BG62753B1

BG62753B1 - Състав и метод за контролиране на заболявания порастенията

Info

Publication number: BG62753B1
Application number: BG100919A
Authority: BG
Inventors: Berndt Gerhardson; Annika Gustafsson; Tiiu Jerkeman; Britt-Marie Jingstroem; Lennart Johnsson; Margareta Hoekeberg
Original assignee: Svenska Lantmaennen,Riksfoerbund Ek.Foer.
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1996-10-18
Publication date: 2000-07-31
Also published as: PL186440B1; NO316012B1; JPH10502803A; EE03414B1; RU2143199C1; NO964359D0; FI119994B; AU690683B2; LV11718A; FI964162A; NL350040I2; CN1148791A; SK281576B6; HU220582B1; CZ287510B6; ATE183616T1; SE502660C2; WO1995028085A1; DK0756454T3; HU9602828D0

Abstract

Изобретението се отнася до нов щам Pseudomonas chlororaphis MA 342, депозиран в The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, Scotland под Х NCIMB 40616, или до негови мутанти със същите характеристики, или до негови антипатогенноактивни метаболити или производни и до тяхното използване в състави и методи за контролиране на гъбични заболявания по растенията.

Description

Област на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до защитни продукти на растенията. По-специално, изобретението се отнася до нов щам на бактерийния вид Pseudomonas chlororaphis и използването на състави ^съдържащи този бактериен щам или антибиотични вещества, получени от този щам в растителната продукция по такъв начин, че да се защитят растенията срещу атаки от фитопатогенни микробни агенти.

Предшестващо състояние на техниката

Няколко агенти от микробно естество притежаващи способността да предизвикват заболявания по растенията причиняват значителни щети, и следователно и икономически загуби при засетите растения. Много от тях атакуват листата и/или други въздушни части на растението и след това , обикновено, достигат до нови незаразени посеви чрез преносими по въздуха спори. Други се отправят от една генерация посеви на следващата при поникване на семената, като няколко икономически важни агенти ^предизвикващи заболявания са създадени в почвата, а останалите, повече или по-малко, са инактивирани в почвата докато податливата реколта израства.

Процедурите ^упражнявани за контрол на микробни агенти^предизвикващи заболявания при посевите често са скъпи, но при повечето подрастващи посевни системи са необходими от икономическа гледна точка. Една от широко използваните процедури е обработване с биостатици или биоцидни химикали. Те в повечето случаи се прилагат като спрейове върху подрастващите посеви, като лечебни средства за семена или корени или като почвени дезинфектанти. Други стандартни методи са за развиване на устойчивост и управление на самите посевни системи.

Всички тези стандартни контролни методи имат някои недостатъци. Управляването на посевните системи е ефективно или удобно само за обикновени болестни проблеми. Също развиването в посевните растения на устойчивост е възможно или подходящо само в обикновени случаи и за дълго време, като получената устойчивост може да бъде разрушена след известно време чрез появяването на нови щамове на патогенния фактор предизвикващ заболяване. Често, химическите съединения са високоефективни, но те създават нежелателни ефекти в околната среда, изискват внимателна работа тъй като са много рискови за човешкото здраве, като те също могат да бъдат неефективни, където се развиват устойчиви патогенни щамове.

Използването на агенти за биологичен контрол или биопестициди може да бъде по-ефективно или повече за предпочитане отколкото използването на други контролни методи, ето защо такива агенти се изпробват обширно. Известни са няколко бактерийни и гъбни щама за подтискане израстването на различни микробни агенти, предизвикващи заболявания. За да бъдат ефективни и използваеми, те трябва да бъдат стабилни, да дават възпроизводими резултати на полето и там да бъдат с възможности за прилагане при полеви условия. Регистрирани са няколко, които задоволяват тези изисквания и така се използват като търговски продукти.

Кратко описание на изобретението

Настоящото изобретение осигурява агент за биологичен контрол на патогенните атаки при растенията » по - специално при общодостъпни подрастващи растения. Осигурен е нов щам (МА 342) на бактерията Pseudomonas chlororaphis показващ желаните характеристики. Изолатът е депозиран в The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), Aberdeen, Scotland на 14 февруари 1994 г. по условията на Будапещенския договор и получи признаване NCIMB №40616.

Изобретението също осигурява състав за контролиране на заболяване по растенията, съдържащ като активен компонент новия щам МА 342 или негови мутанти с по същество същите характеристики или антипатогенно активни метаболити или техни производни.

