CZ287510B6

CZ287510B6 - Preparation and method of controlling diseases of plants

Info

Publication number: CZ287510B6
Application number: CZ19963025A
Authority: CZ
Inventors: Berndt Gerhardson; Annika Gustafsson; Tiiu Jerkeman; Britt-Marie Jingstroem; Lennart Johnsson; Margareta Hoekeberg
Original assignee: Svenska Lantmannen
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2000-12-13
Also published as: BR9507322A; SE9401307D0; US5900236A; WO1995028085A1; BG62753B1; CN1073806C; GR3031952T3; BG100919A; CZ302596A3; AU2354795A; SE502660C2; CA2187927C; SE9401307L; JPH10502803A; NL350040I2; ATE183616T1; NO316012B1; EE03414B1; PL186440B1; HU220582B1

Description

Prostředek a způsob pro kontrolu nemocí rostlin

Oblast techniky

Vynález se týká výrobků na ochranu rostlin. Podrobněji se vynález týká nového kmene bakteriálního druhu Pseudomonas chlororaphis a použití prostředků, obsahujících tento bakteriální kmen nebo antibiotické substance produkované tímto kmenem, v rostlinné výrobě k ochraně rostlin proti napadání íytopatogenickými mikrobiálními činidly.

Dosavadní stav techniky

Četná patogenní činidla mikrobiální povahy schopná vyvolávat nemoci rostlin způsobují závažné 15 škody a tudíž ekonomické ztráty na rostlinných kulturách. Mnohá z nich napadají listy a/nebo ostatní nadzemní části rostlin a potom obvykle zasahují neinfikované rostliny sporami vznášejícími se ve vzduchu. Jiná jsou přenášena z jedné generace rostlin na další tím, že se rodí na sadbě a některá ekonomicky důležitá patogenní činidla způsobující nemoci se rodí v půdě a přetrvávající více či méně neaktivní v půdě až do růstu citlivé kultury.

Postupy používané pro kontrolu mikrobiálních činidel vyvolávajících nemoci v rostlinné výrobě jsou často velmi nákladné, ale ve většině rostlinných systémů ekonomicky nezbytné. Jedna ze široce používaných metod je ošetření biostatickými nebo biocidními chemikáliemi. Používají se ve většině případů jako postřiky na rostlinné kultury a jako prostředky k ošetření kořenů nebo 25 k dezinfekci půdy. Jinými standardními metodami jsou vypěstování odolnosti a likvidace nemocí samotnou rostlinnou soustavou.

Všechny tyto standardní kontrolní metody mají jisté nedostatky. Rostlinná soustava se může vypořádat účinně nebo dostatečně pouze sjistými problémy nemocí. Rovněž vypěstovávání 30 odolnosti v obilninách je možné a vhodné pouze v jistých případech, může trvat dlouhou dobu a získaná odolnost se může po jisté době ztratit, objeví-li se nové kmeny patogenu. Chemické sloučeniny jsou povětšinou vysoce účinné, mohou však vyvolávat nežádoucí účinky na okolním prostředí, vyžadují opatrné zacházení, protože většina z nich je riskantní pro zdraví, a mohou se také stát neúčinnými, když se vyvinou odolné patogenní kmeny.

Použití biologických kontrolních činidel nebo biopesticidů může být účinnější a vhodnější než použití jiných kontrolních metod, a proto taková činidla byla intenzivně zkoumána. O některých bakteriálních a houbových kmenech je známo, že inhibují růst různých mikrobiálních činidel vyvolávajících nemoci. Aby byly účinné a užitečné, musí být stálé, musí poskytovat reproduko40 vatelné výsledky na poli a musí existovat možnosti používat je v polních podmínkách. Doposud málo z nich splňuje tyto požadavky a používají se jako komerční výrobky.

Podstata vynálezu

Vynález se týká biologického kontrolního činidla užitečného a účinného při kontrole napadání rostlin patogeny v rostlinné výrobě. Vynález se týká nového kmene (MA 342) bakterií Pseudomonas chlororaphis, jenž vykazuje požadované charakteristiky. Izolát byl uložen ve sbírce National Collections of Industrial and Marině Bacteria Limited (NCIMB), Aberdeen, Skotsko, 50 14. února 1994 podle podmínek Budapešťské dohody a má NCIMB pořadové č. 40616.

Vynález se rovněž týká prostředku ke kontrole nemocí rostlin, který jako účinnou látku obsahuje nový kmen MA 342 nebo jeho mutanty v podstatě se stejnými charakteristikami nebo antipatogenicky aktivní metabolity nebo jejich deriváty. Vynález se dále týká způsobu kontroly nemocí

- 1 CZ 287510 B6 rostlin za použití kmene MA 342 nebo jeho mutantů v podstatě se stejnými charakteristikami nebo antipatogenicky aktivními metabolity nebo jejich deriváty.

