод
Для тестирования активности противомикробного и/или противогрибкового агента в фильтрате, делали лунку в одном углу чашки агара PDA, в лунку помещали 500 мкл фильтрата. Петлю, заполненную грибом Fusarium oxysporum, инокулировали в другой угол той же самой чашки агара PDA и инкубировали в течение 5 дней при комнатной температуре. Ингибирующую активность фильтрата против гриба Fusarium oxysporum регистрировали по зоне ингибирования вокруг лунки в миллиметрах.
Результат
Чистая зона ингибирования в 14 мм наблюдалась вокруг лунки, предполагая, что метод, используемый для получения противомикробного и/или противогрибкового агента, является оптимальным.
3.2 Характеристика противомикробного и/или противогрибкового агента
Противомикробную и/или противогрибковую активность, связанную с Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), исследовали для установления природы агента, определяющего противомикробную и/или противогрибковую активность.
Материал
Бульон T3-1 л
Коническая колба - емкость 2 л
Канамицин (30 мкг/мл)
Инокулят Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Инкубатор-качалка
Метод
Бульон T3 получали в соответствии с методом, описанным в приложении - I (1). 1 мл аликвоту 24-часовой культуры Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) инокулировали в стерильный бульон T3 и инкубировали в инкубаторе-качалке при 30°С в течение 60 часов при перемешивании при 200 об/мин. После выращивания Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в бульоне T3 в течение 60 часов культуральную среду отделяли центрифугированием при 12000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Супернатант собирали и пропускали через 0,22 мкм фильтры для отделения каких-либо оставшихся бактериальных клеток.
3.2.1 Тестирование противомикробной и/или противогрибковой активности бактериальных клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Для тестирования активности противомикробного и/или противогрибкового агента, продуцируемого клетками, петлю, заполненную Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), инокулировали в один угол чашки с агаром T3, а петлю, заполненную грибом Fusarium oxysporum, инокулировали в другом углу той же самой чашки с агаром T3 и инкубировали в течение 5 дней при комнатной температуре. Ингибирующую активность бактериальных клеток против гриба Fusarium oxysporum регистрировали по зоне ингибирования вокруг бактериальной колонии в миллиметрах.
Результат
Чистая зона ингибирования в 14 мм (фиг. 11A) наблюдалась вокруг бактериальной колонии, предполагая, что активное соединение, секретируемое бактериальными клетками, диффундирует в культуральную среду, что ведет к образованию полосы безопасности вокруг бактериальной колонии.
3.2.2 Тестирование противомикробной и/или противогрибковой активности культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Для тестирования природы противомикробного и/или противогрибкового агента в фильтрате делали лунку в чашке агара PDA и в лунку помещали 500 мкл фильтрата. Петлю, заполненную грибом Fusarium oxysporum, инокулировали по диагонали в противоположный конец той же самой чашки агара PDA и инкубировали в течение 5 дней при комнатной температуре. Ингибирующую активность фильтрата против грибка Fusarium oxysporum регистрировали по зоне ингибирования вокруг лунки в миллиметрах.
Результат
Чистая зона ингибирования в 14 мм (фиг. 11B) наблюдалась вокруг лунки, предполагая, что фильтрат сохранял противомикробную и/или противогрибковую активность, указывая на то, что активное соединение секретируется из бактериальных клеток в культуральную среду.
3.3 Определение MIC противомикробного и/или противогрибкового агента Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
3.3.1 Лиофилизация противомикробного и/или противогрибкового агента
Материал
Культуральный фильтрат Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Сульфат аммония
Канамицин (30 мкг/мл)
Лиофильная сушка
Метод
Противомикробный и/или противогрибковый агент получали и очищали с помощью методов, представленных в 3.1.1. 800 мл аликвоту культурального фильтрата смешивали с 382,18 г сульфата аммония при 70% (масс./об.) насыщении (модифицированный протокол Jing et al., 2009), и раствор осторожно смешивали путем перемешивания в течение ночи при 4°С. Суспензию центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Осадок, полученный таким образом, подвергали лиофилизации в течение 24 часов в лиофильной сушке, и высушенный осадок хранили при комнатной температуре.
3.3.2 MIC противомикробного и/или противогрибкового агента Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Методы
3.3.2.1 Метод разведения в пробирке
3.3.2.2 Метод диффузии в агаре
Получение маточного раствора лиофилизованного противомикробного и/или противогрибкового агента
Маточный раствор получали путем растворения 1 г лиофилизованного порошка противомикробного и/или противогрибкового агента в 50 мл фосфатного буфера (рН 7,0). Конечную концентрацию маточного раствора доводили до 20 мкг/мкл. Маточный раствор использовали для получения разведений средой PDB в различных соотношениях, как представлено в таблице 1.
3.3.2.1 Метод разведения в пробирке
Материал
1,5 мл пробирки
Среда PDB
Маточный раствор противомикробного и/или противогрибкового агента
Суспензия спор Fusarium oxysporum
Метод
Определение MIC противомикробного и/или противогрибкового агента осуществляли в 1,5 мл пробирках. Различные разведения противомикробного и/или противогрибкового агента получали в среде PDB (таблица 2) в диапазоне от 10 мкг/мкл (1:1) до 198 нг/мкл (1:100). Определение MIC проводили против Fusarium oxysporum путем добавления 30 мкл (5×106 КОЕ/мл) суспензии спор во все пробирки и инкубации при 28°С в течение 2 дней при перемешивании при 180 об/мин.
Использовали три контроля, один с неразведенным маточным раствором противомикробного и/или противогрибкового агента, второй с 70% сульфатом аммония в PDB и третий только с PDB. Среду во всех трех пробирках инокулировали 30 мкл (5×106 КОЕ/мл) суспензией спор Fusarium oxysporum и инкубировали при 28°С в течение 2 дней при перемешивании при 180 об/мин.
3.3.2.2 Метод диффузии в агаре
Материал
Чашки PDA (картофельно-декстрозного агара)
Среда PDB (картофельно-декстрозного бульона)
Маточный раствор противомикробного и/или противогрибкового агента
Fusarium oxysporum
Метод
Определение MIC лиофилизованного противомикробного и/или противогрибкового агента Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) также осуществляли методом диффузии в агаре. В чашках PDA делали четыре лунки диаметром 9 мм каждая на равном расстоянии. Различные разведения противомикробного и/или противогрибкового агента получали в среде PDB (таблица 3) в диапазоне от 10 мкг (1:1) до 198 нг (1:100). Аликвоту 200 мкл каждого разведения помещали в лунку, помеченную соответствующим разведением. Тестируемый грибок Fusarium oxysporum инокулировали в центр среды PDA, и чашки инкубировали при 28°С в течение 4 дней.
В качестве контроля использовали чашку с тремя контролями, один, содержащий неразведенный маточный раствор противомикробного и/или противогрибкового агента, второй, содержащий только бульон PDB, и третий, содержащий PDB с 70% сульфатом аммония. Активность измеряли по ингибиторной зоне вокруг лунки в миллиметрах.
Результат
Метод разведения в пробирке (фиг. 12)
Образцы исследовали на прорастание спор через 48 часов инкубации под световым микроскопом. Споры не прорастали в пробирках, содержащих противомикробный и/или противогрибковый агент, в отношениях 1:1, 1:2, 1:3 и 1:4. Умеренное прорастание спор наблюдалось в пробирках, содержащих противомикробный и/или противогрибковый агент, в отношениях разведений 1:5, 1:6, 1:7, 1:8 и 1:9, и нормальное прорастание спор и образование мицелия наблюдалось в оставшихся пробирках, содержащих противомикробный и/или противогрибковый агент, в отношениях от 1:10 до 1:100 (таблица 2).