По — нататък, изобретението осигурява метод за контролиране на заболявания по растенията^използващ новия щам МА 342 или негови мутанти с^по същество^ същите характеристики или антипатогенно активни метаболити или техни производни.

Кратко описание на фигурата фиг.1: Тази фигура показва мастнокиселинен профил, получен с микробната идентификационна система (MIDI, Newark Ltd; USA) на бактерийния изолат МА 342.

Подробно описание на изобретението

По-долу следва характеристика на новия бактериен щам и описание на предпочитани методи за пролиферация на щама и формулировки и приложения на полето и в оранжерии. По-нататък са предложени няколко пример. ., за да се илюстрират, но не и да се ограничат, методът и съставът на изобретението.

Характеристика на новия бактериен щам МА 342 Морфологични характеристики: Морфологична^ колония върху TSA 10 ( 10д соева хранителна среда TRYPTIC (Difco Ltd.); 12g технически arap (Oxoid Ltd.) в 1000 ml дестилирана вода) е сферична, бяла с умерено изпъкнали колонии, които образуват добре видими хиаминови кристали в агара при високи клетъчни гъстоти. Той е грам - отрицателна пръчка, която показва светложълта флуоресценция върху среда В Kings ( 1.5g К₂НРО₄; 1.5g MgSO₄.7H₂O; 20g протеозен пептон (Difco Ltd.); 10ml глицерол, 15g Bacto arap (Difco Ltd.) в 1000ml дестилирана вода).

Мастнокиселинен анализ: Мастнокиселинният профил на бактерията е показан на фиг.1. Този анализ се осъществява като се използва микробната идентификационна система (MIDI Ltd.; Newark, USA), версия 3.7. Съгласно тази тестваща програма, МА 342 е най-сходен до Pseudomonas chlororaphis. с установен индекс 0.705.

Биохимични характеристики

Изпитани характеристики no API 20 NE *, бърз тест	Реакция на изолата МА 342
Нитратна редукция	-
Индолно производство	-
Киселина от глюкоза	-
Аргининова дихидролаза	+
Уреаза	-
Ескулинова хидролиза	-
Желатинова хидролиза	+
В - галактосидаза	-
Глюкозно асимилиране	+
Арабинозно асимилиране	-
Манозно асимилиране	_?
Манитолно асимилиране	+
N-ацетил-глюкозаминно асимилиране	-
Малтозно асимилиране	-
Глюконатно асимилиране	+
Капринатно асимилиране	-
Адипатно асимилиране	-
Малатно асимилиране	+
Цитратно асимилиране	+
фенил-ацетатно асимилиране	-
Цитохромна оксидаза	+

*- API System Ltd.; France

Изпитани характеристики при допълнителни тестове	Реакция на изолата МА 342
Леваново производство	-
Ксилозно асимилиране	_?
Сорбитолно асимилиране	+?

Предпочитани методи за пролиферация на щама рецептури и приложения на полето или в оранжерии

Количества от активния щам най-добре се получават чрез ферментационен процес, който включва инокулиране на проба от чиста култура на щама в разклащана културална течност или във ферментатор_} съдържащ подходяща ферментационна среда. Щамът може да се развие въху стерилна повърхност, например агарова повърхност, и когато се развие, клетките могат да бъдат суспендирани във вода или друга течна среда известна от нивото на техниката. Средата, в която става израстването, по принцип j може да бъде всяка бактерийна среда подходяща за израстване, известна от нивото на техниката, ферментацията се осъществява при достатъчна концентрация на клетки, например около 5 - 10⁹ cfu (части образуващи колония) / ml за получени течни култури. Така получената ферментационна хранителна среда или бактерийна суспензия може да бъде използвана като такава за употреба при защита на растението, или може да бъде обработена или формулирана преди използване.

При един от начините за обработка, бактерийните клетки във ферментационната хранителна среда могат да бъдат убити, или центруфугирани и получената хранителна среда или супернатанта, съдържаща бактерийни метаболити, може да бъде използвана за растително защитни цели, с или без предварително пречистване и/или концентриране. Бактерийните суспензии и ферментационни хранителни среди мотат също да бъдат хомогенизирани чрез смесване с едно или повече съединения или групи от съединения^известни от нивото на техниката, като осигурените съединения са съвместими с бактерийните щамове или техните антипатогенно активни метаболити или производни. Подходящи съединения могат да бъдат прахообразни добавки или твърди носители, като талк, каолин, бентонит или монтморилонит, омокряеми прахове известни от нивото на техниката, въглеродни хранителни източници (като глюкоза, сукроза и фруктоза) или комплексни бактерийни храни (като дрождев екстракт, бактериологичен пептон и триптон), метални соли, соли от мастни киселини, естери на мастни киселини, йонни или нейонни повърхностно активни вещества, растителни храни, растежни регулатори, фунгециди, инсектициди, бактерициди и други подобни. Бактерийните суспензии и ферментационни хранителни среди могат да бъдат изсушени или изсушени чрез сублимация преди или след смесване с подходящи съедиения и получените продукти използвани за растителна защита. Подходящ начин на изсушаване е например въздушно сушене на верникулит доставен с бактериална ферментационна хранителна среда.