Popis výkresu

Na obrázku 1 je znázorněn profil mastné kyseliny získaný s mikrobiálním identifikačním systémem [Microbial Identification Systém (MIDI, Newark Ltd., USA)] bakteriálního izolátu MA 342.

Dále je uvedena charakteristika nového bakteriálního kmene a popis výhodných způsobů proliferace kmene a formulací a aplikací na poli nebo ve skleníkách. Některé příklady se uvádějí k další ilustraci způsobu a prostředku podle vynálezu, aniž by jimi byl vynález omezován.

Charakteristiky nového bakteriálního kmene MA 342. Morfologické charakteristiky: Koloniová morfologie na TSA (10 g tryptického sojového vývaru), 12 g technického agaru (Oxoid Ltd.) v 1000 ml destilované vody: kulaté, bílé, mírně vypouklé kolonie vytvářející dobře viditelné křišťálové krystaly v agaru při vysoké hustotě buněk. Je to gramnegativní tyčinka s jasně žlutou fluorescencí na Ringově médiu B (1,5 g K₂HPO₄, 1,5 g MgSO₄.7H₂O, 20 g proteospeptonu (Difco Ltd.), 10 ml glycerinu, 15 g Bacto agaru (Difco Ltd.) v 1000 ml destilované vody).

Analýza mastné kyseliny: Mastněkyselinový profil bakterie je znázorněn na obr. 1. Tato analýza se provádí za použití mikrobiálního identifikačního systému (MIDI Ltd., Newark, USA), verze 3.7. Podle tohoto testovacího programu se MA 342 podobá nejvíce Pseudomonas chlororaphis se sdružovacím indexem 0,705.

Biochemické charakteristiky

Rychlý test charakteristik v API 20 NE (API Systém Ltd. Francie)	Reakce izolátu MA 342
Redukce nitrátu	—
Produkce indolu	—
Kyselina z glukózy	—
Arginindihydroláza	+
Ureáza	—
Hydrolýza eskulinu	-
Hydrolýza želatiny	+
B-galaktocidáza	-
Asimilace glukózy	+
Asimilace arabinózy	-
Asimilace manózy	-
Asimilace mannitolu	+
Asimilace N-acetyl-glukosaminu	-
Asimilace maltózy	-
Asimilace glukonátu	+
Asimilace kaprátu	-
Asimilace adipátu	—
Asimilace malátu	+
Asimilace citrátu	+
Asimilace fenyl-acetátu	—
Cytochromoxidáza	+

-2CZ 287510 B6

Charakteristiky testované v dodatečných testech

Produkce levanu Asimilace xylózy Asimilace sorbitolu +

Dále jsou uváděny výhodné způsoby pěstování (proliferace) kmenu a formulace a aplikace na poli nebo ve skleníku.

Potřebná množství aktivního kmenu se nejlépe získá fermentačním postupem zahrnujícím inokulaci vzorku čisté kultury kmenu do kapalné třepané kultury nebo ve fermentoru obsahujícím vhodné fermentaČní médium. Kmen lze také šlechtit na sterilním povrchu, například na agarovém povrchu, a když odroste, mohou se buňky suspendovat ve vodě nebo jiném kapalném prostředí známém v tomto oboru. Růstová média mohou být v zásadě jakákoliv pěstitelská média známá v oboru. Fermentuje se tak dlouho, až se získá dostatečná koncentrace buněk, například asi 5 až 10⁹ cfu (jednotek tvořících kolonie - colony forming units) v 1 ml kapalné kultury. Takto získaný zákvas nebo bakteriální suspenze se může používat přímo k ochranně rostlin, anebo je lze upravovat a formulovat před použitím.

Při jednom způsobu zpracování mohou se bakteriální buňky ve fermentačním zákvasu usmrtit, například zahřátím, nebo odstředit a výsledný zákvas nebo supematant, obsahující bakteriální metabolity, se může používat pro účely ochrany rostlin po předchozím čištění a/nebo koncentrování nebo bez nich. Bakteriální suspenze nebo fermentaČní zákvasy lze také homogenně smíchávat s jednou nebo několika sloučeninami nebo skupinami sloučenin, známými v oboru, za předpokladu, že takové sloučeniny jsou kompatibilní s bakteriálními kmeny nebo jejich antipatogenicky aktivními metabolity nebo jejich deriváty. Vhodnými sloučeninami mohou být prášková aditiva nebo tuhé nosiče, jako je talek, kaolin, bentonit nebo montmorillonit, smáčitelné prášky známé v oboru, zdroje uhlíkatých živin (jako je glukóza, sacharóza a fruktóza) nebo komplex bakteriálních živin (jako je kvasnicový extrakt nebo bakteriologický pepton a trypton), soli kovů, soli mastných kyselin, estery mastných kyselin, iontové nebo neiontové povrchově účinné látky, živiny pro rostliny, regulátory růstu rostlin, fungicidy, insekticidy, baktericidy apod. Bakteriální suspenze a fermentaČní zákvasy se také mohou sušit, popřípadě vymrazováním, před tím nebo po tom, co se smísí s vhodnými sloučeninami, a výsledný výrobek se používá k ochranně rostlin. Vhodným způsobem sušení je například sušení vermikulitu nasyceného bakteriálním fermentačním zákvasem, prováděné na vzduchu.