Таблица 2. Определение MIC противомикробного и/или противогрибкового агента с помощью метода разведения в пробирках
S.No. | Противомикробный и/или противогрибковый агент:PDB | Концентрация противомикробного и/или противогрибкового агента после разведения (мкг/мкл) | Суммарная концентрация противомикробного и/или противогрибкового агента, используемого на лунку в чашке агара (мкг/200 мкл) | Процент ингибирования грибов (зона ингибирования в мм) |
1 | 1:1 | 10,000 | 2000,00 | 92,30 (12) |
2 | 1:2 | 6,666 | 1333,20 | 84,61 (11) |
3 | 1:3 | 5,000 | 1000,00 | 76,92 (10) |
4 | 1:4 | 4,000 | 800,00 | 61,53 (8) |
5 | 1:5 | 3,333 | 666,60 | 46,15 (6) |
6 | 1:6 | 2,857 | 571,40 | 38,46 (5) |
7 | 1:7 | 2,500 | 500,00 | 23,07 (3) |
8 | 1:8 | 2,222 | 444,40 | 15,38(2) |
9 | 1:9 | 2,000 | 400,00 | 0 (0) |
10 | 1:10 | 1,818 | 363,60 | 0 (0) |
11 | 1:15 | 1,250 | 250,00 | 0 (0) |
12 | 1:20 | 0,952 | 190,40 | 0 (0) |
13 | 1:25 | 0,769 | 153,80 | 0 (0) |
14 | 1:30 | 0,645 | 129,00 | 0 (0) |
15 | 1:35 | 0,555 | 111,00 | 0 (0) |
16 | 1:40 | 0,487 | 97,40 | 0 (0) |
17 | 1:45 | 0,434 | 86,80 | 0 (0) |
18 | 1:50 | 0,392 | 78,40 | 0 (0) |
19 | 1:55 | 0,357 | 71,40 | 0 (0) |
20 | 1:60 | 0,327 | 65,40 | 0 (0) |
21 | 1:65 | 0,303 | 60,60 | 0 (0) |
22 | 1:70 | 0,281 | 56,20 | 0 (0) |
23 | 1:75 | 0,263 | 52,60 | 0 (0) |
24 | 1:80 | 0,246 | 49,20 | 0 (0) |
25 | 1:85 | 0,232 | 46,40 | 0 (0) |
26 | 1:90 | 0,219 | 43,80 | 0 (0) |
27 | 1:95 | 0,208 | 41,60 | 0 (0) |
28 | 1:100 | 0,198 | 39,60 | 0 (0) |
29 | Только противомикробный и/или противогрибковый агент | Неочищенный (20 мкг/мкл) | 4000,00 | 100 (13) |
30 | Только среда PDB | 0 | 0 | 0 (0) |
31 | Только сульфат аммония 70% | 0 | 0 | 0 (0) |
Метод диффузии в агаре (фиг. 13)
Ингибирование роста мицелия грибка наблюдали вокруг лунок, содержащих противомикробный и/или противогрибковый агент, в отношениях 1:1, 1:2, 1:3 и 1:4 (таблица 3). Умеренное ингибирование наблюдали вокруг лунок, содержащих противомикробный и/или противогрибковый агент, в отношениях разведений 1:5, 1:6 и 1:7 и никакого ингибирования не наблюдали при оставшихся разведениях (от 1:8 до 1:100) (таблица 3).
Заключение
Из приведенного выше эксперимента заключается, что противомикробный и/или противогрибковый агент в виде порошка неочищенного экстракта ингибирует прорастание спор, а также рост мицелия до разведения 1:4 (об./об.) зависимым от концентрации образом.
Таблица 3. Определение MIC противомикробного и/или противогрибкового агента с помощью метода диффузии в агаре
S. No. | Противомикробный и/или противогрибковый агент:PDB | Концентрация противомикробного и/или противогрибкового агента после разведения (мкг/мкл) | Суммарная концентрация противомикробного и/или противогрибкового агента, используемого на пробирку (мкг/200 мкл) | Прорастание спор |
1 | 1:1 | 10,000 | 2000,00 | Нет прорастания |
2 | 1:2 | 6,666 | 1333,20 | Нет прорастания |
3 | 1:3 | 5,000 | 1000,00 | Нет прорастания |
4 | 1:4 | 4,000 | 800,00 | Нет прорастания |
5 | 1:5 | 3,333 | 666,60 | Появление споровой трубочки |
6 | 1:6 | 2,857 | 571,40 | Рост споровой трубочки |
7 | 1:7 | 2,500 | 500,00 | Элонгация споровой трубочки |
8 | 1:8 | 2,222 | 444,40 | Рост мицелия |
9 | 1:9 | 2,000 | 400,00 | Удлинение мицелия |
10 | 1:10 | 1,818 | 363,60 | Компактный мицелий |
11 | 1:15 | 1,250 | 250,00 | Компактный мицелий |
12 | 1:20 | 0,952 | 190,40 | Компактный мицелий |
13 | 1:25 | 0,769 | 153,80 | Компактный мицелий |
14 | 1:30 | 0,645 | 129,00 | Компактный мицелий |
15 | 1:35 | 0,555 | 111,00 | Компактный мицелий |
16 | 1:40 | 0,487 | 97,40 | Компактный мицелий |
17 | 1:45 | 0,434 | 86,80 | Компактный мицелий |
18 | 1:50 | 0,392 | 78,40 | Компактный мицелий |
19 | 1:55 | 0,357 | 71,40 | Компактный мицелий |
20 | 1:60 | 0,327 | 65,40 | Компактный мицелий |
21 | 1:65 | 0,303 | 60,60 | Компактный мицелий |
22 | 1:70 | 0,281 | 56,20 | Компактный мицелий |
23 | 1:75 | 0,263 | 52,60 | Компактный мицелий |
24 | 1:80 | 0,246 | 49,20 | |
25 | 1:85 | 0,232 | 46,40 | Компактный мицелий |
26 | 1:90 | 0,219 | 43,80 | Компактный мицелий |
27 | 1:95 | 0,208 | 41,60 | Компактный мицелий |
28 | 1:100 | 0,198 | 39,60 | Компактный мицелий |
29 | Только противомикробный и/или противогрибковый агент | Неочищенный (20 мкг/мкл) | 4000,00 | Нет прорастания |
30 | Только среда PDB | 0 | 0 | Компактный мицелий |
31 | Только сульфат аммония 70% | 0 | 0 | Компактный мицелий |
3.4 Тестирование противомикробной и/или противогрибковой активности клеточного лизата нового изолята Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Материал
Чашки агара PDA
Бульон LB
Клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Лизоцим
Инкубатор
Методы
3.4.1 Лизис клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Бульон LB получали в соответствии с методом, описанным в приложении - I (3). Единичную колонию Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) инокулировали в стерильный бульон LB и инкубировали при 30°С в течение 24 часов. Через 24 часа инкубации вегетативные клетки собирали центрифугированием при 6500 об/мин, 4°С, клетки промывали три раза стерильной дистиллированной водой и индуцировали лизис клеток путем инкубации с лизоцимом при 37°С в течение 2 час. После лизиса суспензию центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин при 4°С для удаления разрушенных клеток. Супернатант собирали и пропускали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 4°С.
3.4.2 Тестирование противомикробной и/или противогрибковой активности клеточного лизата
Две лунки пробивали на двух диагональных концах агара PDA в чашке Петри и их метили, одну как «тест» и другую как «контроль». Аликвоту 500 мкл лизата добавляли к тестируемой лунке и 500 мкл только лизоцима добавляли к контрольной лунке. Тестируемый грибок Fusarium oxysporum инокулировали в середину агара PDA и инкубировали в течение 5 дней при комнатной температуре.
Результат
Клеточный лизат не проявлял противомикробной и/или противогрибковой активности (фиг. 15) против грибка Fusarium oxysporum, предполагая, что противомикробный и/или противогрибковый агент в первую очередь секретируется в среду.
Пример 4
4.1 Тестирование противомикробной и/или противогрибковой активности против других патогенных грибков
Материал
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Патогенные грибки растений
1. Rhizoctonia solani (вызывает заболевание эпидермиса у членов семейства пасленовых).
2. Sarocladium oryzae (вызывает гниль эпидермиса у риса).
3. Colletotrichum capsicii (вызывает антракноз у жгучего перца).
Exerohilum turcicum (вызывает фитофтороз turcicum).
Macrophomina phaseolina (вызывает угольную гниль).
Бульон T3
Чашки агара T3
Чашки агара PDA
Инкубатор
Метод
4.1.1 Тестирование противомикробной и/или противогрибковой активности клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) против различных патогенных грибков растений
Петлю, заполненную клетками Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и петлю, заполненную тестируемыми грибками, инокулировали в диагонально противоположные концы чашек T3, помеченных соответствующим грибком, и инкубировали при 28°С до наличия роста мицелия гриба поблизости от бактериальной колонии.