Бактерийни и метаболитни препарати могат да бъдат прилагани по всякакъв известен начин за обработване на семена, разпространени растителни части, растения и почва с бактерийни щамове. В съответствие с предназначената цел и преобладаващите обстоятелства могат да бъдат избрани следните начини на обработване: разпръскване, пулверизиране, напудряне, диспергиране, пелетизиране, потапяне или заливане. Изгодни количества на приложение за обработване на семена са обикновено от 10¹¹ до 10¹² cfu/ha, а за разпръскване 10¹² до 10¹⁴ cfu/ha или съответни количества бактерийни метаболити.

Пример 1

Изолиране на микроорганизъм МА 342

Изкопаните корени от растението Empetrum nigrum се промиват в стерилна чешмяна вода до отстраняване на полепналата почва. Отрязва се късче от младо коренче, 2-3 сантиметра дълго, и се обработва при стерилни условия. Късчето се взема от горната част на върха на корена. Правят се малки разрези в късчето от корена с обгорен скалпел. След това кореновото късче се трие по повърхността на arap TSA 10. След развиване на бактерията, МА 342 се отбира и се развъжда върху TSA 10.

Пример 2

Съхраняване на микроорганизъм МА 342

Чистата култура се замразява дълбоко в малки ампули при -70° С. Като замразяващ защитен агент се използва

10% глицерол в чешмяна вода, pH се довежда до 7.15 след автоклавиране. След замразяване при -70° С, ампулите се съхраняват при -20°.

За дълъг период на съхранение изолатът се замразява изсушен. След израстване за 48 часа върху arap TSA 10, бактерийния слой се отстъргва от агаровата повърхност, смесва се с изсушения чрез сублимиране агент (50д декстран Т 70 (Pharmcia Fine Chemicals Ltd.); 50g Na-Lглутамат (Kebo AB) в 1000ml дестилирана вода), налива се в малки ампули (20ml) и се поставя в замразяваща сушилня Hetoesicc (Heto Ltd., Denmark) за 24 часа. След изсушаването чрез замразяване ампулите херметично се запояват с каучукови запушалки и се съхраняват при 4° С.

Пример 3

Ефект на МА 342 срещу Microdochium Nivale при първоначални оранжерийни посявания

Бактерията се прилага спрямо семена на пшеница^, както следва: 24 часови култури върху TSA 10 се развиват при 15° С, остъргват се от агаровата повърхност в 9 сантиметрово блюдо на Петри и се смесват с 40ml хранителна среда (SNB: 18д захароза; 5д бактериен пептон (Oxoid Ltd.); 2д дрождев екстракт (Oxoid Ltd.); 0.5g К₂НРО₄ и 0.25g MgSO₄.7H₂O в 1000ml дестилирана вода и pH се довежда до 7.2 - 7.4) и 40ml на 2% (w/v) разтвор на натриева карбоксиметил целулоза (СМС) в стерилна дестилирана вода. Тази смес се излива върху семената. След 20 минути излишната смес се излива и семената се изсушават с вентилатор цяла нощ.

За всяко обработване при тези оранжерийни посявания, две чаши са посяти с 50 семена във всяка чаша. Чашите са 18 сантиметра в диаметър и 4 сантиметра високи и се пълнят до 2/3 с нестилизирана търговска торфена смес (Enhetsjord К Normal), смесена с 20% (v/v) пясък.

Зимните пшенични семена (cv. “Kosack“) изкуствено се заразяват с М. nivale . за да се обработят с бактерия. Патогенът се култивира в продължение на 7 дни в картофено декстрозна хранителна среда (24д картофено декстрозна хранителна среда (Difco Ltd.) на 1000ml дестилирана вода) при стайна температура върху ротационен вибратор. Получената суспензия се хомогенизира с кухненска бъркалка и се излива върху семената. След 30 минути течността се отлива и семената се изсушават с вентилатор цяла нощ. Така заразените семена след това се обработват с МА 342 и се посяват в чаши, както е описано по-горе.

