PL186440B1

PL186440B1 - Biologicznie czysta kultura szczepu bakterii Pseudomonas chlororaphis oraz kompozycja do zwalczaniagrzybów patogennych dla roślin

Info

Publication number: PL186440B1
Application number: PL95316910A
Authority: PL
Inventors: Berndt Gerhardson; Annika Gustafsson; Tiiu Jerkeman; Britt-Marie Jingström; Lennart Johnsson; Margareta Hökeberg
Original assignee: Svenska Lantmaennen
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2004-01-30
Also published as: NO964359D0; NZ284874A; FI119994B; HU9602828D0; HUT75369A; BG62753B1; PL316910A1; US5900236A; EE03414B1; UA43366C2; EE9600164A; CZ287510B6; DK0756454T3; EP0756454A1; JPH10502803A; FI964162L; GR3031952T3; BR9507322A; SE9401307D0; EP0756454B1

Abstract

1. Biologicznie czysta kultura szczepu bakterii Pseudomonas chlororaphis, zdepo- nowanego w Panstwowej Kolekcji Bakterii Przemyslowych i Morskich (National Col- lections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Aberdeen, Szkocja, pod numerem akcesyjnym NCIMB 40616, majaca zdolnosc wytwarzania czynnych antypato- genicznie metabolitów i jej mutanty, posiadajace te same zasadnicze cechy co szczep macierzysty. 2. Kompozycja do zwalczania grzybów patogennych dla roslin, znamienna tym, ze zawiera jako skladnik czynny szczep bakterii Pseudomonas chlororaphis, zdeponowany w Panstwowej Kolekcji Bakterii Przemyslowych i Morskich (National Collections of Indu- strial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Aberdeen, Szkocja, pod numerem akcesyj- nym NCIMB 40616, lub brzeczke hodowlana tego szczepu, zawierajaca jego czynne anty- patogenicznie metabolity. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest biologiczny środek ochronny, użyteczny i skuteczny w zwalczaniu ataków patogenów roślinnych w handlowych uprawach roślin. Jest to nowy szczep (MA 342) bakterii Pseudomonas chlororaphis, posiadający pożądaną charakterystykę. Izolat zdeponowano w Państwowej Kolekcji Bakterii Przemysłowych i Morskich (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Aberdeen, Szkocja, dnia 14 lutego 1994 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim i otrzymał on numer akcesyjny NCIMB 40616.

Przedmiotem wynalazku jest zatem biologicznie czysta kultura szczepu bakterii Pseudomonas chlororaphis, zdeponowanego w Państwowej Kolekcji Bakterii Przemysłowych i Morskich (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Aberdeen, Szkocja, pod numerem akcesyjnym NCIMB 40616, mająca zdolność wytwarzania czynnych antypatogenicznie metabolitów i jej mutanty, posiadające te same zasadnicze cechy co szczep macierzysty.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja do zwalczania grzybów patogennych dla roślin, zawierająca jako składnik czynny szczep bakterii Pseudomonas chlororaphis, zdeponowany w Państwowej Kolekcji Bakterii Przemysłowych i Morskich (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Aberdeen, Szkocja, pod numerem akcesyjnym NCIMB 40616, lub brzeczkę hodowlaną tego szczepu, zawierająca jego czynne antypatogenicznie metabolity.

Kompozycja według wynalazku jest szczególnie użyteczna do zwalczania grzybów takich jak Drechslera teres, Drechslera graminea, Drechslera avenae, Microchodium nivale, Tilletia caries, Ustilago avenae.

W jednej z realizacji kompozycja zawiera składnik czynny zmieszany z kompozycją nośnika, dopuszczalnego w praktyce rolniczej.

Kompozycja może zawierać składnik czynny zmieszany z nośnikiem ciekłym.

Kompozycja może także zawierać składnik czynny impregnowany na stałym nośniku porowatym.

186 440

Kompozycja może zawierać dodatkowo składniki służące jako środki nadające przyczepność.

Kompozycja może zawierać dodatkowo źródło substancji odżywczych.

Zwalczanie grzybów patogennych dla roślin polega na wprowadzeniu do środowiska, w którym ma być hamowany grzyb, efektywnej dawki szczepu bakterii według wynalazku, mający zdolność wytwarzania czynnych antypatogenicznie metabolitów, lub jej mutanty, posiadające te same zasadnicze cechy co szczep macierzysty, lub brzeczkę hodowlaną tego szczepu, zawierającą jego czynne antypatogenicznie metabolity. Szczep może być wprowadzany w postaci kompozycji w formie użytkowej.

Szczep bakterii lub kompozycja może być wprowadzany przez naniesienia na nasiona, jednostki rozmnażania wegetatywnego roślin lub naniesienie na rośliny, albo do środowiska wzrostowego, w którym roślina wzrasta lub będzie wzrastać.

Figura 1: Figura ta przedstawia profil kwasów tłuszczowych izolatu bateryjnego MA 342 otrzymany przy użyciu Systemu Identyfikacji Bakterii (Microbial Identification System MIDI, Newark Ltd., USA).

Poniżej przedstawiono charakterystykę nowego szczepu bakteryjnego oraz opis korzystnych metod rozmnażania szczepu oraz jego form użytkowych i zastosowania w polu lub w cieplarniach. Kilka przykładów przedstawiono dla dodatkowego zilustrowania sposobu i kompozycji według wynalazku, bez ograniczania ich.