4.1.2 Тестирование противомикробной и/или противогрибковой активности фильтрата против различных патогенных грибков растений
Аликвоту 500 мкл культурального фильтрата, содержащего противомикробный и/или противогрибковый агент, добавляли к лункам, сделанным в агаре PDA, и петлю, заполненную тестируемыми грибками инокулировали в противоположном углу соответствующих чашек, меченных соответствующим грибком, и инкубировали при 28°С до наличия роста мицелия грибка поблизости от лунки, содержащей культуральный фильтрат.
Ингибиторную активность фильтрата против грибка-мишени регистрировали в миллиметрах в виде ингибиторной зоны, образуемой вокруг лунки.
Результат
Набор видов грибков, вызывающих заболевания растений, тестировали методом определения противомикробной и/или противогрибковой активности, и все они демонстрировали полное ингибирование роста в присутствии клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и также их культурального фильтрата.
4.2 Эффективность противомикробного и/или противогрибкового агента в отношении защиты семян риса от поражения грибками
Семена риса обрабатывали спорами Fusarium oxysporum и культуральным фильтратом Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и помещали в чашки Петри, содержащие простой агар, для проверки эффективности противомикробного и/или противогрибкового агента Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в отношении ингибирования поражения грибком прорастающих семян.
Контрольные семена обрабатывали только спорами Fusarium oxysporum.
Результат
В присутствии противомикробного и/или противогрибкового агента Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) грибок был не способен инфицировать семена, и семена риса прорастали нормально. Однако семена, обработанные только грибком, демонстрировали тяжелую инфекцию и были не способны прорастать (фиг. 17).
4.3 Тестирование патогенной природы Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) у растений
Материал
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в 1% КМЦ в распыляемой форме
Растения риса, хлопка, табака, кукурузы и томата
Распылитель
Метод
Культуру Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) тщательно тестировали на наличие патогенного воздействия, если таковое имеется, на ряд видов растений.
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) высевали в 1 л стерильного бульона LB в 2 л конической колбе и инкубировали при 30°С в течение 24 часов, встряхивая при 200 об/мин. После роста бактерий клетки собирали центрифугированием при 6500 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Осадок промывали дважды фосфатным буфером (рН 7,0) и доводили до суспензии в 1% КМЦ (карбоксиметилцеллюлозе) в фосфатном буфере (рН 7,0). Полученную суспензию использовали для распыления на сельскохозяйственные культуры, такие как рис, табак, кукуруза, томаты и хлопок.
Результат
Из наблюдений заключается, что все виды растений (рис, табак, кукуруза, томаты и хлопок), опрысканные Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), не проявляли каких-либо симптомов заболевания, и их рост и развитие были эквивалентны контрольным растениям, указывая на то, что Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) не является патогенной для видов растений (фиг. 18).
Пример 5
5.1 Составление противомикробных и/или противогрибковых композиций, содержащих клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в качестве агента биологической защиты.
Материал
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Бульон LB
PDB (картофельно-декстрозный бульон)
Фосфатный буфер (рН 7,0)
КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза)
Метод
5.1.1 Получение клеточной суспензии Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) инокулировали в 1 л стерильного бульона LB в 2 л конической колбе и инкубировали при 30°С в течение 24 часов, встряхивая при 200 об/мин. После роста Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) культуру центрифугировали при 6500 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Осадок промывали дважды фосфатным буфером (рН 7,0) и смешивали с 1% КМЦ (карбоксиметилцеллюлозой) в фосфатном буфере (рН 7,0) для получения суспензии, содержащей 6×107 КОЕ/мл. Суспензию, содержащую Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), использовали для распыления на растения и обработки корней растений рассады путем погружения.
5.1.2 Тестирование эффективности состава, содержащего противомикробный и/или противогрибковый агент, в отношении ингибирования заражения Rhizoctonia solani (NFCCI-3194) корней томатов
Материал
Суспензия, содержащая Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Грибок Rhizoctonia solani (NFCCI-3194) (вызывает заболевание эпидермиса у членов семейства пасленовых).
Традиционная почва
Рассада томатов
5.1.3 Получение Rhizoctonia solani (NFCCI-3194)
Rhizoctonia solani (NFCCI-3194) выращивали в среде картофельно-декстрозного бульона (полученном согласно методу, представленному а приложении - I (V) в течение 6 дней. После роста Rhizoctonia solani (NFCCI-3194) его осторожно смешивали с традиционной почвой и инкубировали в течение 15 дней при комнатной температуре. Традиционную почву, содержащую грибок, смешивали с почвой в отношении 1:1.
Рассада томатов
В настоящем исследовании использовали рассаду томатов длиной 10 см.
Метод
Эксперимент осуществляли, как описано ниже.
A. Рассаду томатов высаживали в почву, содержащую Rhizoctonia solani (NFCCI-3194), но не обработанную Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
B. Корни рассады томатов обрабатывали суспензией, содержащей Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), и высаживали в почву, содержащую Rhizoctonia solani (NFCCI-3194).
C. Рассада томатов без какой-либо обработки.
A. Обработка рассады клетками Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и грибком Rhizoctonia solani (NFCCI-3194)
Корни рассады томатов погружали в состав клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) на 30 мин. Обработанную рассаду высаживали в горшки, содержащие почву, смешанную с грибком Rhizoctonia solani (NFCCI-3194).
Контрольная рассада
Для индукции заболевания у рассады рассаду томатов (необработанную) высаживали в горшки, содержащие почву, смешанную с грибком Rhizoctonia solani (NFCCI-3194).
Для негативного контроля рассаду томатов (необработанную) высаживали в горшки, содержащие почву, не смешанную с грибком Rhizoctonia solani (NFCCI-3194).
Все горшки, содержащие рассаду томатов, переносили в теплицу и поддерживали до стадии плодоношения.
Результат
Из наблюдений заключается, что рассада, обработанная сочетанием Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и грибка Rhizoctonia solani (NFCCI-3194), росла очень хорошо, эквивалентно контрольному растению, тогда как рассада (необработанная), высаженная в горшок, содержащий грибок Rhizoctonia solani (NFCCI-3194), показала задержку роста, бедное цветение и плодоношение по сравнению с контролем. Следовательно, можно заключить, что Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) ингибировала рост грибка Rhizoctonia solani (NFCCI-3194) в прикорневой зоне рассады томатов и защищала рассаду от заболевания, вызываемого грибком (фиг. 19).
Пример 6
6.1 Оценка in vitro минимального количества клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), которое может контролировать инфицирование прорастающих зерен кукурузы почвенным и находящимся в зернах грибковым патогеном Penicillium oxalicum (NFCCI-1997).
6.1.1 Получение бактериальных и грибковых суспензионных культур
Материалы
a. Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
b. Penicillium oxalicum (NFCCI-1997) -патогенный гриб растений
c. Карбендазим WP50 (коммерческий фунгицид)
d. Бульон Luria Bertani (LB)
Метод
6.1.1.1 Получение суспензионной культуры Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Чистую колонию Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (фиг. 20-1) инокулировали в 10 мл бульона LB и инкубировали при 30°С в течение 24 час при 180 об/мин. Для получения состава биологической защиты 1 мл свежей культуры инокулировали в 100 мл бульона LB и инкубировали при 30°С в течение 24 час при 180 об/мин. Рост культуры отслеживали при периодическом измерении поглощения культуры при 625 нм. Бактериальные клетки собирали центрифугированием и промывали стерильным фосфатным буфером при центрифугировании при 5500 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Затем клетки суспендировали в 5 мл стерильного фосфатного буфера. Эту концентрированную суспензию использовали для получения составов биологической защиты.
6.1.1.2 Получение суспензионной культуры Penicillium oxalicum (NFCCI-1997) (грибкового патогена)
Чистую колонию Penicillium oxalicum (NFCCI-1997) (фиг. 20-2) высевали на чашку PDA и инкубировали при 28°С до образования спор. Петлю, заполненную спорами грибка, инокулировали в 100 мл PDB и инкубировали при 28°С в течение 7 дней при 180 об/мин. Водную часть культуры, содержащей споры грибка, собирали в 50 мл полипропиленовые пробирки. Споры промывали стерильным фосфатным буфером с помощью центрифугирования при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Споры суспендировали в необходимом объеме стерильного фосфатного буфера для получения КОЕ 6×104 мл-1.
6.1.2 Зараженность почвы Penicillium oxalicum (NFCCI-1997) (грибковым патогеном)
Для поддержания адекватной нагрузки спорами грибка почвенной среды 50 мл суспензией спор грибка (6×104 КОЕ/мл) смешивали с 1 кг автоклавированной традиционной почвой и инкубировали в течение 10 дней при 28°С. Традиционную почву, колонизированную грибком, равномерно смешивали с почвой в соотношении 1:1 и заполняли 96-чашечные лотки.