След посяване, чашите се покриват със стъклени похлупаци и се поставят на тъмно при 6° С. След 5 дни похлупаците се отварят, всяка чаша се промива със 100ml вода и се поставя вътре в 5-литрова камера, която се поддържа от 2 дървени пръчки. След това чашите се поставят в оранжерия при 12 -15° С за 8 дни.

Тестват се следните обработки на семената:

1. Р. chlororabhis щам МА 342, смесен с SNB/CMC, върху семена заразени с М. nivale .

2. Семена заразени с М. nivale. като контролно заболяване.

3. Необработени семена като здравословен контрол.

Подтискането на ефекта на заболяване се отбелязва като проценти появили се здрави (= без мицел) растения при това посяване. Резултати от първично посяване на М. nivale са показани в таблица 1.

Таблица 1. Ефект на МА 342 върху поникване и развитие на заболяване при зимна пшеница, причинено от семена заразени от М. nivale

Обработване	Процент(%) на поникване	Процент(%) здави растения от това посяване
1. МА 342	87	81
2. Контрол на заболяването	13	7
3. Нетретирана контрола	90	89

Пример 4

Ефект на МА 342 срещу Drechslera teres при вторични оранжерийни посявания

За тези посявания изолатът МА 342 израства в продължение на 48 часа в полуиздържлива (15g/l) соева хранителна среда Tryptic (Difco Ltd.) върху ротационен вибратор на тъмно при 18 - 20° С. Семена от култивирания ечемик “ Golf “ природно заразени с D. teres е смесват с 300ml от получената бактерийна суспензия на kg семена в пластмасова камера и след смесването камерата се разклаща за около 4 минути. Така обработените семена се изсушават с вентилатор при стайна температура в продължение на 1 ден и след това се посяват в чаши, както е описано в пример 3.

Три чаши посяти за обработване се поставят отначало на тъмно при 6° С за 7 дни и след това в оранжерия при около 20° С} както е описано в пример 3. За отчитане ефектите от обработването се брои повторяемостта на поникналите растения и повтаряемостта на растения с първоначална атака на първото листо. Бактерийнияефект се отчита спрямо нетретирана контрола и семена обработени с фунгццида Panoctine Plus 400 (guazatine 150g/l. + imazalil 10g/I), Rhone - Poulenc Ltd.; при доза от 4 ml на kg семена.

Таблица 2. Ефект на МА 342 и Panoctine Plus 400 срещу

D. teres за ечемик при оранжерийно вторично посяване.

Обработване	Процент поникнали растения	Процент растения с атака върху първото листо
Контрол	92.5	13.0
Panoctine Plus 400, 4ml/kg	95.5	0.0
МА 342, 300ml/kg	96.1	0.0

Пример 5

Ефект на МА 342 върху растителни патогени при полеви експерименти

Полеви експерименти, означени като произволни блокове и с три до осем повторения, имат земя с раазлични размери при експериментите, която варира от 0.15т (един експеримент с Т. caries ) до около 15т (повече експерименти). Експериментите се провеждат в различни области на Швеция и в повечето случаи върху глинести почви с около 3% хумусно съдържание.

Обработванията на семена с бактерии и с Panoctine Plus 400 са направени, както е описано в пример 4 по-горе. След обработването семената се изсушават с вентилатор и се съхраняват при стайна температура за различно време преди да се посеят в полевите площи. Всички семена, освен тези заразени с Т, caries , са природно заразени или заразени с различни заболявания за изследване. Семена на зимна пшеница изкуствено се заразяват със спори на Т. caries чрез смесване на 2д смачкани Т. caries с 1 kg пшенични семена.

Ефект на МА 342 върху Tilletia caries

Ефектът се изучава като повторение на заразени класове по време на зреене. Получените резултати при 2 опита през 1991/92 г. и при 2 опита през 1992/93 г. са показани в таблица 3. Разликата между бактерийното обработване и фунплцидното обработване е значителна през 1992/93 г.

Таблица 3. Ефект на МА 342 бактерийна суспензия срещу семеуюраждащо заразяване с Tilletia caries.

Обработване	Процент заразени класове,1991/92 г.	Процент заразени класове, 1992/93 г.
Контрола	23	65
Panoctine 400 \ 4ml/kg	2	24
МА 342, 300mg/kg	0	9

* Panoctine 400 (guazatine 150g/l), Rhone - Poulenc Ltd.