Bakteriální a metabolitové přípravky lze aplikovat jakýmkoliv způsobem známým k ošetřování semen, vegetativních propagačních jednotek, rostlin a půdy bakteriálními kmeny. Lze volit postřiky, atomizaci, popraše, rozhoz, peletování, ponořování anebo polévání podle zamýšlených objektivních a převládajících okolností. Výhodné dávky aplikované na semena jsou normálně 10¹¹ až 10¹² cfu/ha a pro postřiky 10¹² až 10¹⁴ cfu/ha nebo odpovídající množství bakteriálních metabolitů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace mikroorganizmu MA 342

Vyryté kořeny rostliny Empetrum nigrům se promyjí sterilní vodovodní vodou, aby se odstranila ulpělá zem. Z mladého prutu se uřízne 2 až 3 cm dlouhý kousek a uchovává se za sterilních podmínek. Kousek se uřízne z oblasti nad špičkou kořene. Do kořene se provedou skalpelem

-3CZ 287510 B6 ožehnutým plamenem malé řezy. Kořenový kousek se potom tře proti povrchu TSA 10 agaru. Jakmile bakterie vyrostou, MA 342 se sebere a čistě kultivuje na TSA 10 agaru.

Příklad 2

Uchovávání mikroorganizmu MA 342

Čistá kultura se hluboce zmrazí v malých ampulkách při -70 °C. Jako mrazicí ochranné činidlo se používá 10% glycerin ve vodovodní vodě, pH se po autoklávování upraví na 7,15. Po zmrazení se ampule skladují při -20 °C.

Pro dlouhodobé přechovávání se izolát vysuší vymrazováním. Po pěstění 48 hodin na TSA 10 agaru se bakteriální porost seškrabe z agarového povrchu, smíchá se s mrazicím sušicím ochranným činidlem [50 g Dextranu T 70 (Pharmacia Fine Chemical Ltd.), 50 g Na-L-glutamátu (Kebo AB) v 1000 ml destilované vody], nalije se do malých ampulek (20 ml) a vloží do mrazicí sušárny Hetosicc (Heto Ltd., Dánsko) na 24 hodin. Po vysušení vymrazováním se ampule plynotěsně uzavřou pryžovými zátkami a skladují při 4 °C.

Příklad 3

Účinek MA 342 proti Microdochium nivale v primárním skleníkovém rozboru

Bakterie se aplikuje na semena pšenice takto: 24 hodin staré kultury na TSA 10 agaru, pěstěné při 15 °C, se seškrabou z agarového povrchu 9cm Petriho misky a smíchají se se 40 ml živné půdy [SNB: 18 g sacharózy, 5 g bakteriálního peptonu (Oxoid Ltd.), 2 g kvasnicového extraktu (Oxoid Ltd.), 0,5 g K₂HPO₄ a 0,25 g MgSO₄.7H₂O v 1000 ml destilované vody s pH upraveným na 7,2 až 7,4] a 40 ml 2% (hmotnostně/objemově) roztoku karboxymethylcelulózy (CMC) ve sterilní destilované vodě. Tato směs se nalije na zrna. Po 20 minutách se nadbytečná směs slije a semena se suší pod ventilátorem přes noc.

Pro každé ošetření v tomto skleníkovém rozboru byly osety dvě misky po 50 semenech v každé z nich. Misky mají průměr 18 cm a výšku 4 cm a plní se do dvou třetin nesterilizovanou komerční rašelinovou směsí (Enhetsjord K Normál) smíchanou s 20 % (objemově) písku.

Zrna ozimé pšenice (odrůda „Kosack“) se uměle zamoří M. nivale před ošetřením bakterií. Patogen se kultivuje sedm dní v bramborovo-dextrózové živné půdě [24 g Potato Dextrose Broth (Difco Ltd.) na 1000 ml destilované vody] při teplotě místnosti na rotační třepačce. Výsledná břečka se homogenizuje kuchyňským mísičem a naleje na zrna. Po 30 minutách se kapalina slije a zrna se nechají schnout přes noc pod ventilátorem. Takto zamořená zrna se potom ošetří MA 342 a vysejí do misek, jak bylo popsáno shora.