6.1.3 Получение состава Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) для биологической защиты от заболеваний растений, передающихся через почву
Материал
a. КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза)
b. Сахароза
c. Красный полимер (без фунгицида)
d. Клеточная суспензия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (агент биологической защиты)
e. Карбендазим (коммерческий фунгицид)
Для оценки эффективной концентрации клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), которая может подавлять рост и патогенность P. oxalicum (NFCCI-1997) на прорастающих зернах кукурузы, разработано четыре различных состава (подробности приведены в таблице ниже). Составы, содержащие только агент биологической защиты, только коммерческий фунгицид, и один состав без агента биологической защиты или фунгицида использовали в качестве контролей. Все составы содержат связующий материал - КМЦ (карбоксиметилцеллюлозу), источник углерода (сахарозу) и красный полимер (без фунгицида).
1. Контроль-1 (Состав без грибкового патогена и агента биологической защиты)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы и красного полимера. В этом составе нет агента биологической защиты, агентов, вызывающих заболевание, и фунгицида. Семена, обработанные этим составом, использовали в качестве контрольных семян.
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
2 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
3 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
4 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
2. Контроль-2 (состав с грибковым патогеном, но без агента биологической защиты)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы и красного полимера. Он не содержит агента биологической защиты/коммерческого фунгицида, но семена, обработанные таким составом, высеяны в почву с инокулированным грибком P. oxalicum (NFCCI-1997). Поскольку нет никакой биологической или химической защиты вокруг семян, грибок растет обильно, заражает семена, и у рассады развивается заболевание. Семена, обработанные этим составом, используются в качестве контролей с заболеванием.
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | P. oxalicum (NFCCI-1997) | Присутствует в почве | |
2 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
3 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
4 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
5 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
Контроль-3 (состав с коммерческим фунгицидом «карбендазимом WP50»)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы, красного полимера и коммерческого фунгицида карбендазима WP50 (торговое название Бавистин), который использовали в концентрации 500 мкг/мл (Mohiddin et al., 2013). Этот состав использовали для сравнения эффективности как агента биологической защиты, так и коммерческого фунгицида в отношении подавления роста грибка в непосредственной близости от прорастающих семян.
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | Карбенрдазим | 85,50 мкг | |
2 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
3 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
4 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
5 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
4а. Состав с Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×104 КОЕ)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы, красного полимера и клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×104 КОЕ/мл. Этот состав имеет минимальное количество клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | Клеточная суспензия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) | 100,00 мкл | 5×104 КОЕ/мл |
2 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
3 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
4 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
5 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
4b. Состав с клетками Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×105 КОЕ)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы, красного полимера и клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×105 КОЕ/мл.
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | Клеточная суспензия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) | 100,00 мкл | 5×105 КОЕ/мл |
2 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
3 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
4 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
5 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
4c. Состав с клетками Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×106 КОЕ)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы, красного полимера и клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×106 КОЕ/мл.
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | Клеточная суспензия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) | 100,00 мкл | 5×106 КОЕ/мл |
2 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
3 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
4 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
5 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
4d. Состав с клетками Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×107 КОЕ)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы, красного полимера и клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×107 КОЕ/мл. Этот состав имеет максимальное количество клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | Клеточная суспензия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) | 100,00 мкл | 5×107 КОЕ/мл |
2 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
3 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
4 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
5 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
5. Состав только с клетками Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×107 КОЕ)
Этот состав состоит из 1% КМЦ, 2% сахарозы, красного полимера и клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×107 КОЕ/мл. Этот состав имеет максимальное количество клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) и используется для исследования действия агента биологической защиты на прорастание семян и рост растения.
Состав
S. No. | Компоненты | Масса/объем/номер | Конечная концентрация |
1 | Клеточная суспензия Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) | 100,00 мкл | 5×107 КОЕ/мл |
2 | КМЦ | 1,71 мкг | 1,00% масс./об. |
3 | Сахароза | 3,42 мкг | 2,00% масс./об. |
4 | Красный полимер | 34 мкл | 19,88% об./об. |
5 | Вода | 31,87 мкл | - |
Суммарно | 171 мкл | - |
Таблица 4. Экспериментальный план в табличной форме
Обработка | Используемый материал | Клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (КОЕ/мл) | Споры P. oxalicum (NFCCI-1997) в почве (КОЕ/г) | Карбендазим (в мкг) | No. зерен кукурузы на обработку | ||
Исходно | Два повтора | Три повтора | |||||
*1 | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза (контрольные семена) | Нет | Нет | Нет | 20 | 20 | 20 |
*2 | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза (семена высеяны в почву, содержащую P. oxalicum (NFCCI-1997)) (контрольные семена) | Нет | 6×104 | Нет | 20 | 20 | 20 |
*3 | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+карбендазим (контрольные семена) | Нет | 6×104 | 85,50 | 20 | 20 | 20 |
*4a | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (концентрация-1) | 5×104 | 6×104 | Нет | 20 | 20 | 20 |
*4b | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (концентрация-2) | 5×105 | 6×104 | Нет | 20 | 20 | 20 |
*4c | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (концентрация-3) | 5×106 | 6×104 | Нет | 20 | 20 | 20 |
*4d | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (концентрация-4) | 5×107 | 6×104 | Нет | 20 | 20 | 20 |
*5 | Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) | 5×107 | Нет | Нет | 20 | 20 | 20 |
*1 (Контроль-1) - Состав без грибкового патогена и противогрибкового агента; *2 (Контроль-2) - состав с грибковым патогеном, но без агента биологической защиты; *3 (Контроль-3) - состав с коммерческим фунгицидом «карбендазимом WP50»; *4a - cостав с Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×104 КОЕ); *4b - cостав с Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×105 КОЕ); *4c- Состав с Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×106 КОЕ); *4d- cостав с Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×107 КОЕ); и *5- Состав только с Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (5×104 КОЕ).
Покрытие семян
Составами биологической защиты в соответствии с композициями, приведенными выше, покрывают зерна кукурузы (фиг. 21). Двадцать зерен кукурузы в трехкратном повторе (всего 60 зерен) для каждой обработки стерилизовали с поверхности 0,1% HgCl2 в течение 10 мин и промывали 95% этанолом и каждый раз промывали стерильной водой в течение 10 минут. Сухие семена покрывали 171 мкл/60 семян различными составами и высушивали на воздухе в течение 2 час.
Посев семян
Все обработанные семена сажали в 96-чашечные лотки в трех повторах на обработку. Все лотки содержались в теплице и поддерживались при контролируемых условиях. Начиная от прорастания семян и далее, лотки контролировались до 5 недель.
Регистрация данных
Процент прорастания
Процент прорастания всех семян после обработки регистрировали через 1 неделю после посева семян.
Случаи заболевания
Случаи заболевания регистрировали как процент через 4 недели после посева семян. Формула, используемая для регистрации случаев заболевания (Hoffman et al., 2002), выглядит следующим образом:
Результаты
Прорастание семян и выживание рассады
Оптимальное прорастание семян, т.е., 93,33%, 96,66%, 100,00%, 100,00%, 100,00% и 100,00% было зафиксировано в семенах, обработанных составами - 3 (контроль-3), 4с, 1 (контроль-1), 4b, 4d и 5, соответственно, затем 83,33% 33,33% в семенах, обработанных составами - 4a и 2 (контроль-2). Показатель выживаемости рассады через 4 недели после посева регистрировали как 100,00% в семенах, обработанных всеми составами, указанными выше, за исключением семян, обработанных композицией-3 (которая содержала коммерческий фунгицид), это ясно указывает на то, что коммерческий фунгицид «карбендазим WP50», хотя он был эффективным в подавлении роста грибка, но не был 100,00% эффективным. Составы, содержащие различные концентрации (кроме состава 4a-, который имел наименьшее количество клеток) клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), оказались 100,00% эффективными в защите семян от P. oxalicum (NFCCI-1997), присутствующего в почве.
Снижение скорости прорастания семян, обработанных составом - 4а (составом с наименьшей концентрацией бактериальных клеток, 50000 клеток/мл носителя), ясно указывает на то, что требуется базальная доза бактериальных клеток для придания защиты прорастающим семенам от P. oxalicum (NFCCI-1997), присутствующего в почве. Таким образом, состав-4b, который имеет концентрацию бактерий 5×105 КОЕ/мл (0,5 миллиона клеток/мл), придает хорошую защиту от P. oxalicum (NFCCI-1997) и дает 100% прорастание семян и показатель выживаемости всходов, такой же, как у контрольных семян.