Ефект на МА 342 върху Drechslera teres, D. Graminea, D.avenae и Ustilago avenae

В полевите експерименти c тези патогени се измерват броя на поникналите растения на т²у броя на заразените растения на т², и в допълнение, в повечето от експериментите съшо се измерват: i) зърнен добив, ii) тегло на 1000 ядки и iii) тегло на хектолитър.

Ефект върху Drechslera teres: Резултатите от полеви експерименти, включени в периода 1991 - 1993 г. и изследваните ефекти срещу заразяване на ечемика с D. teres са показани в таблици 4, 5 и 6.

Таблица 4. Резултати от 4 полеви експерименти с ечемик^ заразен с Drechslera teres през 1991 г. Средни величини от 4 експерименти проведени в Alnarb, Lanna, Strangnas и Ultuna.

обработване	добив kg/ha	№/ растения на m²	заразени растения/m²	хектолитрово тегло, kg	тегло на 1000 ядки.д
контрола	4970	361	47	64.7	41.5
Pan. Plus 400, 4 ml	5390	353	1	66.3	43.8
МА 342, 300 ml/kg	5480	353	1	66.0	43.7

Таблица 5. Резултати от 5 полеви експерименти при ечемик^заразен с Drechslera teres през1992 г. Средни величини от експерименти проведени в Svalof, Nygard, Kolback, Ultuna и Robacksdalen.

обработване	добив kg/ha	N«/ растения на т²	заразени растения/т²	хектолитрово тегло, kg	тегло на 1000 ядки,д
контрола	4290	358	48	67.9	51.7
Pan. Plus 400, 4 ml	4380	378	1	67.8	50.5
МА 342, 300 ml/kg	4300	380	1	68.3	52.6

Таблица 6. Резултати от 2 полеви експеримента при ечемик, заразен с Drechslera teres през 1993 г. Средни величини от експерименти проведени в Kolback и Ultuna.

обработване	добив kg/ha	заразени растения /т²
контрола	6310	74
Pan. Plus 400, 4ml	6730	1
МА 342, 200 ml/kg	6720	5

Ефект върху Drechslera graminea: Резултатите от експерименти със заразени семена с Drechslera graminea^ проведени през 1991 -1993 г. са показани в таблици 7, 8 и 9.

Таблица 7. Резултати от 1 полеви експеримент през

1991 г. проведен в Uppsala с ечемик/заразен с Drechslera graminea.

обработване	добив kg/ha	заразени растения/m²
контрола	3440	31
Pan. Plus 400, 4ml	4160	2
MA 342, 300 ml/kg	4390	1

Таблица 8. Резултати от 5 полеви експерименти при ечемикузаразен с Drechslera graminea проведени през 1992 г. Средни величини от експерименти^проведени в Svalof, Nygard, Kolback, Ultuna и Robacksdalen.

обработване	добив kg/ha	№/ растения на m²	заразени растения/m²	хектолитрово тегло, kg	тегло на 1000 ядки,д
контрола	2590	383	101	66.2	40.2
Pan. Plus 400, 4 ml	3470	381	5	66.6	39.9
MA 342, 300 ml/kg	3460	368	7	66.2	39.8

Таблица 9. Резултати от 2 полеви експеримента при ечемикраразен с Drechslera graminea през 1993 г. Средни величини от експерименти_;проведени в Kolback и Ultuna.

обработване	добив kg/ha	заразени растения/т²
контрола	2810	46
Pan. Plus 400, 4ml	4160	1
МА 342, 200 ml/kg	3990	8

Ефект върху Drechslera avenae: Резултатите от експерименти при овесени семена^ заразени с Drechslera avenae^проведени през 1991 - 1993 г. са показани в таблици 10, 11 и 12.

Таблица 10. Резултати от 1 полеви експеримент през 1991 г.^проведен в Uppsala с овес („Puhti“)_}заразен с Drechslera avenae.

обработване	добив kg/ha	заразени растения/т²
контрола	4940	74
Pan. Plus 400, 4ml	4860	32
МА 342, 300 ml/kg	5090	17

Таблица 11. Резултати от 4 полеви експерименти при овес („Puhti“ и „Vital“ )jзаразен с D. avenae_;проведени през 1992 г. Средни величини от експерименти проведени в Svalof и Ultuna.

обработване	добив kg/ha	№/ растения на т²	заразени растения/т²	хектолитрово тегло, kg	тегло на 1000 ядки.д
контрола	3990	428	22	57.5	35.4
Pan. Plus 400, 4 ml	4080	456	13	57.8	35.5
МА 342, 300 ml/kg	4000	445	3	57.4	35.0

Таблица 12. Резултати от полеви експерименти през

1993 г.^проведен в Uppsala с овес („Vital“ )j заразен с D.avenae.