Po vysetí se misky přikryjí skleněnými víčky a umístí se do tmy při 6 °C. Po pěti dnech se sklíčka odstraní, každá miska se zalije 100 ml vody a vloží se do pětilitrového plastického sáčku podepíraného dvěma dřevěnými kolíky. Misky se potom umístí do skleníku při 12 až 15 °C na osm dní.

Byla testována následující ošetření semen:

1. P. chlororaphis kmen MA 342, smíchaný s SNB/CMC, na semena zamořená M. nivale,

2. semena zamořená M. nivale jako kontrola nemoci a

3. neošetřená semena jako zdravotní kontrola.

-4CZ 287510 B6

Účinek potlačování nemoci se zaznamenává jako procento vzešlých, zdravých (tj. bez mycelia) rostlin z celkově vysetých. Výsledky typického primárního rozboru M. nivele jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1 Účinek MA 342 na vzejití a rozvoj nemoci v ozimé pšenici u semen infikovaných M. nivale

Ošetření	Vzejití %	Množství zdravých z celkově zasetých, %
1.MA342	87	81
2. Kontrola nemoci	13	7
3. Neošetřená kontrola	90	89

Příklad 4

Účinek MA 342 proti Drechslera teres v sekundárních skleníkových rozborech

Pro tyto rozbory se izolát MA 342 kultivuje 48 hodin v poloviční koncentraci (15 g/1) tryptické sojové živné půdy (Difco Ltd.) na rotační třepačce ve tmě při 18 až 20 °C. Zrna ječmene odrůdy „Golf“, přirozeně infikovaná D. teres, se smíchají se 300 ml výsledné bakteriální suspenze na 1 kg semen v plastickém sáčku a po smíchání se v sáčku třepou asi 4 minuty. Takto ošetřená zrna se suší ventilátorem při teplotě místnosti jeden den a potom se vysejí do misek, jak je uvedeno v příkladě 3.

Misky s osivem, pro každé ošetření tři, se nejprve umístí do tmy při 6 °C na dobu sedmi dní a potom se dají do skleníku s teplotou asi 20 °C, jako v příkladu 3. K vyjádření účinků ošetření se počítá množství vzešlých rostlin a počet rostlin s primárním napadením prvního listu. Bakteriální účinek se vztahuje na neošetřenou kontrolu a semena ošetřená fungicidem Panoctine Plus 400 (guazatin 150 g/1 + imazalil 10 g/1, Rhone-Poulenc Ltd.) v dávce 4 ml na kg semen.

Tabulka 2 Účinek MA 342 a Panoctinu Plus 400 proti D. teres na ječmenu v typickém skleníkovém sekundárním rozboru

Ošetření	Vzešlých rostlin %	Rostlin s napadeným prvním listem, %
Kontrola	92,5	13,0
Panoctine Plus 400, 4 ml/kg	95,5	0,0
MA 342, 300 ml/kg	96,1	0,0

Příklad 5

Účinek MA 342 na rostlinné patogeny v polních pokusech

Polní pokusy, označené jako nahodilé bloky a se třemi až osmi opakováními, se konají na plochách, jež podle pokusů mají velikost 0,15 m² (jeden experiment s T. caries) až asi 15 m²(většina pokusů). Pokusy se konaly na různých lokalitách ve Švédsku a povětšinou na jílovitých půdách obsahujících asi 3 procenta humusu.

Semena se ošetří bakterií a Panoctine Plus 400, jak je popsáno shora v příkladě 4. Po vysušení ošetřených semen větrákem se semena skladují při teplotě místnosti různě dlouhou dobu, než se vysejí na polní plochy. Všechna semena, kromě těch, jež byla infikovaná T. caries, se přirozeně

-5CZ 287510 B6 zamoří nebo infikuje různými testovanými nemocemi. Semeno ozimé pšenice („Kosack“) se uměle infikuje sporami T. caries smícháním 2 g rozdrcených klasů T. caries s 1 kg pšeničných zrn.

Účinek MA 342 na Tilletia caries. Účinek se vyjádří jako počet infikovaných klasů v době zrání. Výsledky získané ve dvou zkouškách v letech 1991/92 a dvou zkouškách v 1992/93 jsou uvedeny v tabulce 3. Rozdíl mezi bakteriálním ošetřením a fungicidním je výrazný v letech 1992/93.

Tabulka 3 Účinek bakteriální suspenze MA 342 proti osivu vzešlému s infekcí Tilletia caries

Ošetření	Infikované klasy, %
1991/92	1992/93
Kontrola	23	65
Panoct. 400*), 4 ml/kg	2	24
MA 342, 300 mg/kg	0	9

*) Panoctine 400 (guazatin 150 g/1), Rhóne-Poulenc Ltd.

Účinek MA 342 na Drechsler teres, D. Graminea, D. avenae a Ustilago avenae

V polních pokusech s těmito patogeny se měří počet vzklíčených rostlin na m² a počet infikovaných rostlin na m² a kromě toho ve většině pokusů též i) výnos zrna, ii) hmotnost tisíc semen a iii) hmotnost na 100 litrů.