Charakterystyka nowego szczepu bakteryjnego MA 342.

Charakterystyka morfologiczna: Morfologia kolonii na TSA 10 (10 g pożywki Tryptic Soy Broth (Difco Ltd.); 12 g agaru technicznego (Oxoid Ltd.) w 1000 ml wody destylowanej): okrągłe, białe, umiarkowanie wypukłe kolonie, tworzące dobrze widoczne szkliste kryształy w agarze przy wysokich gęstościach komórek. Jest to pałeczka Gram-ujemna, która wykazuje jasno-żółtą fluorescencję na pożywce Kings B (1,5 g K2HPO4); 1,5 g MgSO4 -7H₂O; 20 g Proteose Peptone (Difco Ltd); 10 ml gliceryny, 15 g Bacto Agar (Difco Ltd) w 1000 ml wody destylowanej).

Analiza kwasów tłuszczowych: Profil kwasów tłuszczowych bakterii przedstawiono na Figurze 1. Analiza ta została przeprowadzona przy użyciu Systemu Identyfikacji Bakterii (Microbial Identification System -MIDI, Newark Ltd., USA), wersja 3,7. Zgodnie z tym testem MA 342 jest najbardziej podobna do Pseudomonas chlororaphis, przy współczynniku dopasowania równym 0,705.

Charakterystyka biochemiczna:

Badana cecha w szybkim teście API 20 NE*	Reakcja izolatu MA342
1	2
Redukcja azotanów	-
Produkcja indolu	-
Kwas z glukozy	-
Dihydrolaza argininowa	+
Ureaza	-
Hydroliza eskuliny	-
Hydroliza żelatyny	+
β-galaktozydaza	-
Asymilacja glukozy	+
Asymilacja arabinozy	-
Asymilacja mannozy	. ?
Asymilacja mannitolu	+
Asymilacja N-acetylo-glukozaminy	-
Asymilacja maltozy	-

186 440 cd. tabeli

1	2
Asymilacja glukonianu	+
Asymilacja kapronianu	-
Asymilacja adypinianu	-
Asymilacja jabłczanu	+
Asymilacja cytrynianu	+
Asymilacja fenylooctanu	-
Oksydaza cytochromu	+

* API System Ltd., Francja

Cechy testowane w testach dodatkowych

Produkcja lewanu	-
Asymilacja ksylozy	-?
Asymilacja sorbitolu	+?

Szczep czynny ilościowo najlepiej otrzymuje się na drodze procesu fermentacji, polegającego na wszczepieniu próbki czystej hodowli szczepu do ciekłej hodowli wytrząsanej lub do fermentora zawierającego odpowiednią pożywkę hodowlaną. Szczep może być także namnażany na jałowej powierzchni, na przykład na powierzchni agarowej, a po wyrośnięciu komórki mogą być zawieszane w wodzie lub innym znanym medium ciekłym. Pożywką hodowlaną może być w zasadzie dowolna znana w tej dziedzinie pożywka do wzrostu bakterii. Fermentację prowadzi się aż do uzyskania wystarczającego stężenia komórek, na przykład około 5-10⁹ cfu (jednostek kolonizujących)/ml hodowli ciekłych. Tak otrzymane, brzeczka fermentacyjna lub zawiesina bakteryjna mogą być stosowane jako takie do ochrony roślin, albo też mogą być one przed zastosowaniem poddawane obróbce lub przeprowadzane w formy użytkowe.

Jeden z rodzajów obróbki polega na zabiciu komórek bakteryjnych w brzeczce fermentacyjnej, na przykład przez ogrzewanie lub odwirowywanie, a uzyskana brzeczka lub supernatant, zawierające metabolity bakteryjne, mogą być używane do celów ochrony roślin po uprzednim oczyszczeniu i/lub zatężeniu albo bez oczyszczania i/lub zatężania. Zawiesiny bakteryjne i brzeczki fermentacyjne mogą być także jednorodnie mieszane z jednym lub większą ilością związków lub grup związków znanych z tej dziedziny, pod warunkiem że takie związki są kompatybilne ze szczepami bakteryjnymi albo ich metabolitami czynnymi antypatogenicznie lub pochodnymi tych metabolitów. Odpowiednimi związkami mogą być dodatki proszkowe lub stałe nośniki, takie jak talk, kaolin, bentonit lub montmorylonit, znane ze stanu techniki zwilżalne proszki, pożywki będące źródłem węgla (takie jak glukoza, sacharoza i fruktoza) lub złożone pożywki bakteryjne (takie jak wyciąg z drożdży, pepton i trypton bakteriologiczny), sole metali, sole kwasów tłuszczowych, estry kwasów tłuszczowych, jonowe i niejonowe środki powierzchniowo-czynne, składniki odżywcze dla roślin, regulatory wzrostu roślin, środki grzybobójcze, środki owadobójcze, środki bakteriobójcze i podobne. Zawiesiny bakteryjne i brzeczki fermentacyjne mogą być także suszone lub liofilizowane przed lub po zmieszaniu z odpowiednimi związkami, a uzyskany produkt użyty do ochrony roślin. Odpowiednim sposobem suszenia jest na przykład suszenie na powietrzu wermikulitu dostarczanego z brzeczką do fermentacji bakteryjnej.