обработване	добив kg/ha	заразени растения/т²
контрола	7570	79
Pan. Plus 400, 4ml	7870	14
МА 342, 200 ml/kg	7680	27

Ефект върху Ustilago avenae: При полевите експерименти житни класове с главня U. avenae на т² или процент класове с главня по житото, са изучени по време на зреене. Добивът на зърно не е измерван. Резултатите от 3 експеримента^роведени през 1991 - 1993 г. са показани в таблица 13.

Таблица 13. Резултати отЗ полеви експерименти проведени през 1991 -1993 г. в Uppsala с овес, заразен с Ustilago avenae.

обработване	1991 г., класове с главня по житото/т²	1992 г., % заразени класове	1993 г., класове с главня по житото/т²
контрола	7	10,6	95
Pan. Plus 400, 4ml	3	8,7	не изследвано
МА 342, 300¹ ml/kg	1	17	15

¹ 300ml през 1991 и 1992 г.; 200ml през 1993 г.

Пример 6

Приложение на МА 342 спрямо семена и други части на растенията

Приложение на водни смеси съдържащи МА 342 спрямо семена. Бактерийни суспензии^олучени^както е описано в пример 3 или_;както е описано в пример 4 по-горе се смесват с вско от следващите вещества или съединения:

Талк на прах (Kebo Lab AB), 48g/l бактерийна суспензия

Бактериологичен пептон (Oxoid, Ltd.), 5g/l бактерийна суспензия

Tween 20 (Merck Ltd.), 20ml/l бактерийна суспензия

Метоцел (целулозен етер, Sveda Kemi AB), 12g/l бактерийна суспензия

Лисапол (ICI Agrochemicals Ltd.), 1 g/1 бактерийна суспензия

Бонд (Newman Agrochemical Ltd.), 1 g/1 бактерийна суспензия

При други експерименти бактерийните суспензии се центрофугират при 10,000 х g за около 10 минути и получените топчета се ресуспендират^ както в 0.1 М MgSO₄така и в пептонова вода (5д бактериологичен пептон (Oxoid, Ltd.) на литър чешмяна вода).

След пълно смесване, получените суспензии се прилагат спрямо семената^както е описано в пример 4 за несмесваеми бактерийни суспензии.

Прилагане на бактерии_?изсушени чрез сублимация_гспрямо семена на растения. Бактериите МА 342 се развиват при разклащане , както е описано в пример 4 по-горе, центруфугират се и получената гранула се ресуспендира в разтвор от каймак на мляко (200д каймак от мляко на прах, Semper AB, Sweden, на литър стерилна дестилирана вода) като изсушен чрез сублимация защитен агент. Сместта се замразява в стъклени буркани и след това се изсушава чрез сублимиране в тези буркани за около 48 часа в сублимационна сушилня Hetosicc (Heto Ltd.; Denmark). Полученият прах се съхранява при 4° С в пластмасови камери или в пластмасови бутилки с винтова капачка преди да се използва. За приложение спрямо семената прахът се смесва както с вода, така и с други водни разтвори и след това се прилага спрямо семената^както е описано в пример 4 за бактерийни суспензии, или той се смесва със семената в сухо състояние чрез пълното му размесване с тях (около 10д прах на kg семена) в пластмасов контейнер.

Гранулирани семена₇обработени с МА 342. Бактерийте МА 342 се развиват при разклащане на културата;както е описано в пример 4 по-горе, като се смесват в съотношение 1:1 с прилепител (2%w/v воден разтвор на натриева карбокси-метил целулоза или 50% w/v воден разтвор на гума арабика). Семената се обработват с тази смес; както в пример 4 по-горе. Излишното количество бентонит (Dresser Minerals Inc.) или талк на прах (Kebo Lab АВ) след това се добавя към пластмасовата камера, пластмасовата камера се напълва с въздух и интензивно се разклаща за 2 минути. След това семената се разстилат върху големи табли под вентилатор и се оставят да бъдат изсушени при стайна температура.

Напръскване на израстващи растения с бактерийни суспензии. Бактериите МА 342 се развиват при разклащане на културата; както е описано в пример 4 по-горе, напълват се в пластмасови ръчни пулверизатори или в прахообразни пулверизатори и след това се напръскват върху листата и израсналите части на растението. При други обработки бактериите първо се центрофугират при около 10.000 х g за 10 минути, гранулата се ресуспендира в чешмяна вода и така получената бактерийна суспензия се използва за напръскване на листата и израсналите части на растението.