Таблица 5. Определение эффективной концентрации (КОЕ/г носителя) клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) для подавления роста и патогенности P. oxalicum (NFCCI-1997).
Обработка | Концентрация клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (КОЕ/г) | Концентрация P. oxalicum (NFCCI-1997) (КОЕ/мл) | Концентрация карбендазима (мкг) | No. семян, высаженных в лоток | No. пророщенных семян (величины в %) |
Данные, зарегистрированные через 2 недели после посева | Данные, зарегистрированные через 4 недели после посева | Изменение в процентах (величины в %) | ||||
No. выжившей рассады (величины в %) |
No. погибшей рассады в результате болезни (величины в %) |
No. погибшей рассады без болезни (величины в %) |
No. выжившей рассады (величины в %) |
No. погибшей рассады в результате болезни (величины в %) |
No. погибшей рассады без болезни (величины в %) |
|||||||
1* | - | - | - | 60 | 60(100%) | 60 (100%) | 0 | 0 | 60 (100%) | 0 | 0 | 0 |
2* | - | 6×104 | - | 60 | 20(33,33%) | 0 (0%) | 20(100%) | 0 | 0 | 0 | 0 | -100 |
3* | - | 6×104 | 85,5 | 60 | 56(93,33%) | 54 (96,42%) | 2 (3.33%) | 0 | 54 (90%) | 0 | 0 | -10 |
4a* | 5×104 | 6×104 | - | 60 | 50 (83,33%) | 14 (28%) | 36 (72%) | 0 | 9 (18%) | 5 (10%) | 0 | -82 |
4b* | 5×105 | 6×104 | - | 60 | 60 (100%) | 60 (100%) | 0 | 0 | 60 (100%) | 0 | 0 | 0 |
4c* | 5×106 | 6×104 | - | 60 | 59(96,66%) | 59 (100%) | 0 | 0 | 59(100%) | 0 | 0 | 0 |
4d* | 5×107 | 6×104 | - | 60 | 60(100%) | 60 (100%) | 0 | 0 | 60 (100%) | 0 | 0 | 0 |
5* | 5×107 | - | - | 60 | 60(100%) | 60 (100%) | 0 | 0 | 60 (100%) | 0 | 0 | 0 |
*1- Зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза; *2- зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+P. oxalicum (NFCCI-1997); *3- зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+P. oxalicum (NFCCI-1997)+карбендазим; с *4а по 4d - зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+P. oxalicum (NFCCI-1997)+разные концентрации клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674); *5- зерна кукурузы+красный полимер+КМЦ+сахароза+Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674).
Случаи заболевания
Результаты исследования показали, что существуют значительные различия между обработками. Семена, обработанные составами 1, 4b, 4c, 4d и 5, не демонстрировали каких-либо симптомов заболевания и характеризовались здоровым ростом, сходным с контрольной рассадой, указывая на то, что агент биологической защиты Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), присутствующий в составах, существенно подавляет рост и патогенность грибка P. oxalicum (NFCCI-1997) и, таким образом, защищает семена от заражения грибком. Семена, обработанные с составом-3 (который содержит коммерческий фунгицид карбендазим 50WP), продемонстрировали уровень заболеваемости 3,57%, указывая на то, что хотя коммерческий фунгицид эффективен в отношении подавления роста грибка, но не так хорошо действует как агент биологической защиты, используемый в этом исследовании.
Таблица 6. Процент случаев заболевания рассады кукурузы, обработанной различными составами.
Обработка | Концентрация бактериальных клеток | Концентрация спор грибков в почве | Суммарное No. рассады | No. заболевшей рассады | Процент случаев заболевания |
1(контроль-1) | Нет | Нет | 60 | 0 | 0.00 |
2(контроль-2) | Нет | 6×104 | 20 | 20 | 100.00 |
3(контроль-3) | Нет | 6×104 | 56 | 2 | 3.57 |
4a | 5×104 | 6×104 | 50 | 41 | 82.00 |
4b | 5×105 | 6×104 | 60 | 0 | 0.00 |
4c | 5×106 | 6×104 | 59 | 0 | 0.00 |
4d | 5×107 | 6×104 | 60 | 0 | 0.00 |
5 | 5×107 | Нет | 60 | 0 | 0.00 |
Заболеваемость 82% и 100% зарегистрирована для семян, обработанных составами 4а и 2, соответственно. Результаты показывают, что плотность клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), присутствующих в составе 4а, не эффективна в подавлении роста грибка и, следовательно, прорастающие семена инфицируются грибком и погибают через 2 недели прорастания. Как и ожидалось, семена, обработанные составом 2, который не содержит ни агента биологической защиты, ни коммерческого фунгицида, продемонстрировали 100% случаев заболевания, указывая на то, что грибок инфицировал прорастающие семена и уничтожал рассаду в течение 2 недель прорастания.
Заключение
Приведенные выше результаты ясно показывают, что Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×105 КОЕ/мл (состав-4b) является эффективным в подавлении роста грибкового патогена и предоставляет 100% защиту прорастающей рассаде кукурузы. Следовательно, агент биологической защиты может быть с успехом использован для покрытия семян для эффективного контроля над находящимся в почве патогенным грибком P. oxalicum (NFCCI-1997).
Тестирование эффективности состава клеток Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в отношении стимуляции роста и урожайности растений
Материалы и методы
Материалы
1. Семена кукурузы, томатов и баклажанов, обработанные составом, как указано в 6.1.3 (4b).
2. Контрольные семена кукурузы, томатов и баклажанов.
Методы
Покрытие семян
Семена кукурузы, томатов и баклажанов обрабатывали составом, как указано в 6.1.3 (4b), и сушили на воздухе.
Посев семян
Обработанные и необработанные (контрольные) семена кукурузы, томатов и баклажанов, каждые в трех повторах, и каждая повторность включает 23 семени, высевали в поле площадью 4 метра. Поддерживались стандартные измерения расстояний, такие как 20 см от растения к растению и 60 см от ряда к ряду. Следовали соответствующим методам агрономии для выращивания этих культур до созревания.
Результаты
Наблюдалось значительное увеличение показателей роста и урожайности растений в полевых условиях. Семена, покрытые составом, содержащим клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), повышают урожайность кукурузы, баклажанов и томатов на 17,60, 37,15 и 1,58%, соответственно (таблица 7). Растения кукурузы, баклажанов и томатов продемонстрировали более высокие темпы роста, развития и накопления биомассы (репрезентативная картина различий обработанной и необработанной кукурузы приведена на фиг. 25). Более ранние сообщения о стимуляторах роста растений также доказали, что состав, содержащий Bacillus subtilis, усиливает рост растений и индуцирует системную устойчивость, защищающую от заболеваний, продуцируя 60 различных типов вторичных метаболитов (Compant et al., 2005 и Mohan Kumar et al., 2015).
Таблица 7. Влияние состава, включающего клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), на урожайность кукурузы, помидоров и баклажанов.
S.No. | Культура | Обработка | Выход |
1 | Кукуруза | 1% КМЦ, 2% сахароза, красный полимер и клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×105 КОЕ/мл (0,5 миллионов клеток/мл носителя) | 233,7 |
Контроль | 198,72 | ||
Повышение над контролем | 17,60% | ||
2 | Баклажаны | 1% КМЦ, 2% сахароза, красный полимер и клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×105 КОЕ/мл (0,5 миллионов клеток/мл носителя) | 727 |
Контроль | 457 | ||
Повышение над контролем | 37,15% | ||
3 | Томаты | 1% КМЦ, 2% сахароза, красный полимер и клетки Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) в концентрации 5×105 КОЕ/мл (0,5 миллионов клеток/мл носителя) | 860 |
Контроль | 847 | ||
Повышение над контролем | 1,58% |
Пример 7
7.1 Скрининг эффективности противогрибкового/противомикробного агента в отношении ингибирования роста патогенных грибков человека
Ряд штаммов грибков, вызывающих заболевания у человека, выделяли у людей, страдающих различными кожными и легочными инфекциями. Противогрибковую и/или противомикробную активность тестировали против всех выделенных патогенных грибков человека.