Preparaty bakterii lub ich metabolitów mogą być stosowane przy użyciu dowolnego ze znanych sposobów obróbki nasion, jednostek rozmnażania wegetatywnego, roślin i gleby za pomocą preparatów bakteryjnych. Zależnie od zamierzonego celu i okoliczności można wybrać rozpylanie, atomizację, opylanie, rozpraszanie, peletkowanie, zamaczanie lub wylewanie. Korzystne wielkości stosowane przy zaprawianiu nasion wynoszą zwykle od 10¹¹ do 10¹⁴

186 440 cfu/ha, a przy rozpylaniu 10¹² do 10¹⁴ cfu/ha lub odpowiadające temu ilości metabolitów bakteryjnych.

Przykład 1

Izolacja mikroorganizmu MA 342

Wykopane korzenie rośliny Empetrum Nigrum opłukano jałową wodą wodociągową dla usunięcia przylegającej gleby. Z młodego korzenia odcięto kawałek o długości 2-3 cm i przechowywano w jałowych warunkach. Kawałek pobrano z regionu powyżej obszaru wierzchołka korzenia. Na kawałku korzenia zrobiono niewielkie nacięcia za pomocą skalpela. Następnie kawałkiem korzenia potarto powierzchnię agaru TSA10. Po wyrośnięciu bakterii zebrano MA 342 i czysty hodowano na TSA 10.

Przykład 2

Przechowywanie mikroorganizmu MA 342

Czystą hodowlę poddano głębokiemu zamrożeniu w małych ampułkach w -70°C. Jako środek ochronny do zamrażania użyto 10% roztwór gliceryny w wodzie wodociągowej o pH ustawionym na 7,15 po autoklawowaniu. Po zamrażaniu w -70°C ampułki przechowywano w -20°C.

W celu dłuższego przechowywania izolat liofilizowano. Po wzrastaniu przez 48 godzin na agarze TSA 10 skos bakteryjny zdrapywano z powierzchni agaru, mieszano ze środkiem ochronnym (50 g Dextran T 70 (Pharmacia Fine Chemicals Ltd.); 50 g L-glutaminianu Na (Kebo AB) w 1000 ml destylowanej wody), rozlewano do małych ampułek (20 ml) i wstawiano do liofilizatora Hetosicc (Heto Ltd., Dania) na 24 godziny. Po liofilizacji ampułki zamykano szczelnie gumowymi korkami i przechowywano w 4°C.

Przykład 3

Wpływ MA 342 na Microchodium nivale we wstępnych skriningach cieplarnianych

Bakterię naniesiono na nasiona pszenicy w sposób następujący: 24-godzinne hodowle na TSA 10, namnażane w 15°C, zdrapano z powierzchni agaru na płytkach Petriego o średnicy 9 cm i zmieszano z 40 ml pożywki (SNB: 18 g sacharozy; 5 g peptonu bakteryjnego (Oxoid Ltd.); 2 g wyciągu z drożdży (Oxoid Ltd.); 0,5 g K2HPO4 i 0,25 g MgSO4-7H₂O w 1000 ml wody destylowanej, pH ustawione na 7,2-7,4) i 40 ml 2% (w/v) roztworu soli sodowej karboksymetylocelululozy (CMC) w jałowej wodzie destylowanej. Mieszaniną tą polano nasiona. Po 20 minutach nadmiar mieszaniny odlano i suszono nasiona przez noc za pomocą wentylatora.

Dla każdego rodzaju zaprawy w tym teście skriningowym obsiano dwie doniczki po 50 nasion w każdej. Doniczki miały średnicę 18 cm i wysokość 4 cm i wypełnione były w dwóch trzecich niesterylizowaną handlową mieszaniną torfową (Enhetsjord K Normal), zmieszaną z 20% (v/v) piasku.

Nasiona pszenicy ozimej (odmiana „Kosack”) przed zaprawą bakteriami sztucznie zakażono M. nivale. Patogen hodowano przez siedem dni na pożywce ziemniaczano-dekstrozowej (24 g pożywki Potato Dextrose Broth (Difco Ltd.) na 1000 ml wody destylowanej) w temperaturze pokojowej na wytrząsarce rotacyjnej. Uzyskaną zawiesinę homogenizowano za pomocą miksera kuchennego i polano nią nasiona. Po 30 minutach ciecz zlano, a nasiona pozostawiono do wyschnięcia na noc pod wentylatorem. Tak zakażone nasiona poddano następnie działaniu MA 342 i zasiewano w doniczkach w sposób opisany powyżej.

Po zasianiu doniczki pokryto szklanymi pokrywkami i u-mieszczono w ciemności w 6°C. Po pięciu dniach pokrywki usunięto, każdą doniczkę nawodniono 100 ml wody i umieszczono wewnątrz torby plastykowej o pojemności 5 litrów, podtrzymywanej przez dwa drewniane pręty. Następnie doniczki umieszczono w cieplarni w 12-15°C na osiem dni.

Testowano następujące rodzaje obróbki nasion:

1. Szczej? P. chlororaphis MA .342, zm ieszany z SNB/CMC, na nasionach zakażonych M. nivale

2. Nasiona zakażone M. nivale jako kontrola chora

3. Nasiona niepoddawane obróbce jako kontrola zdrowa

Wpływ tłumiący chorobę rejestrowano jako procent wzeszłych, zdrowych (= bez grzybni) roślin. Rezultaty typowego wstępnego skriningu z M. nivale przedstawiono w tabeli 1.