Účinek na Drechslera teres: Výsledky polních pokusů provedených v létech 1991-1993, při nichž byly testovány účinky proti infekci D. teres na ječmenu, jsou shrnuty v tabulkách 4, 5 a 6.

Tabulka 4 Výsledky čtyř polních pokusů na ječmeni infikovaném Drechslera teres r. 1991. Průměry čtyř zkoušek provedených v Alnarp, Lanna, Strangnás a Ultuna

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Počet rostlin na m²	Infikovaných rostlin/m²	Hmotnost 100 litrů, kg	Hmotnost 1000-jádra, g
Kontrola	4970	361	47	64,7	41,5
Pan. Plus 400,4 ml	5390	353	1	66,3	43,8
MA 342, 300 ml/kg	5480	353	1	66,0	43,7

Tabulka 5 Výsledky pěti polních pokusů na ječmeni infikovaném Drechslera teres r. 1992. Průměry experimentů provedených ve Svalóf, Nygárd, Kolbáck, Ultuna a Robácksdalen

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Počet rostlin na m²	Infikovaných rostlin/m²	Hmotnost 100 litrů, kg	Hmotnost 1000-jádra, g
Kontrola	4290	358	48	67,9	51,7
Pan. Plus 400,4 ml	4380	378	1	67,8	50,5
MA 342, 300 ml/kg	4300	380	1	68,3	52,6

-6CZ 287510 B6

Tabulka 6 Výsledky dvou polních pokusů s ječmenem infikovaným nákazou Drechslera teres r. 1993. Průměry experimentů provedených v Kolback a Ultuna

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Infikováno rostlin/m²
Kontrola	6310	74
Pan. Plus 400, 4 ml	6730	1
MA 342, 200 ml/kg	6720	5

Účinek na Drechslera graminea: Výsledky pokusů se semeny infikovanými D. graminea, provedených v létech 1991-1993 jsou uvedeny v tabulkách 7, 8 a 9.

Tabulka 7 Výsledky jednoho polního pokusu z r. 1991 provedeného v Uppsale s ječmenem infikovaným D. graminea

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Infikováno rostlin/m²
Kontrola	3440	31
Pan. Plus 400, 4 ml	4160	2
MA 342, 300 ml/kg	4390	1

Tabulka 8 Výsledky pěti polních pokusů provedených r. 1992 s ječmenem infikovaným D. graminea. Průměry experimentů provedených ve Svalov, Nygárd, Kolback, Ultuna a Róbácksdalen

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Počet rostlin na m²	Infiko- váno/m²	Hmotnost 100 litrů, kg	Hmotnost 1000-jádra, kg
Kontrola	2590	383	101	66,2	40,2
Pan. Plus 400,4 ml	3470	381	5	66,6	39,9
MA 342, 300 ml/kg	3460	368	7	66,2	39,8

Tabulka 9 Výsledky dvou polních pokusů z r. 1993 s ječmenem infikovaným D. graminea. Průměry pokusu provedených v Kolback a Ultuna

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Infikováno rostlin/m²
Kontrola	2810	46
Pan. Plus 400, 4 ml	4160	1
MA 342, 200 ml/kg	3990	8

Účinek na Drechslera avenae: Výsledky pokusů se zrním ovsa infikovaným D. avenae, provedenými v létech 1991-1993, jsou uvedeny v tabulkách 10, 11 a 12.

Tabulka 10 Výsledky jednoho polního pokusu zr. 1991 provedeného v Uppsale s ovsem („Puhti“) infikovaným D. avenae

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Infikováno rostlin/m²
Kontrola	4940	74
Pan. Plus 400, 4 ml	4860	32
MA 342, 300 ml/kg	5090	17

Tabulka 11 Výsledky čtyř pokusů z r. 1992 s ovsem („Pahti“ a „Vítal“) infikovaným D. avenae. Průměiy pokusů provedených ve Svalóv a Ultuna

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Počet rostlin/m²	Infikovaných na 1 m²	Hmotnost 100 litrů, kg	Hmotnost 1000-jádra, g
Kontrola	3990	428	22	57,5	35,4
Pan. Plus 400, 4 ml	4080	456	13	57,8	35,5
MA 342, 300 ml/kg	4000	445	3	57,4	35,0

Tabulka 12 Výsledky polního pokusu zr. 1993 provedeného v Uppsale na ovsu („Vítal“) infikovaným D. avenae

Ošetření	Výtěžek, kg/ha	Infikováno rostlin/m²
Kontrola	7570	79
Pan. Plus 400,4 ml	7870	14
MA 342, 200 ml/kg	7680	27

Účinek na Ustilago avenae: Při polních pokusech s U. avenae byly počítány klasy pšeničné snětí na m² nebo jejich procentové množství v době zrání. Výtěžek zrna nebyl měřen. Výsledky tří pokusů provedených 1991-1993 jsou uvedeny v tabulce 13.