Материалы и методы
Материалы
1. Penicillium ssp.
2. Aspergillus flavus
3. Aspergillus niger
4. Aspergillus nidulans
5. Чашки PDA
6. Противогрибковый/противомикробный агент, выделенный из Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674)
Метод
Аликвоту 500 мкл культурального фильтрата, содержащего противомикробный и/или противогрибковый агент, добавляли в лунки, сделанные в агаре PDA, и петлю, заполненную тестируемыми грибками, инокулировали в другой угол соответствующих чашек, помеченных соответствующим грибком, и инкубировали при 28°С до момента выявления роста грибного мицелия поблизости лунки, содержащей фильтрат культуры.
Ингибирующую активность фильтрата против целевого грибка регистрировали в миллиметрах как ингибирующую зону, образованную вокруг лунки.
Результат
Ряд штаммов грибков, вызывающих заболевания у человека, выделяли у людей, страдающих различными кожными и легочными инфекциями, тестировали методом анализа противомикробной и/или противогрибковой активности, и все они продемонстрировали полное ингибирование роста в присутствии культурального фильтрата Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674) (фиг. 24).
Заключение
Из наблюдений заключается, что противогрибковый/противомикробный агент, выделенный из Bacillus subtilis ssp. shriramensis (MTCC-5674), может быть использован также в фармацевтических методах применения.
Ссылки
1. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C. and Barka, E.A. (2005). Use of plants growth promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: Principles, Mechanisms of action, and future prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71:4951-4959. Sci. World J., Vol 2012, pp. 001-012.
2. Hoffmann, W.A. and Poorter, H. 2002. Avoiding Bias in Calculations of Relative Growth Rate. Ann. Bot., Vol.90 (1), pp. 37-42.
3. Li, J. Yang, Q. Zhao, L-H, Zhang, S.M., Wang, Y.X. Xiao-yu and Zhao, X.Y. 2009. Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29. J. Zhejiang Univ. Sci. B.,Vol.10 (4) pp. 264-272.
4. Malusá, E. Sas-Paszt, L. and Ciesielska, J. 2012. Technologies for Beneficial Microorganisms Inocula Used as Biofertilizers.
Mena-Violante, H.G. and Olalde-Portugal, V. 2007. Alteration of tomato fruit quality by root inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Bacillus subtilis BEB-13bs. Sci. Hort.,Vol.1 (113), pp. 103-106.
6. Mohan Kumar, S.P., Chowdappa, P. and Krishna, V. (2015). Development of seed coating formulation using consortium of Bacillus subtilis OTPB1 and Trichoderma harzianum OTPB3 for plant growth promotion and induction of systemic resistance in field and horticultural crops. Indian Phytopath. 68 (1):25-31.
7. Mohiddin, F. A. and Khan, M. R. 2013. Tolerance of fungal and bacterial bio-control agents to six pesticides commonly used in the control of soil borne plant pathogens. Global J. Pests, Dis. Crop Prot., Vol. 1 (1), pp. 001-004.
Родственные патенты
1. Новый штамм Bacillus для контроля над болезнями растений и блошкой длинноусой. (EP981540A1).
2. Штамм Bacillus subtilis для сельскохозяйственного применения. (WO2009031874A1).
3. Противогрибковая Bacillus subtilis и содержащий ее порошок, смоченный микроорганизмом (KR2011075132A).
Приложение 1
Состав используемых культуральных сред
Примечание: Общий метод получения сред представлен ниже. Составы всех сред, представленные ниже, даны на объем 100 мл. Композиции изменяются в зависимости от требуемого количества.
(I) Получение бульона T3 (рН - 6,8)
Состав среды T3
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Триптон | 0,32% (масс./об.) |
2 | Триптоза | 0,24% (масс./об.) |
3 | Экстракт дрожжей | 0,18% (масс./об.) |
4 | NaH2PO4⋅H2O | 0,044 М |
5 | Na2HPO4 | 0,062 М |
6 | MnCl2⋅4H2O | 0,0005% (масс./об.) |
Метод
Все компоненты среды взвешивали и помещали в стеклянную колбу и растворяли в дистиллированной воде. Контейнер со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин.
(II) Получение чашек агара T3 (рН - 6,8)
Состав среды T3
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Триптон | 0,32% (масс./об.) |
2 | Триптоза | 0,24% (масс./об.) |
3 | Экстракт дрожжей | 0,18% (масс./об.) |
4 | NaH2PO4⋅H2O | 0,044 М |
5 | Na2HPO4 | 0,062 М |
6 | MnCl2⋅4H2O | 0,0005% (масс./об.) |
7 | Агар-агар | 2,0% (масс./об.) |
Метод
Все компоненты среды взвешивали и помещали в стеклянную колбу и растворяли в дистиллированной воде. Стеклянную колбу со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин. После автоклавирования среду заливали в стерильные чашки Петри.
(III) Получение бульона LB (рН - 7,0)
Состав среды LB
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Триптон | 1,0% (масс./об.) |
2 | Экстракт дрожжей | 0,5% (масс./об.) |
3 | NaCl | 1,0% (масс./об.) |
Метод
Все компоненты среды взвешивали и помещали в стеклянную колбу и растворяли в дистиллированной воде. Контейнер со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин.
(IV) Получение чашек с агаром LB (рН - 7,0)
Состав среды LB
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Триптон | 1,0% (масс./об.) |
2 | Экстракт дрожжей | 0,5% (масс./об.) |
3 | NaCl | 1,0% (масс./об.) |
4 | Агар-агар | 2,0% (масс./об.) |
Метод
Все компоненты среды взвешивали и помещали в стеклянную колбу и растворяли в дистиллированной воде. Стеклянную колбу со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин. После автоклавирования среду заливали в стерильные чашки Петри.
(V) Получение бульона PDB (рН - 6,0)
Состав среды PDB
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Порошок картофеля | 2,0% (масс./об.) |
2 | Декстроза | 2,0% (масс./об.) |
3 | Стрептомицин (необязательно) | 100 мкг/мл |
Метод
Порошок картофеля (2,0 г) взвешивали и помещали в 250 мл стеклянную колбу, содержащую 50 мл дистиллированной воды, и кипятили в течение 5 мин. Кипящую картофельную воду фильтровали с использованием муслиновой ткани. Фильтрат собирали в чистую 250 мл стеклянную колбу и в нее добавляли 2,0 г декстрозы. После доведения суммарного объема до 100 мл колбу со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин.
(VI) Получение чашек с агаром PDB (рН - 6,0)
Состав среды PDB
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Порошок картофеля | 2,0% (масс./об.) |
2 | Декстроза | 2,0% (масс./об.) |
3 | Агар-агар | 2,0% (масс./об.) |
4 | Стрептомицин (необязательно) | 100 мкг/мл |
Метод
Порошок картофеля (2,0 г) взвешивали и помещали в 250 мл стеклянную колбу, содержащую 50 мл дистиллированной воды, и кипятили в течение 5 мин. Кипящую картофельную воду фильтровали с использованием муслиновой ткани. Фильтрат собирали в чистую 250 мл стеклянную колбу и в нее добавляли 2,0 г декстрозы и 2,0 г агара. После доведения суммарного объема до 100 мл колбу со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин. Расплавленную PDA вливали в стерильные чашки Петри.
(VII) Получение базальной среды OF Hugh и Leifson (OFBM) (pH - 7,1)
Состав среды OFBM
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Казеин-пептон (типтон) 0,2% | 0,2% (масс./об.) |
2 | NaCl | 0,5% (масс./об.) |
3 | K2HPO4 | 0,03% (масс./об.) |
4 | Агар-агар | 2,0% (масс./об.) 0,5% (масс./об.) |
5 | Бромтимоловый синий | 0,004% (масс./об.) |
Метод
Все компоненты среды взвешивали и помещали в стеклянную колбу и растворяли в дистиллированной воде. Стеклянную колбу со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин. После автоклавирования среду вливали в стерильные культуральные пробирки.
(VI) Получение среды SIM (для тестирования сульфида, индола, подвижности) (рН - 7,3)
Состав среды SIM
S. No. | Компонент | Количество |
1 | Пептон | 3,0% (масс./об.) |
2 | Говяжий экстракт | 0,3% (масс./об.) |
3 | Железоаммонийные квасцы | 0,02% (масс./об.) |
4 | Тиосульфат натрия | 0,0025% (масс./об.) 0,5% (масс./об.) |
7 | Агар-агар | 2,0% (масс./об.) |
Метод
Все компоненты среды взвешивали и помещали в стеклянную колбу и растворяли в дистиллированной воде. Стеклянную колбу со средой автоклавировали при 121°С в течение 15 мин. После автоклавирования среду в расплавленном состоянии вливали в стерильные культуральные пробирки.