186 440

Tabela 1.

Wpływ MA 342 na wzejście roślin i rozwój choroby w pszenicy ozimej, wzrosłej z nasion zakażonych M. nivale.

Zaprawa	Procent (%) wzejść	Procent (%) zdrowych roślin wyrosłych z roślin zasadzonych
1. MA 342	87	81
2 Kontrola chora	13	7
3. Kontrola zdrowa	90	89

Przykład 4

Wpływ MA 342 na Drechslera teres w dodatkowych testach cieplarnianych

Izolat MA 342 do tych testów namnażano przez 48 godzin na pożywce Tryptic Soy Broth (Difco Ltd) w stężeniu zmniejszonym o połowę na wytrząsarce rotacyjnej w ciemności w temperaturze l8-20°C. Następnie nasiona jęczmienia odmiany „Golf’, naturalnie zakażonego D. teres, zmieszano w torbie plastykowej z 300 ml uzyskanej zawiesiny bakteryjnej na kg nasion i po wymieszaniu torbę wytrząsano przez około 4 minuty. Tak zaprawione nasiona suszono pod wentylatorem w temperaturze pokojowej przez jeden dzień, po czym siano w doniczkach w sposób opisany w przykładzie 3.

Zasiane doniczki, po trzy na każdą zaprawę, umieszczono najpierw w ciemności w 6°C na siedem dni, a następnie w cieplarni w około 20°C w sposób opisany w przykładzie 3. Dla odczytania efektów zaprawiania obliczono częstość roślin wykiełkowanych i częstość roślin z początkowym atakiem na pierwszy liść. Wpływ bakterii odnoszono do kontroli niezaprawianej i nasion zaprawianych środkiem grzybobójczym Panoctine Plus 400 (guazatine 150 g/l + imazalil 10 g/l), Rhóne-Poulenc Ltd., w dawce 4 ml na kg nasion.

Tabela 2.

Wpływ MA 342 i Panoctine Plus 400 na D. teres w jęczmieniu w typowym dodatkowym skriningu cieplarnianym.

Zaprawa	Procent roślin kiełkujących	Procent roślin z zaatakowanym pierwszym liściem
Kontrola	92,5	13,0
Panoctine Plus 400,4 ml /kg	95,5	0,0
MA 342, 300 ml/kg	96,1	0,0

Przykład 5

Wpływ MA 342 na patogeny roślinne w eksperymentach polowych

W eksperymentach polowych, zaprojektowanych jako uśrednione bloki o trzech do ośmiu powtórzeniach stosowano działki o wielkości różniącej się między poszczególnymi eksperymentami od 0,15 m² (jeden eksperyment z T. caries) do około 15 m² (większość eksperymentów). Eksperymenty lokowano w różnych miejscach w Szwecji, w większości przypadków na glebach gliniastych o zawartości humusu około 3 procent.

Zaprawianie nasion bakterią i Panoctine Plus 400 przeprowadzano w sposób opisany powyżej w przykładzie 4. Po wysuszeniu zaprawionych nasion za pomocą wentylatora przed wysianiem ich w działkach polowych przechowywano je w temperaturze pokojowej przez różne czasy. Wszystkie nasiona, poza nasionami zakażonymi T. caries, były w naturalny sposób zakażone lub zainfekowane różnymi testowanymi chorobami. Nasiona pszenicy ozimej (odmiana „Kosack”) sztucznie zakażano zarodnikami T. caries przez zmieszanie 2 g pokruszonych kłosów zakażonych T. caries z 1 kg nasion pszenicy.

Wpływ MA 342 na Tilletia caries

Wpływ odczytywano jako częstość występowania zainfekowanych kłosów w czasie dojrzewania. Rezultaty uzyskane w dwóch próbach w latach 1991/1992 i dwóch próbach w latach 1992/93 przedstawiono w tabeli 3. Różnica między zaprawianiem bakteryjnym a zaprawianiem środkiem grzybobójczym jest znaczna w latach 1992/93.

186 440

Tabela 3.

Wpływ zawiesiny bakterii MA 342 na infekcję Tilletia caries przenoszoną poprzez nasiona

Zaprawa	Procent zainfekowanych kłosów
1991/1992	1992/93
Kontrola	23	65
Panoct .400*, 4 ml /kg	2	24
MA 342,300 mg/kg	0	9

* Panoctine 400(guazaime 150 g/l), Rhone-Poulenc Ltd.

Wpływ MA 342 na Drechslera teres, D. Graminea, D. Avenae i Ustilago avenae

W eksperymentach polowych z tymi patogenami mierzono ilość wykiełkowanych roślin na m² i ilość zainfekowanych roślin na m² a ponadto, w większości eksperymentów, również i) wydajność zboża, ii) ciężar tysiąca ziaren i iii) ciężar na hektolitr.

Wpływ na Drechslera teres: Rezultaty eksperymentów polowych przeprowadzonych w latach 1991-1993, w których badano wpływ na infekcję D. teres w jęczmieniu, przedstawiono w tabelach 4, 5 i 6.

Tabela 4.

Rezultaty czterech eksperymentów polowych z jęczmieniem zainfekowanym: Drechslera teres w 1991. Średnie z czterech eksperymentów przeprowadzonych w Alnarp, Lanna, Strangnas i Ultuna.