Tabulka 13 Výsledky tří polních pokusů provedených 1991-1993 v Uppsale na ovsu infikovaném Ustilago avenae

Ošetření	1991 klasů s pš. snětí/m²	1992 infikováno klasů, %	1993 klasů s pš. snětí/m²
Kontrola	7	10,6	95
Panoctine Plus 400,4 ml	3	8,7	netestováno
MA 342, 300*) ml/kg	1	1,7	15

*)300 ml 1991 a 1992, 200 ml 1993

Panoctine Plus 400 je fungicid obsahující 150 g/1 guazatinacetátu a 10 g/1 imazolilu.

Příklad 6

Aplikace MA 342 na semena a jiné části rostlin

Aplikace vodných směsí obsahujících MA 342 na semena

Bakteriální suspenze připravené postupem popsaným v příkladu 3 nebo 4 se smíchají jednotlivě s následujícími látkami:

práškovým talkem (Kebo Lab AB), 48 g/1 bakteriální suspenze, bakteriologickým peptonem (Oxoid Ltd.), 5 g/1 bakteriální suspenze,

Tween 20 (Měrek Ltd., povrchově aktivní činidlo obsahující polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleát, oleátový ester sorbitolu a jeho anhydridy kopolymerované s asi 20 moly ethylenoxidu), 20 ml/1 bakteriální suspenze,

-8CZ 287510 B6

Methocel (methylester celulózy, Sveda Kemi AB), 12 g/1 bakteriální suspenze,

Lissapol (ICI Agrochemicals Ltd., laurylsulfát sodný), 1 g/1 bakterální suspenze,

Bond (Newman Agrochemical Ltd., povrchově aktivní činidlo), 1 g/1 bakteriální suspenze.

Při jiných pokusech se bakteriální suspenze odstřeďují při lOOOOxg asi 10 minut a výsledné pelety se suspendují buď v 0,lM MgSO₄, nebo v peptonové vodě [5 g bakteriologického peptonu (Oxoid Ltd.) na litr vodovodní vody].

Po důkladném promísení se výsledné suspenze používají na semena, jak je popsáno v příkladu 4 pro nesmíchané bakteriální suspenze.

Aplikace vymrazováním sušených bakterií na semena rostlin.

Bakterie MA 342, vypěstěné v třepané kultuře, jak je popsáno v příkladě 4 shora, se odstředí a výsledná peleta se suspenduje v roztoku odstředěného mléka (200 g práškového odstředěného mléka, Semper AB, Švédsko, na litr sterilní destilované vody) jako vymražováním sušený ochranný prostředek. Směs se prudce ochladí ve skleněných nádobách a potom se suší vymrazováním v těchto nádobách asi 48 hodin ve vymrazovací sušárně Hetosicc (Heto Ltd., Dánsko). Získaný prášek se skladuje při 4 °C v plastikových sáčcích nebo v plastikových láhvích se šroubovacím uzávěrem až do použití. Při aplikaci na semena se prášek buď smíchá s vodou, nebo s jinými vodnými roztoky a takto se nanese na semena, jak je uvedeno v příkladě 4 pro bakteriální suspenze, nebo se prášek smíchá se semeny za sucha důkladným protřepáním prášku a semen (asi 10 g prášku na kg semen) v plastikové nádobě.

Peletování semen ošetřených MA 342. Bakterie MA 342, vypěstěné v třepané kultuře, jak je popsáno shora v příkladu 4, se smíchají objemově 1:1 s přilnavou látkou (adherentem, tj. s 2% hmotnostně/objemově vodného roztoku natriumkarboxymethylcelulózy nebo 50% hmotnost ně/objemově vodného roztoku arabské klovatiny). Semena se ošetří touto směsí jako v příkladu 4 shora. Do plastikového sáčku se potom přidá nadbytečné množství bentonitu (Dresser Minerals lne.) nebo práškového talku (Kebo Lab AB), sáček se nafoukne a důkladně se s ním třepe několik minut. Potom se semena rozprostřou na velké podnosy a nechají se pod větrákem schnout při teplotě místnosti.

Postřik rostlinných výhonků bakteriálními suspenzemi.

Bakterie MA 342, vyšlechtěné v třepané kultuře postupem uvedeným shora v příkladě 4, se dají do plastikových ručních rozstřikovačů nebo do poháněných rozstřikovačů a potom se rozstřikují na listy a výhonky rostlin. Při jiných postupech se bakterie nejprve odstředí při asi 10 000 x g po deset minut, peleta se znovu rozpustí ve vodě z vodovodu a tato výsledná bakteriální suspenze se použije k postřiku listů a výhonků rostlin.

Příklad 7

Účinky čištěných metabolitů MA 342 proti nemocím způsobovaným Drechslera teres ve skleníkových pokusech

Izolát MA 342 se kultivuje 48 hodin v živné půdě o poloviční koncentraci (15 g/1) tryptické sojové živné půdy (DFifco Ltd.) na rotační třepačce ve tmě při 18 až 20 °C. Získaná bakteriální suspenze se odstředí při 48 000 x g 30 minut a metabolity v supematantů se potom dále čistí v patronách Sep-pak C 18 (Wasters Associates) následovně:

-9CZ 287510 B6

1. 80 ml supematantu se dá do patrony aktivované 10 ml methanolu,

2. patrona se nejprve promyje 5 ml 30% ethanolu a potom 5 ml 40% ethanolu,

3. metabolity se eluují 5 ml 70% ethanolu a

4. 70% ethanolový eluát se odpaří v rotační odpařovačce až zůstane asi 1,5 ml vodného roztoku, který se potom zředí vodovodní vodou na objem 6,5 ml.

Semena ječmene odrůdy „Golf“, přirozeně infikovaná D. teres, se ponoří do tohoto 6,5 ml vodného roztoku metabolitů na 30 minut a potom se vysejí do misek v každé po 50 semenech. Misky se přikryjí skleněnými víčky a dají se do tmy při 6 °C. Po devíti dnech se sklíčka sejmou a misky se dají do skleníku s teplotou 15 až 22 °C na asi dva týdny. Vyklíčené rostliny a počet napadení nemocí se potom vyhodnocuje způsobem popsaným shora v příkladu 4. Jako kontroly se použijí 1) neošetřená semena a 2) semena ošetřená supematantem obsahujícím MA 342 buňky, který nebyl čištěn patronou Sep-pak.

Tabulka 14 Účinek čištěných metabolitů MA 342 a supematantu obsahujícího buňky MA 342 proti D. teres na ječmenu v typickém skleníkovém testu

Ošetření	Vyklíčené rostliny, %	Rostliny napadené na prvním listu, %
Neošetřená kontrola	97,0	21,6
Supematant s buňkami MA 342	99,0	1,0
Odpařený eluát bez buněk	99,0	0,0

Příklad 8

Výsledky srovnávacích testů izolátu MA 342 s 11 jinými izoláty Pseudomonas chlororaphis získaných z různých sbírek kultur

Bylo testováno 11 různých nešvédských izolátů Pseudomonas chlororaphis, uvedených v tabulce 1, společně s izolátem MA 342, a to na účinek proti listové skvrnitosti ječmene a aby se vyvolaly reakce v biochemických testech podle testovacího systému API 20 NE. Kromě toho byly izoláty srovnávány co do zjevu kolonií a tvorby krystalů na agarových deskách. Uvedených 11 nešvédských izolátů bylo z různých zemí a jsou uloženy ve čtyřech dobře známých sbírkách kultur (tabulka 15).

Zkouška schopnosti inhibovat onemocnění ve skleníkových testech. Testy se provádějí s ječmenem infikovaným Drechslera teres, jak je popsáno v příkladu 4. Všechny izoláty se testují současně, aby se dosáhlo vhodného srovnání. Jak vyplývá z tabulky 15, z výsledků je zřejmé, že MA 342 je unikátní v tom smyslu, že ani jeden z ostatních testovaných izolátů neměl takové vlastnosti, jako MA 342 při tomto druhu testu, a to schopnost inhibovat infekci vyvolávanou Drechslera teres.

-10CZ 287510 B6

Tabulka 15 Označení, země původu a účinek MA 342 a 11 jiných izolátů P. chlororaphis proti infekci D. teres u ječmene v skleníkových testech

Označení	Země	Účinek na skvrnitost listů ve skleníkových testech. Po aplikaci izolátů infikováno rostlin, %
MA342	Švédsko	9
USDA B2075	Československo	53
USDA B1869	Nový Zéland	60
USDA B14874	USA, Kolorado	56
USDA B14869	USA, Illinois	58
USDA B1854	USA, Loisiana	43
NCTC 10686	Anglie	54
NCTC 7357	Anglie	58
DSM 6508	Německo	56
ATCC 9446	USA	61
ATCC 17414	USA	50
ATCC 17811	USA	58
neošetřená kontrola		71

Vyvolání reakcí v biochemických testech podle testovacího systému API 20 NE. Testy se provádí, jak bylo popsáno shora.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 16. Vyplývá z nich, že MA 342 je také v tomto ohledu unikátní a lze ho rozlišit od ostatních 11 testovaných izolátů. O někteiých izolátech testovaných podle 10 tohoto testu nelze uvažovat, že by byly blízké pro druh Pseudomonas chlororaphis.

Tabulka 16 Reakce vyvolané různými testovanými izoláty při biochemických testech podle systému API 20 NE. „+“ značí kladnou reakci a značí žádnou nebo negativní reakci

Vlastnost testovaná dle API 20 NE	Testovaný izolát
MA 342	B 2075	B 1869	B 14874	B 14869	B 1854	NCTC 10686	NCTC 7357	DMS 6508	ATCC 9446	ATCC 17414	ATCC 17811
Redukce dusičnanu	-	-	4-	-	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Produkce indolu
Kyselina z glukózy
Arginindihydroláza		4-	4-	4-	-	4-	+	4-	+	+	4-	4-
Ureáza
Hydrolýza eskulinu
Hydrolýza želatiny	4-	4-	-	-	-	4-	4-	4-	-	+	+	4-
B-galaktosidáza
Asimilace glukózy	4-	4-	4-	4-	4-	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Asimilace arabinózy	-	4-	4-	-	-	-	4-	-	4-	-	-	-
Asimilace manózy	-	+	+	-	4-	4-	4-	4-	4-	+	+	+
Asimilace mannitu	4-	4-	4-	-	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Asimilace glukozaminu	-	4-	4-	-	-	4-	4-	+	4-	4-	4-	4-
Asimilace maltózy
Asimilace glukonátu	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Asimilace kaprátu	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Asimilace adipátu	-	-	-	-	-	-	4-	-	-	-	-	-
Asimilace maiátu	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Asimilace citrátu	+	+	4-	4-	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	+
Asimilace fenylacetátu	-	-	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	-	-	4-
Cytochromoxidáza	+	-	4-	4-	+	4-	-	4-	4-	4-	4-	4-

Srovnání výskytu kolonií a tvorby krystalů. Izoláty byly kultivovány na Petriho miskách na TSA 10 agaru, jak bylo uvedeno shora. Byly pozorovány malé rozdíly ve vznikajících koloniích mezi všemi různými izoláty, avšak všechny izoláty nebylo možné takto rozlišit. Izolát MA 342 byl

-11CZ 287510 B6 však jediným, který vytvářel typické křišťálové krystaly v agaru, a proto touto vlastností mohl být rozlišen od ostatních izolátů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kmen Pseudomonas chlororaphis MA 342, deponovaný pod přírůstkovým číslem NCIMB 40616, nebo jeho biologicky čisté kultury, mající schopnost produkovat antipatogenicky aktivní metabolity, nebo jejich mutanty v podstatě se stejnými vlastnostmi jako mateřský kmen.
2. Prostředek ke kontrole nemocí rostlin způsobovaných patogenními houbami, vyznačený tím, že jako účinnou látku obsahuje mikroorganizmus podle nároku 1 nebo jeho kultivační zákvas, obsahující jeho antipatogenicky účinné metabolity.
3. Použití prostředku podle nároku 2 proti patogenu, jímž je houba Drechslera teres.
4. Použití prostředku podle nároku 2 proti patogenu, jímž je houba Drechslera graminea.
5. Použití prostředku podle nároku 2 proti patogenu, jímž je houba Drechslera avenae.
6. Použití prostředku podle nároku 2 proti patogenu, jímž je houba Microdochium nivale.
7. Použití prostředku podle nároku 2 proti patogenu, jímž je houba Tilletia caries.
8. Použití prostředku podle nároku 2 proti patogenu, jímž je houba Ustilago avenae.
9. Prostředek podle nároku 2, vyznačený tím, že obsahuje účinnou látku ve spojení s nosičem přijatelným v zemědělství.
10. Prostředek podle nároku 9, vyznačený tím, že obsahuje účinnou látku ve spojení s kapalným nosičem.
11. Prostředek podle nároku 9, vyznačený tím, že obsahuje účinnou látku impregnovanou v tuhém pórovitém materiálu.
12. Prostředek podle nároku 9, vyznačený tím, že dále obsahuje aditiva působící jako adhezní činidlo.
13. Prostředek podle nároku 9, vyznačený tím, že dále obsahuje zdroje živin.
14. Způsob kontroly nemocí rostlin způsobovaných patogenními houbami, při němž se do prostředí, kde se má inhibovat činidlo vyvolávající nemoci, aplikuje účinná dávka aktivní látky, vyznačený tím, že se jako účinná látka aplikuje mikroorganizmus podle nároku 1 nebo jeho kultivační zákvas obsahující antipatogenicky aktivní metabolity nebo jejich deriváty.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačený tím, že se účinná látka aplikuje na semena.
16. Způsob podle nároku 14, vyznačený tím, že se účinná látka aplikuje na rostlinné vegetativní propagační jednotky.
17. Způsob podle nároku 14, vyznačený tím, že se účinná látka aplikuje na rostliny.
18. Způsob podle nároku 14, vyznačený tím, že se účinná látka aplikuje na kultivační prostředí, v němž se pěstí nebo má pěstit rostlina.