Приложение II
Получение фосфатного буфера
S. No. | Компонент | Количество | Масса на 100 мл |
4 | NaH2PO4.H2O | 1 М | 5,38 г |
5 | Na2HPO4 | 1 М | 8,66 г |
pH | 7,0 |
Метод
Обе фосфатные соли помещали в стеклянный стакан, к солям добавляли 50 мл дистиллированной воды и перемешивали на магнитной мешалке с помощью магнитного бруска. После проверки полного растворения фосфатных солей раствор доводили до 100 мл дистиллированной водой.
Приложение III
Носители и другие агенты, используемые в эксперименте
S. No. | Название агента | Состав | Использование как/для | Производитель |
1 | КМЦ | Карбоксиметилцеллюлоза | Связующий агент | Himedia |
2 | Карбендазим | Карбендазим WP50 | Фунгицид | Bavistin |
3 | Традиционная почва | Перлит+сфагновый мох+вермикулит | Размножение грибка | KEL (Keltech Energies Ltd) |
Сокращения
S.No. | Короткая форма | Длинная форма |
1 | ATCC | Американская коллекция типов культур |
2 | КМЦ | Карбоксиметилцеллюлоза |
3 | КОЕ | Колониеобразующие единицы |
4 | л | литр |
5 | LB | Luria-Bertani |
6 | мкл | Микролитр |
7 | MTCC | Коллекция типов микробных культур |
8 | мл | Миллилитр |
9 | MIC | Минимальная ингибирующая концентрация |
10 | мин | Минуты |
11 | М | Молярная |
12 | NFCCI | Национальная индийская коллекция грибковых культур |
13 | OFBM | Базальная среда окисления-ферментации |
14 | PDA | Картофельно-декстрозный агар |
15 | PDB | Картофельно-декстрозный бульон |
16 | Об/мин | Обороты в минуту |
17 | Ssp | Подвиды |
18 | SIM | Тест на сульфиды, индол, подвижность |
19 | об./об. | Объем на объем |
20 | масс./об. | Масса на объем |
21 | Масс./масс. | Масса на массу |
22 | WP | Смачиваемый порошок |
Claims (9)
1. Штамм бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, имеющий номер поступления (MTCС-5674) и проявляющий противомикробную и/или противогрибковую активность и активность, стимулирующую рост растений.
2. Экстракт, полученный с применением штамма Bacillus subtilis ssp. Shriramensis, имеющего номер поступления (MTCС-5674), где экстракт получают способом, включающим (a) выращивание бактерии в среде T3, содержащей триптон, триптозу, экстракт дрожжей, NaH2PO4 х Н20, Na2HPO4 и MnCl2, с рН 6,8 в инкубаторе-качалке при температуре 30°C в течение 60 часов для получения экстракта и (b) выделение экстракта, обладающего противомикробной и/или противогрибковой активностью.
3. Экстракт по п.2, где Bacillus subtilis ssp. shriramensis выращивают в аэробных условиях.
4. Экстракт по п.2, где способ дополнительно включает стадию концентрирования экстракта с помощью обычных способов.
5. Композиция, включающая штамм бактерии по п.1 и один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из противомикробного агента, противогрибкового агента, стимулирующего рост растения агента и их комбинаций, где композиция обладает противомикробной и/или противогрибковой активностью и активностью, стимулирующей рост растений, при концентрации штамма от 5х105 до 5х107 КОЕ/мл.
6. Композиция, включающая экстракт по п.2 и один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из противомикробного агента, противогрибкового агента, стимулирующего рост растения агента и их комбинаций, где композиция обладает противомикробной и/или противогрибковой активностью в концентрации от 4 до 20 мкг/мкл экстракта.
7. Композиция, включающая штамм по п.1, экстракт по п. 2 и один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из противомикробного агента, противогрибкового агента, стимулирующего рост растения агента и их комбинаций, где композиция обладает противомикробной и/или противогрибковой активностью и активностью, стимулирующей рост растений при концентрации от 5х105 до 5х107 КОЕ/мл штамма и при концентрации от 4 до 20 мкг/мкл экстракта.
8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающая сельскохозяйственно приемлемый носитель.
9. Штамм по п.1, экстракт по п.2 или композиция по любому из предшествующих пунктов для получения композиции, выбранной из группы, состоящей из противомикробной, противогрибковой композиции, композиции для стимуляции роста растений и их комбинаций.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN2331DE2014 | 2014-08-16 | ||
IN2331/DEL/2014 | 2014-08-16 | ||
PCT/IN2015/000294 WO2016027279A1 (en) | 2014-08-16 | 2015-07-21 | Novel bacterium of bacillus genus and uses thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017108599A RU2017108599A (ru) | 2018-09-17 |
RU2017108599A3 RU2017108599A3 (ru) | 2018-09-17 |
RU2689530C2 true RU2689530C2 (ru) | 2019-05-28 |
Family
ID=55610090
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017108599A RU2689530C2 (ru) | 2014-08-16 | 2015-07-21 | Новая бактерия рода bacillus и ее применение |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10327448B2 (ru) |
EP (1) | EP3180420B1 (ru) |
JP (1) | JP6598086B2 (ru) |
CN (1) | CN107075459B (ru) |
AP (1) | AP2017009761A0 (ru) |
AR (1) | AR104079A1 (ru) |
AU (1) | AU2015304820B2 (ru) |
BR (1) | BR112017003182B1 (ru) |
CA (1) | CA2957697C (ru) |
IL (1) | IL250450B (ru) |
MX (1) | MX2017002067A (ru) |
MY (1) | MY194066A (ru) |
PH (1) | PH12017500257A1 (ru) |
RU (1) | RU2689530C2 (ru) |
SG (2) | SG10202108611PA (ru) |
WO (1) | WO2016027279A1 (ru) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107683090A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-02-09 | 有机科技农业株式会社 | 利用抗菌剂、农药、微生物的植物病害的防除方法、及新型枯草芽孢杆菌 |
EP3823453A4 (en) * | 2018-07-18 | 2022-07-20 | The Regents of the University of California | BACTERIA FROM MEDICAGO ROOT NODULES AS PLANT PROBIOTIC BACTERIA FOR AGRICULTURE |
CN109022318B (zh) * | 2018-08-15 | 2021-08-20 | 龙海市农丰源肥料有限公司 | 枯草芽孢杆菌l1及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的应用 |
CN111560324B (zh) * | 2019-01-28 | 2022-09-20 | 福建省农业科学院农业生物资源研究所 | 一种促生解磷固氮的芽孢杆菌及其应用 |
RU2764695C1 (ru) * | 2020-12-08 | 2022-01-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма" | Штамм бактерий Bacillus subtilis subsp. subtilis - антагонист фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней |
JP2024054855A (ja) * | 2022-10-05 | 2024-04-17 | 住友化学株式会社 | 安定化有害生物防除剤、及び、安定化有害生物防除剤の製造方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2094990C1 (ru) * | 1993-07-08 | 1997-11-10 | Амбросов Валерий Антонович | Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент вещества, обладающего противогрибковой активностью |
US6060051A (en) * | 1997-05-09 | 2000-05-09 | Agraquest, Inc. | Strain of bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm |
WO2013165607A1 (en) * | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Novel bacillus amyloliquefaciens strain bac03 and methods of using same |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62135494A (ja) * | 1985-12-09 | 1987-06-18 | Kibun Kk | P19物質及びその製造法 |
US5589381A (en) * | 1994-06-30 | 1996-12-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Bacillus licheniformis producing antifungal agents and uses thereof for control of phytopathogenic fungi |
WO1997002749A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-30 | Rutgers University | Bacillus licheniformis producing antifungal agents and uses thereof for control of phytopathogenic fungi |