Пример 7

Ефекти на пречистени метаболити от МА 342 срещу заболявания,причинени от Drechslera teres при оранжерийни експерименти

Изолатът МА 342 се развива в продължение на 48 часа в полутрайна (15g/l) Tryptic соева хранителна среда (Difco Ltd.) върху въртящо се сито на тъмно при 18 - 20° С. Получената бактерийна суспензия се центруфугира при 48,000 g за 30 минути и метаболитите в супернатантата след това се пречистват с патрони Sep - рак С 18 (Waters Associates) както следва:

1. 80ml супернатанта се добавят към Sep - рак като се активират с 10ml метанол.

2. Sep - рак се промива първо с 5ml 30% етанол и след това с 5ml 40% етанол.

3. Метаболитите се елюират с 5ml 70% етанол.

4. 70%-ния етанолен елюат се изпарява в ротационен изпарител j докато остане около 1.5ml воден разтвор. След това той се разрежда с чешмяна вода до обем 6.5ml.

Семена от култивирания ечемик „Golf“ природно заразени с D.teres се потопяват в този 6.5ml воден разтвор на метаболитите за 30 минути и след това се посяват в чаши с по 50 семена във всяка чаша. Чашите се покриват със стъклени похлупаци и се поставят на тъмно при 6° С. След 9 дни похлупаците се отстраняват и чашите се поставят в оранжерия при 15 - 22° С за около 2 седмици. След това се изследват поникналите растения и болестните атаки^както е описано в пример 4 по-горе. Като контроли се използват:

1) необработени семена и 2) семена^, обработени със супернатанта непречистена с Sep - рас и съдържащи клетки МА 342.

Таблица 14. Ефект от пречистени метаболити от МА 342 и супернатанта^съдържащи клетки МА 342 срещу D. teres при ечемик при типични оранжерийни изследвания.

обработване	процент поникнали растения	процент растения с атака върху първото листо
необработена контрола	97,0	1,0
супернатанта с клетки МА 342	99,0	1,0
изпарен извънклетъчен елюат	99,0	0,0

Пример 8

Резултати от сравнителни изпитания на изолат МА 342 и други изолати на Pseudomonas chlororaphis полу чени от различни културни колекции

Единадесет различни не шведски изолати на Pseudomonas сЬюгогарп13^притежаващи означения иложени в таблица 1 се изследват заедно с изолата МА 342 и за ефект срещу листно заболяване при ечемика и за предизвикване на реакции в биохимичните тестове съгласно системата за изпитване API 20 NE. В допълнение, изолатите се сравняват по външен вид на колонията и кристалообразуване върху агарови пластини. Единадесетте не шведски изолати са от различни страни и са депозирани в 4 различни добре реномирани културни колекции (табл. 1).

Изследване на възможността за подтискане на заболявания при оранжерийни тестове

Изследванията се провеждат с ечемик j заразен с Derechslera teres, както е описано в пример 4, и всички изолати такъв начин, че се изследват едновременно по да се постигне адекватно сравнение.

Както е видно от таблица 1, резултатите показват, че МА

342 очевидно е уникален такъв смисъл, че нито един от другите изолати изследвани тук нямат свойството както МА 342 при този вид изследване, тоест способността да подтискат заразяване с Derechslera teres.

Таблица 1. Обозначения, страна на произхода и ефекти на МА 342 и 11 други изолати Р. chlororabhis срещу заразяване на ечемик с D. teres при оранжерийни изследвания.

Обозначение на изолата	Страна на произхода	Ефект върху листна повърхност при оранжерийни изследвания. Процент заразени растения след обработване с изолата по проблема поставен за разискване
МА 342	Швеция	9
USDA В2075	Чехословакия	53
USDA В1869	Нова Зеландия	60
USDA В14874	САЩ, Колорадо	56
USDA В14869	САЩ, Илинойс	58
USDA B1854	САЩ, Луизиана	43
NTCT 10686	Англия	54
NTCT 7357	Англия	58
DSM 6508	Германия	56
ATCC 9446	САЩ	61
ATCC 17414	САЩ	50
ATCC 17811	САЩ	58
необработена контрола		71

Предизвикване на реакции в биохимични тестове съгласно системата за изследване API 20 NE

Изпитванията се осъществяват както е описано по-горе. Резултатите са показани в таблица 2. Те показват, че МА 342, в този смисъл, също е уникален и трябва да бъде различаван от другите 11 изследвани изолати. Някои от изследваните изолати не могат, съгласно този тест, да бъдат считани за основни при вида Pseudomonas chlororaphis.

Таблица 2. Брой предизвикани реакции чрез различни изследвани изолати при биохимични тестове съгласно системата за изпитване API 20 NE. „ + “ означава положителна реакция, а означава не/отрицателна реакция.

	изследвани резултати
изследвано свойство по API 20 Ne, тест	МА 342	в 2075	в 1869	В 14874	В 14869	В 1854	NCTC 10686	NCTC 7357	DSM 6508	АТСС 9446	АТСС 17414	АТСС 17811
нитратна редукция	•		+	-		+	4-	4-	+	4-	4-
индолно производство						-	-	-	-	-	-	-
киселина от глюкоза	-	-	-	-		-	-	-	-	-		-
аргининова дихидролаза	+	+	4-	4-		4-	4-	4-	4-	+	4-	4-
уреаза	-	-	-	-		-	-	-	-	-	-
ескулинова хидролиза			-	-		-	-	-	-	-	-	-
желатинова хидролиза	4-	4-	-			4-	4-	4-	-	4-	4-	4-
Вгалактозидаза		-	-				-	-	-	-	-	-
глюкозно асимилиране	+	+	4-	4-	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
арабинозно асимилиране	-	+	4-		-	-	+	-	+	-	-	-
манозно асимилиране		+	4-	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
манитолно асимилиране	+	4-	4-	-	-	4-	4-	4-	+	4-	4-	+
глюкозаминно асимилиране		4-	4-	-		4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
малтозно асимилиране					-			-	-	-	-	-
глюконатно асимилиране	+	+	4-	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	+
капринатно асимилиране		-1-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
адипатно асимилиране	-					4-	-	-	-	-	-	-
мапатно асимилиране	+	4-	4-	4-	4-	+	4-	+	4-	4-	4-	4-
цитратно асимилиране	4-	+	4-	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	+	4-
фенилацетатно асимилиране			4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-			4-
цитохромна оксидаза	4-		4-	4-	+	4-		4-	4-	4-	+	4-

Сравнение на външния вид на колония и кристалообразуване върху агарови пластини

Изолатите се култивират в блюда на Петри върху TSA 10, както е описано по-горе. Наблюдават се малки различия във външния вид на колониите между всички различни изолати, но всички изолати не могат да бъдат различавани по този начин. Обаче, изолатът МА 342 е единствен изолат образуващ типични хеалинови повърхностни кристали в агара и може по това свойство да бъде разграничен от всички останали изолати.

Издание на Патентното ведомство на Република България

1113 София, бул. Д-р Γ. М. Димитров 52-Б

Експерт: М. Михайлов

Пор. № 40188

Тираж: 40 ЗС

Claims

1. Щам Pseudomonas chlororaohis _} депозиран в

The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), Aberdeen, Scotland със NCIMB регистров №40616, или негови биологично чисти култури _? притежаващи способността да продуцират антипатогенно активни метаболити, или техни мутанти, притежаващи >по същество,същите характеристики_}както родителския щам.

2. Състав за контролиране на заболявания по растенията^причинени от патогенни гъби, характеризиращ се с това, че съдържа като активен компонент микроорганизъм съгласно претенция 1 или негова културална хранителна среда, съдържаща негови антипатогенно активни метаболити.

3. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че патогенът е гъбата Drechslera teres.

4. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че патогенът е гъбата Drechslera graminea.

5. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че патогенът е гъбата Drechslera avenae.

6. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че патогенът е гъбата Microdochium nivale.

7. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че патогенът е гъбата Tilletia caries.

8. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че патогенът е гъбата Ustilago avenae.

9. Състав съгласно претенции 2-8, характеризиращ се с това, че активният компонент е в смес със състав на носител^приемлив в селскостопанската практика.

10. Състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че активният компонент е в смес с течен носител.

11. Състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че активният компонент е импрегниран в твърд порообразен материал.

12. Състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че включва добавки, които служат като прилепители.

13. Състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че включва хранителен източник.

14. Метод за контрол на заболявания по растенията, причинени от патогенни гъби, който включва въвеждането на ефективна доза активен компонент в околната среда, където се подтиска агента^ предизвикващ заболяването, характеризиращ се с това, че активният компонент е микроорганизъм съгласно претенция 1 или негова културална хранителна среда, съдържаща негови антипатогенно активни метаболити.

15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че активният компонент е приложим спрямо семена.

16. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че активният компонент е приложим спрямо вегетативни части на отглежданото растение.

17. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че активният компонент е приложим спрямо растения.

18. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че активният компонент е приложим спрямо средата^ в която растението е израстнало, израства или би израстнало.