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Ilość roślin/m²	Rośliny zainfekowane/m2	Ciężar hektolitra kg	Ciężar 1000 ziaren, g
Kontrola	4970	361	47	64,7	41,5
Pan. Plus 400, 4 ml	5390	353	1	66,3	43,8
MA 342, 300 ml/kg	5480	353	1	66,0	43,7

Tabela 5.

Rezultaty pięciu eksperymentów polowych z jęczmieniem zainfekowanym Drechslera teres w roku 1992. Średnie z eksperymentów przeprowadzonych w Svalof, Nygard, Kolback, Ultuna i Rob acksdalen.

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Ilość roślin/m2	Rośliny zalnfekgwane/m2	Ciężar hektolitra kg	Ciężar 1000 ziaren, g
Kontrola	4290	358	48	67,9	51,7
Pan. Plus 400, 4 ml	4380	378	1	67,8	50,5
MA 342, 300 ml/kg	4300	380	1	68,3	52,6

Tabela 6.

Rezultaty dwóch eksperymentów polowych z jęczmieniem zainfekowanym Drechslera teres w roku 1993. Średnie z eksperymentów przeprowadzonych w Kolback i Ultuna.

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Zainfekowane rośliny/m2
Kontrola	6310	74
Pan. Plus 400, 4 ml	6730	1
MA 342, 300 ml/kg	6720	5

Wpływ na Drechslera graminea: Wyniki eksperymentów z nasionami zainfekowanymi D. Graminea, prowadzonych w latach 1991-1993 przedstawiono w tabelach 7, 8 i 9.

186 440

Tabela 7.

Wyniki jednego eksperymentu polowego, przeprowadzonego w roku 1991 w Uppsali z jęczmieniem zainfekowanym D. Graminea.

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Zainfekowane rośliny/m²
Kontrola	3440	31
Pan. Plus 400,4 ml	4160	2
MA 342, 300 ml/kg	4390	1

T ab e 1 a 8.

Rezultaty pięciu eksperymentów polowych z jęczmieniem zainfekowanym D. Graminea w roku 1992. Średnie z eksperymentów przeprowadzonych w Svalov, Nygard, Kolback, Ultuna i Robacksdalen.

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Ilość roślin/m²	Rośliny zainfekowane/m2	Ciężar hektolitra kg	Ciężar 1000 ziaren, g
Kontrola	2590	383	101	66,2	40,2
Pan. Plus 400, 4 ml	3470	381	5	66,6	39,9
MA 342, 300 ml/kg	3460	368	7	66,2	39,8

Tabela 9.

Wyniki dwóch eksperymentów polowych, przeprowadzonych w roku 1993 z jęczmieniem zainfekowanym D. Graminea. Średnie z eksperymentów przeprowadzonych w Kolback i Ultuna

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Zainfekowane rośliny/m2
Kontrola	2810	46
Pan. Plus 400,4 ml	4160	1
MA 342, 300 ml/kg	3990	8

Wpływ na Drechslera avenae: Wyniki eksperymentów z nasionami owsa zainfekowanymi D. avenae, prowadzonych w latach 1991-1993 przedstawiono w tabelach 10,11 i 12.

Tabela 10.

Wyniki jednego eksperymentu polowego, przeprowadzonego w roku 1991 w Uppsali z owsem („Puhti”) zainfekowanym D. Avenae

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Zainfekowane rośliny/m2
Kontrola	4940	74
Pan. Plus 400, 4 ml	4860	32
MA 342, 300 ml/kg	5090	17

Tabela 11.

Wyniki czterech eksperymentów polowych przeprowadzonych w roku 1992 z owsem („Puhti” i „Vital”) zainfekowanym D. avenae. Średnie z eksperymentów prowadzonych w Sval0v i Ultuna.

Zaprawa	Wydajność kg/ha	Ilość roślinW-	Rośliny zainfekowane/m2	Ciężar hektolitra kg	Ciężar 1000 ziaren, g
Kontrola	3990	428	22	57,5	35,4
Pan. Plus 400, 4 ml	4080	456	13	57,8	35,5
MA 342, 300 ml/kg	4000	445	3	57,4	35,0

186 440

Tabela 12.

Wyniki eksperymentu polowego, przeprowadzonego w roku 1993 w Uppsali z owsem („Vital”), zainfekowanym D. avenae.

Obróbka	Wydajność kg/ha	Zainfekowane rośliny/m²
Kontrola	7570	79
Pan. Plus 400, 4 ml	7870	14
MA 342, 300 ml/kg	7680	27

Wpływ na Ustilago avenae: W eksperymentach polowych z U. avenae liczono ilość kłosów porażonych śniecią na m² w czasie dojrzewania. Nie mierzono wydajności zboża. Wyniki z trzech eksperymentów przeprowadzonych w latach 1991-1993 przedstawiono w tabeli 13.

Tabela 13.

Wyniki trzech eksperymentów polowych prowadzonych w latach 1991-1993 w Uppsali na owsie zainfekowanym Ustilago avenae.

Zaprawa	1991 Kłosy ze śniecią na m²	1992 % zainfekowanych kłosów	1993 Kłosy ze śniecią na iF
Kontrola	7	10,6	95
Panoctine Plus 400, 4 ml	3	8,7	nie badano
MA 342, 3001 _ml/kg	1	1,7	15

300 ml 1991 i 1992; 200 ml w 1993 r.

Przykład 6

Zaprawianie nasion i innych części roślin za pomocą MA 342

Zaprawianie nasion za pomocą mieszanin wodnych zawierających MA 342.

Zawiesiny bakteryjne wytworzone w sposób opisany w przykładzie 3 lub w sposób opisany w przykładzie 4, jak powyżej, mieszano z następującymi substancjami lub związkami:

Talk w proszku (Kebo Lab AB), 48 g/l zawiesiny bakteryjnej

Pepton bakteriologiczny (Oxoid, Ltd.), 5 g/l zawiesiny bakteryjnej

Tween 20 (Merck Ltd.), 20 ml/litr zawiesiny bakteryjnej,

Metocel (eter celulozy, Sveda Kemi AB), 12 g na litr zawiesiny bakteryjnej

Lissapol (ICI Agrochemicals Ltd.), 1 g na litr zawiesiny bakteryjnej

Bond (Newman Agrochemicals Ltd.), 1 g na litr zawiesiny bakteryjnej.

W innych eksperymentach zawiesiny bakteryjne wirowano przy 10000 g przez około 10 minut, a uzyskane peletki ponownie zawieszono w 0,1 M MgSO4 lub w peptonowanej wodzie (5 g peptonu bakteriologicznego (Oxoid, Ltd.) na litr wody wOdociagowej).

Po dokładnym wymieszaniu uzyskane zawiesiny nanoszono na nasiona w sposób opisany w przykładzie 4 dla niewymieszanych zawiesin bakteryjnych.

Zaprawianie nasion roślin za pomocą liofilizowanych bakterii.

Bakterie MA 342, namnażane w hodowli wytrząsanej w sposób opisany powyżej w przykładzie 4, wirowano, a uzyskaną peletkę ponownie zawieszano w roztworze mleka odtłuszczonego (200 g mleka odtłuszczonego w proszku, Semper AB, Szwecja, na litr jałowej wody destylowanej) jako środka ochronnego do liofilizacji. Mieszaninę zamrożono warstwowo w szklanych słojach, po czym liofilizowano w tych słoikach przez około 48 godzin w liofilizatorze Hetosicc (Heto Ltd., Dania). Uzyskany proszek przechowywano do czasu użycia w 4°C w torebkach plastykowych lub w butelkach plastykowych z zakrętką. W celu naniesienia na nasiona proszek mieszano z wodą lub innymi roztworami wodnymi, a następnie nanoszono na nasiona w sposób opisany w przykładzie 4 dla zawiesin bakteryjnych, albo mieszano z nasionami w stanie suchym przez ostrożne wytrząsanie proszku i nasion (około 10 g proszku na kg nasion) w pojemniku plastykowym.

Peletkowanie nasion po ich zaprawieniu MA 342. Bakterie MA 342, namnażane w hodowli wstrząsanej w sposób opisany powyżej w przykładzie 4, zmieszano w stosunku objęto186 440 ściowym 1:1 ze środkiem nadającym przyczepność (2% w/v wodny roztwór soli sodowej karboksymetylocelulozy lub 50% w/v wodny roztwór gumy arabskiej). Nasiona zaprawiano tą mieszaniną w sposób opisany powyżej w przykładzie 4. Następnie do torby plastykowej dodano nadmiar bentonitu (Dresser Minerals Inc.) lub talk w proszku (Kebo Lab. AB), torbę nadęto i energicznie wytrząsano przez parę minut. Następnie nasiona rozpostarto na wielkich tacach pod wentylatorem i pozostawiono do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Opryskiwanie pędów roślin zawiesinami bakterii. Bakteriami MA 342, namnażanymi w hodowli wstrząsanej w sposób opisany powyżej w przykładzie 4, napełniono plastykowe rozpylacze ręczne lub rozpylacze z napędem, po czym rozpylano je na liście i pędy roślin. W innej odmianie obróbki bakterie najpierw wirowano przy około 10000 x g przez dziesięć minut, peletkę ponownie zawieszano w wodzie wodociągowej, a tak uzyskaną zawiesinę bakteryjną stosowano do opryskiwania liści i pędów roślin.

Przykład 7

Wpływ oczyszczonych metabolitów MA 342 na choroby powodowane przez Drechslera teres w eksperymentach cieplarnianych.

Izolat Ma 342 namnażano przez 48 godzin w pożywce Tryptic Soy Broth (Difco Ltd.) o połowie mocy (15 g/l) na wytrząsarce rotacyjnej w ciemności w 18-20°C. Uzyskaną zawiesinę bakteryjną wirowano przy 48000 g przez 30 minut, a następnie oczyszczano metabolity z supernatanta, stosując wkłady Seppak C 18 (Waters Associates) w sposób następujący:

1. 80 ml supernatanta dodano do Sep-pak, aktywowanego 10 ml metanolu.

2. Sep-pac przemyto najpierw 5 ml 30% etanolu, a następnie 5 ml 40% etanolu.

3. Metabolity eluowano 5 ml 70% etanolu.

4. Eluat w 70% etanolu odparowano w wyparce rotacyjnej aż do pozostania około 1,5 ml roztworu wodnego. Roztwór ten następnie rozcieńczono wodą wodociągową do objętości około 6,5 ml.

Nasiona odmiany jęczmienia „Cultivar”, naturalne i zainfekowane D. teres, zanurzono na 30 minut w 6,5 ml tego roztworu wodnego metabolitów i zasiewano je w doniczkach po 50 nasion w doniczce. Doniczki zakryto szklanymi pokrywkami i umieszczono je w ciemności w 6°C. Po dziewięciu dniach pokrywki zdjęto i umieszczono doniczki w cieplarni w 15-22°C na około dwa tygodnie. Następnie dokonywano odczytu liczby roślin wykiełkowanych i zaatakowanych przez chorobę w sposób opisany powyżej w przykładzie 4. Jako kontrole użyto: 1) nasiona niezaprawiane i 2) nasiona zaprawiane supernatantem nieoczyszczanym na Seppac i zawierającym komórki Ma 342.

Tabela 14.

Wpływ oczyszczonych metabolitów MA 342 i supernatanta zawierającego komórki MA 342 na D. teres w jęczmieniu w typowym teście cieplarnianym.

Zaprawa	Procent wykiełkowanych roślin	Procent roślin z zaatakowanym pierwszym liściem
Kontrola niezaprawiana	97,0	21,6
Supernatant z komórkami MA 342	99,0	1,0
Odparowany eluat pozbawiony komórek	99,0	0,0

Przykład 8

Wyniki testów porównawczych izolatu MA 342 i 11 innych izolatów Pseudomonas chlororaphis uzyskanych z różnych kolekcji kultur

Jedenaście różnych nie pochodzących ze Szwecji izolatów Pseudomonas chlororaphis mających oznaczenia podane w Tabeli 1 testowano, razem z izolatem MA 342, pod kątem działania przeciwko septoriozie jęczmienia oraz pod kątem indukowania reakcji w testach biochemicznych według systemu testowego API 20 NE. Ponadto porównano wygląd koloni izolatów oraz tworzenie kryształów na płytkach agarowych. 11 izolatów nie-szwedzkich pochodziło z różnych krajów i były złożone do depozytu w czterech różnych uznanych kolekcjach kultur (Tabela 1).

186 440

Cieplarniany test zdolności hamowania choroby Testy prowadzono na jęczmieniu zainfekowanym Drechslera teres w sposób opisany w przykładzie 4, testując wszystkie izolaty jednocześnie w celu uzyskania wiarygodnego porównania. Jak wynika ewidentnie z tabeli 1, wyniki pokazują, że MA 342 jest wyraźnie jedyny w swoim rodzaju i że żaden z pozostałych testowanych izolatów nie miał właściwości porównywalnych z MA 342 w tym rodzaju testu, to jest zdolności hamowania infekcji Drechslera teres.

Tabela 1.

Oznaczenia, kraj pochodzenia i działanie MA 342 oraz 11 innych izolatów P. chlororaphis przeciwko infekcji D teres jęczmienia w testach cieplarnianych.

Oznaczenie izolatu	Kraj pochodzenia	Wpływ na septoriozę w testach cieplarnianych. Procent zainfekowanych roślin po zaprawieniu izolatem
MA 342	Szwecja	9
USDA B2075	Czechosłowacja	53
USDAB1869	Nowa Zelandia	60
USDA B14874	USA, Kolorado	56
USDA B14869	USA, Illinois	58
USDA B1854	USA, Loisiana	43
NCTC 10686	Anglia	54
NCTC 7357	Anglia	58
DSM 6508	Niemcy	56
ATCC 9446	USA	61
ATCC 17414	USA	50
ATCC 17811	USA	58
Kontrola niezaprawiana		71

Wywoływanie reakcji w testach biochemicznych według systemu testowego API 20 NE Testy prowadzono w sposób opisany powyżej. Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Wykazują one, że MA 342 także pod tym względem jest jedyny w swoim rodzaju i może być zróżnicowany względem pozostałych 11 testowanych izolatów. Niektóre z tych izolatów nie mogą być, zgodnie z tymi testami, uważane za należące do rodzaju Pseudomonas chlororaphis.

Tabela 2

Reakcje indukowane przez różne izolaty testowane w różnych testach biochemicznych zgodnie z systemem testowym API 20 NE. „+” oznacza reakcje pozytywne, a oznacza brak reakcji/reakcję negatywną

Właściwość	Testowany izolat
testowana w teście API 20 NE	MA	B	B	B	B	B	NCTC	NCTC	DSM	ATCC	ATCC	ATCC
342	2075	1869	14874	14869	1854	10686	7357	6508	9446	17414	17811
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
Redukcja azotanów	-	-	+	-	-	+	+	+	+	+	+	+
Prosukcja indolu	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Kwas z glukozy	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Dihydrolaza argininowa	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+
Ureaza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Hydroliza eskuliny	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Hydroliza żelatyny	+	+	-	-	-	+	+	+	-	+	+	+

186 440 cd. tabeli 2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

β-galaltozydaza Asymilacja glukozy

+

Asymilacja arabmozy

-

+

-

+

-

+

-

Asymilacja mannozy

-

+

-

+

Asymilacja mannitolu

+

-

+

Asymilacja glukozaminy

-

+

-

X

+

Asymilacja maltozy

-

Asymilacja glukonianu

+

X

+

Asymilacja kaprontanu

-

+

Asymilacja adypinianu

-

+

-

Asymilacja jabłczanu

+

Asymilacja cytrynianu

+

X

+

Asymilacja fenylooctanu

-

+

-

+

Oksydaza cytochromu

+

-

+

X

+

-

+

Porównanie wyglądu kolonii i tworzenia kryształów na płytkach agarowych

Izolaty hodowano na płytkach Petriego na TSA 10 w sposób opisany powyżej. Zaobserwowano niewielkie różnice w wyglądzie kolonii między różnymi izolatami, ale nie można było zróżnicować w ten sposób wszystkich izolatów. Jednakże izolat MA 342 był jedynym izolatem tworzącym w agarze typowe szkliste kryształy i mógł być, dzięki tej swojej właściwości, zróżnicowany spośród wszystkich innych izolatów.

186 440

START

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Biologicznie czysta kultura szczepu bakterii Pseudomonas chlororaphis, zdeponowanego w Państwowej Kolekcji Bakterii Przemysłowych i Morskich (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Aberdeen, Szkocja, pod numerem akcesyjnym NCIMB 40616, mająca zdolność wytwarzania czynnych antypatogenicznie metabolitów i jej mutanty, posiadające te same zasadnicze cechy co szczep macierzysty.
2. Kompozycja do zwalczania grzybów patogennych dla roślin, znamienna tym, że zawiera jako składnik czynny szczep bakterii Pseudomonas chlororaphis, zdeponowany w Państwowej Kolekcji Bakterii Przemysłowych i Morskich (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Aberdeen, Szkocja, pod numerem akcesyjnym NCIMB 40616, lub brzeczkę hodowlaną tego szczepu, zawierającą jego czynne antypatogenicznie metabolity.
3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że patogenem jest grzyb Drechslera teres.
4. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że patogenem jest grzyb Drechslera graminea.
5. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że patogenem jest grzyb Drechslera avenae.
6. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że patogenem jest grzyb Microchodium nivale.
7. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że patogenem jest grzyb Tilletia caries.
8. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że patogenem jest grzyb Ustilago avenae.
9. Kompozycja według zastrz. 2 albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że zawiera składnik czynny zmieszany z kompozycją nośnika, dopuszczalnego w praktyce rolniczej.
10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera składnik czynny zmieszany z nośnikiem ciekłym.
11. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera składnik czynny impregnowany na stałym nośniku porowatym.
12. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera dodatkowo składniki służące jako środki nadające przyczepność.
13. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera dodatkowo źródło substancji odżywczych.

Wynalazek dotyczy dziedziny produktów do ochrony roślin. W szczególności wynalazek dotyczy nowego szczepu bakterii Pseudomonas chlororaphis oraz kompozycji do zwalczania grzybów patogennych dla roślin zawierającej ten szczep bakteryjny lub substancje antybiotyczne wytwarzane przez ten szczep, użyteczną do ochrony roślin przed atakami fitopatogennych czynników drobnoustrojowych.

Liczne czynniki natury bakteryjnej, posiadające zdolność wywoływania chorób roślin powodują znaczne uszkodzenia roślin zbożowych i związane z tym straty ekonomiczne. Wiele z tych czynników atakuje liście i/lub inne nadziemne części roślin, a następnie zwykle przenosi się na nowe, niezainfekowane rośliny za pomocą spor przenoszonych drogą powietrzną. Inne przekazywane są z pokolenia na pokolenie poprzez nasiona, a liczne istotne ekonomicznie

186 440 czynniki wywołujące chorobę są przenoszone poprzez glebę i pozostają w glebie w stanie mniej lub bardziej nieaktywnym do czasu wzrostu podatnego zboża.

Procedury stosowane w produkcji zbóż w celu zwalczania drobnoustrojowych czynników wywołujących choroby są często drogie, ale w większości systemów hodowli zbóż są one ekonomicznie niezbędne. Jedną z szerzej stosowanych metod jest działanie biostatycznymi lub biobójczymi środkami chemicznymi. W większości przypadków stosuje się je w postaci preparatów rozpylanych na rosnące zboże, preparatów do zaprawiania nasion lub korzeni lub jako środki dezynfekcyjne do gleby. Inne typowe metody to hodowla z ukierunkowaniem na odporność oraz zarządzanie samym systemem upraw.

Wszystkie te standardowe sposoby zwalczania mają wady. Zarządzanie systemem upraw jest skuteczne lub dogodne tylko w niektórych problemach chorobowych. Podobnie hodowla roślin zbożowych z ukierunkowaniem na oporność jest możliwa lub odpowiednia tylko w niektórych przypadkach, może trwać długo, a uzyskana oporność może po pewnym czasie zostać utracona w związku z pojawieniem się nowych szczepów patogenu. Związki chemiczne mają często wysoką skuteczność, ale mogą wywierać niepożądane działania uboczne na środowisko, wymagają ostrożnego postępowania, jako że większość z nich stwarza zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, a także mogą stać się nieskuteczne jeśli rozwiną się oporne szczepy patogenu.

Stosowanie biologicznych środków ochronnych lub biopestycydów może być bardziej skuteczne lub bardziej korzystne niż stosowanie innych metod zwalczania, a zatem środki takie są bardzo intensywnie badane. Znanych jest kilka szczepów bakteryjnych i grzybowych, hamujących wzrost różnych drobnoustrojowych czynników chorobotwórczych. Aby były skuteczne i nadawały się do stosowania, muszą być one trwałe, dawać odtwarzalne rezultaty polowe i muszą istnieć możliwości stosowania ich w warunkach polowych. Dotychczas niewiele jest środków spełniających te wymagania i znajdujących zastosowanie w warunkach polowych.