US6103228A (en) * | 1997-05-09 | 2000-08-15 | Agraquest, Inc. | Compositions and methods for controlling plant pests |
US6896883B2 (en) * | 1997-07-22 | 2005-05-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Biocontrol for plants with Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, and Sporobolomyces roseus |
US6015553A (en) | 1997-08-22 | 2000-01-18 | Agraquest, Inc. | Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests |
AUPP589798A0 (en) | 1998-09-14 | 1998-10-08 | Charles Sturt University | Novel bacterial strains and methods of controlling fungal pathogens |
JP3140430B2 (ja) * | 1999-03-09 | 2001-03-05 | 株式会社 バイテク | バチルス属微生物とその用途 |
KR100587447B1 (ko) * | 2004-03-24 | 2006-06-12 | 한국화학연구원 | 바실러스 서브틸리스 eb120 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는방법 |
US7211428B1 (en) * | 2004-05-18 | 2007-05-01 | Council Of Scientific And Industrial Research | Strain of Bacillus as a bioinoculant |
EP1978099A4 (en) * | 2005-11-04 | 2011-08-24 | Ahc Co Ltd | ANTIBACTERIAL SUBSTANCE DM0507 AND ITS USE |
ES2306600B1 (es) * | 2007-03-19 | 2009-06-17 | Probelte, S.A. | Un cultivo puro de la cepa ah2 de la especie bacillus velezensis y producto para el control biologico de hongos fitopatogenos y estimulador del crecimiento vegetal. |
WO2009031874A1 (es) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Jorge Olmos Soto | Cepa de bacillus subtilis para uso agrícola |
US20100143316A1 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Taiwan Agricultural Chemicals And Toxic Substances Research Institute, | Novel strain of bacillus amyloliquefaciens and its use |
KR101181756B1 (ko) | 2009-12-28 | 2012-09-11 | 효성오앤비 주식회사 | 항진균성 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 포함하는 미생물 수화제 |
CN102786581A (zh) * | 2012-01-09 | 2012-11-21 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 侧孢短芽孢杆菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和细菌生长中的应用 |
US9125419B2 (en) * | 2012-08-14 | 2015-09-08 | Marrone Bio Innovations, Inc. | Bacillus sp. strain with antifungal, antibacterial and growth promotion activity |
KR101390457B1 (ko) * | 2013-08-29 | 2014-04-29 | 강원대학교산학협력단 | 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ebn-tk3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균제 |
-
2015
- 2015-07-21 SG SG10202108611PA patent/SG10202108611PA/en unknown
- 2015-07-21 MX MX2017002067A patent/MX2017002067A/es unknown
- 2015-07-21 CA CA2957697A patent/CA2957697C/en active Active
- 2015-07-21 WO PCT/IN2015/000294 patent/WO2016027279A1/en active Application Filing
- 2015-07-21 CN CN201580056277.9A patent/CN107075459B/zh active Active
- 2015-07-21 MY MYPI2017700491A patent/MY194066A/en unknown
- 2015-07-21 AU AU2015304820A patent/AU2015304820B2/en active Active
- 2015-07-21 BR BR112017003182-5A patent/BR112017003182B1/pt active IP Right Grant
- 2015-07-21 US US15/503,941 patent/US10327448B2/en active Active
- 2015-07-21 SG SG11201700821TA patent/SG11201700821TA/en unknown
- 2015-07-21 JP JP2017507440A patent/JP6598086B2/ja active Active
- 2015-07-21 AP AP2017009761A patent/AP2017009761A0/en unknown
- 2015-07-21 EP EP15834463.0A patent/EP3180420B1/en active Active
- 2015-07-21 RU RU2017108599A patent/RU2689530C2/ru active
- 2015-08-12 AR ARP150102600A patent/AR104079A1/es unknown
-
2017
- 2017-02-05 IL IL25045017A patent/IL250450B/en active IP Right Grant
- 2017-02-10 PH PH12017500257A patent/PH12017500257A1/en unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2094990C1 (ru) * | 1993-07-08 | 1997-11-10 | Амбросов Валерий Антонович | Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент вещества, обладающего противогрибковой активностью |
US6060051A (en) * | 1997-05-09 | 2000-05-09 | Agraquest, Inc. | Strain of bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm |
WO2013165607A1 (en) * | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Novel bacillus amyloliquefaciens strain bac03 and methods of using same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PH12017500257A1 (en) | 2017-07-10 |
CN107075459B (zh) | 2021-03-02 |
AU2015304820A1 (en) | 2017-03-09 |
US10327448B2 (en) | 2019-06-25 |
EP3180420B1 (en) | 2020-10-21 |
IL250450B (en) | 2019-10-31 |
SG10202108611PA (en) | 2021-09-29 |
BR112017003182B1 (pt) | 2023-05-09 |
CA2957697A1 (en) | 2016-02-25 |
AR104079A1 (es) | 2017-06-28 |
CN107075459A (zh) | 2017-08-18 |
WO2016027279A1 (en) | 2016-02-25 |
IL250450A0 (en) | 2017-03-30 |
AP2017009761A0 (en) | 2017-02-28 |
SG11201700821TA (en) | 2017-02-27 |
EP3180420A4 (en) | 2017-12-27 |
RU2017108599A (ru) | 2018-09-17 |
AU2015304820B2 (en) | 2018-07-19 |
CA2957697C (en) | 2021-04-13 |
MY194066A (en) | 2022-11-10 |
MX2017002067A (es) | 2017-05-04 |
EP3180420A1 (en) | 2017-06-21 |
RU2017108599A3 (ru) | 2018-09-17 |
JP2017525356A (ja) | 2017-09-07 |
US20170231230A1 (en) | 2017-08-17 |
JP6598086B2 (ja) | 2019-10-30 |
BR112017003182A2 (pt) | 2017-11-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3177149B1 (en) | Bacterial spore compositions for industrial uses | |
RU2689530C2 (ru) | Новая бактерия рода bacillus и ее применение | |
KR101190650B1 (ko) | 다기능 신규 균주 바실러스 벨리젠시스 비42 | |
KR101569737B1 (ko) | 벼 근권에서 분리된 신규 식물 내생세균 바실러스 오리지콜라 및 이를 이용한 천연식물 보호 및 식물 강화제 개발 | |
RU2550268C2 (ru) | Новая флуоресцентная псевдомонада вида pseudomonas azotoformans для улучшения всхожести и роста растений | |
Bennett et al. | Beneficial microorganism survival on seed, roots and in rhizosphere soil following application to seed during drum priming | |
CN109679884B (zh) | 一株能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用 | |
WO2005082149A1 (ja) | バチルス属細菌を用いた植物病害の防除方法および防除剤 | |
CN100566574C (zh) | 用芽孢杆菌属细菌防治植物病害的方法和防治剂 | |
WO2007011025A1 (ja) | イネの育苗時期に発生する病害に対する防除剤 | |
JP2009511012A (ja) | バチルスサブチリスkccm10639またはkccm10640を含む植物病害防除用組成物およびこれらを用いた植物病害防除方法 | |
KR20140127670A (ko) | 식물 내생세균 바실러스 메칠로트로피쿠스 yc7007 균주 및 이를 이용한 다기능 생물농약 및 미생물비료 개발 | |
PL186440B1 (pl) | Biologicznie czysta kultura szczepu bakterii Pseudomonas chlororaphis oraz kompozycja do zwalczaniagrzybów patogennych dla roślin | |
JPH08175921A (ja) | 農園芸用殺菌剤組成物 | |
RU2440413C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus licheniformis (его варианты), обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, и препарат на основе этого штамма | |
KR100997677B1 (ko) | 슈도모나스 제니큘라타 mh102 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법 | |
Srinivas et al. | Effect of bioagents and fungicides against Phomoposis vexans and on seed quality of brinjal | |
JP2019142847A (ja) | 植物病害防除剤 | |
KR20050034000A (ko) | 병원성 진균에 길항력을 가지는 신규의 식물 내생 세균인버크홀더리아 비에나멘시스 엠씨1404 및 이를 함유하는항진균성 미생물 살균제 | |
JPH08175920A (ja) | 農園芸用殺菌剤組成物 | |
JP2019165676A (ja) | 植物病害防除剤及び植物病害の防除方法 | |
KR100616408B1 (ko) | 라이조푸스 올리고스포러스을 포함하는 잔디생장촉진제 및이를 이용한 잔디 생장 촉진 방법 | |
RU2820273C1 (ru) | Штамм paenibacillus polymyxa et3, стимулирующий рост злаковых культур | |
KR101406823B1 (ko) | 바실러스 속 cs-52 균주 및 이를 이용한 고추 탄저병의 방제 | |
RU2822893C1 (ru) | Консорциум микроорганизмов для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов и способ повышения продуктивности растений |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |