ES2896879T3 - Agente de control biológico modificado y sus usos - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende una cantidad eficaz de (a) un agente de control biológico que comprende NRRL Nº B-50897 y (b) un fungicida, en donde dicha composición controla un patógeno vegetal fúngico.

Description

DESCRIPCIÓN
Agente de control biológico modificado y sus usos
Antecedentes
Las enfermedades y plagas de las plantas deben controlarse para mantener la calidad y cantidad de alimentos, piensos, y fibras producidos por los agricultores de todo el mundo. Las enfermedades de las plantas están causadas principalmente por hongos, bacterias, virus y nematodos. Las plagas de las plantas incluyen insectos masticadores, chupadores y perforadores del orden Lepidoptera, Coleoptera, y Hemiptera, entre otros. Los pesticidas químicos se utilizan ampliamente en la agricultura para proteger los cultivos de dichas plagas y enfermedades. Estos productos químicos combaten las plagas, enfermedades, y malas hierbas de los cultivos, dando como resultado la mejora del rendimiento. Sin la protección de los cultivos y el control de plagas, disminuirían la producción y la calidad de los alimentos producidos. Sin embargo, el uso de pesticidas químicos impone un nivel de riesgo, ya que muchos tienen propiedades que pueden poner en peligro la salud y el medio ambiente si no se usan adecuadamente.
La Patente US 2008/0163392 describe un método para producir plantas tolerantes a herbicidas, en particular plantas que son tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD. La Patente WO 2007/064828 describe composiciones y métodos para conferir resistencia o tolerancia a herbicidas a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. La Patente WO 1998/050422 describe una cepa de Bacillus subtilis que produce antibióticos y metabolitos que muestra actividad insecticida, antifúngica y antibacteriana. La Patente EP 0466 133 describe un proceso para preparar una composición de biocontrol que comprende combinar una cantidad de un cultivo eficaz de forma fungicida de un cultivo estable puro biológicamente de una cepa de Trichoderma Harzianum denominado Trichoderma Harzianum, Rifai T-39 (Instituto Pasteur Depósito N° 1-952) o un mutante derivado del mismo que mantiene las propiedades bioinhibidoras de la cepa parental con un vehículo o diluyente adecuado aceptado agronómicamente. La Patente US 2012/0252672 describe cepas de rizobacterias que promueven el crecimiento de plantas (PGPR, de sus siglas en inglés) que poseen una ventaja competitiva mejorada en la colonización de plantas leguminosas, y mejoran el rendimiento general del crecimiento de plantas leguminosas. La Patente WO 2013/150422 describe bacterias antifitopatógenas, composiciones que comprenden dichas bacterias, y el uso de dichas bacterias y composiciones como agentes de control biológico. La Patente WO 2007/149817 describe combinaciones de al menos un agente de control biológico y al menos un nematicida para mejorar la protección de las plantas frente a plagas y patógenos. La Patente WO 2011/151819 divulga agentes de biocontrol, que protegen las plantas y el material vegetal, de plagas y patógenos, y promueven el crecimiento de las plantas. La Patente WO 2011/022435 describe métodos, dispositivos, y composiciones, que están dirigidos a desarrollar artificialmente un organismo para su uso como agente de biocontrol. La Patente WO 2002/087343 describe un agente de biocontrol aislado, que es una cepa de Pyricularia setariae. La Patente US 2011/257009 describe composiciones que comprenden una ditiino-tetracarboximida y al menos un agente de control biológico beneficioso para la agricultura. Schulz et al. (FEMS Microbiology Letters; 28(3); 1985, p.297-301) describen la sensibilidad diferencial de las 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasas bacterianas al herbicida glifosato. Ahemad et al. (Annals of Microbiology; 62; 2012; p.1531-1540) divulga la evaluación de las actividades que promueven el crecimiento de las plantas de rizobacterias de Pseudomonas putida bajo estrés por herbicidas. Ahemad y Khan (Acta Microbiol Immunol; 58(3); 2011; p.169-87) describen una evaluación toxicológica de plaguicidas selectivos para las actividades de fosfato que promueven el crecimiento de las plantas que solubilizan Pseudomonas aeruginosa. Liang et al. (Biotechnol Lett; 30 (8); 2008; p.1397-401) describen una mutación de residuo único de 5-enoilpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa en Pseudomonas stutzeri que mejora la resistencia al herbicida glifosato. La Patente US 2008/0287297 describe un destructor de raíces espumoso que utiliza una combinación de herbicidas y bacterias para inhibir y destruir las raíces y los pelos radiculares finos que se introducen en los sistemas de tuberías de desagüe de descarga subterránea. La Patente WO 1991/003161 describe un método para controlar el crecimiento de malas hierbas que comprende aplicar a las malas hierbas un producto químico, tal como un herbicida y un patógeno vegetal bacteriano. La Patente WO 2011/029002 describe un microorganismo que fija N2 resistente a herbicidas y un método para mejorar la fijación de N2 por rizobios resistentes a herbicidas en simbiosis con plantas leguminosas resistentes o tolerantes a herbicidas tratadas con herbicida. La Patente WO 2014/145883 describe cultivos bacterianos puros bacteriológicamente de cepas de bacterias que promueven el crecimiento de plantas, e inóculos que comprenden las mismas. Un problema con el uso continuado de pesticidas, herbicidas u otros productos químicos para la protección de cultivos es el desarrollo de resistencia al agente de control. La resistencia a los pesticidas es la menor susceptibilidad de una población de plagas a un agente de control a dosis que alguna vez mataron a la mayoría de los individuos de la especie. Por lo tanto, se necesitan nuevos productos con diferentes modos de acción para ayudar en el control de la resistencia.
Se sabe desde hace mucho tiempo que los microorganismos diversos filogenéticamente pueden actuar como antagonistas naturales de diversos patógenos y plagas de plantas. Las interacciones entre plantas hospedantes y microorganismos que conducen al biocontrol pueden incluir antibiosis, competencia, inducción de resistencia del hospedador, y depredación. El cribado y los ensayos de aislamientos han dado como resultado una serie de candidatos para la comercialización. Los biopesticidas microbianos representan una opción importante para el control de plagas y de enfermedades de las plantas. Existe la necesidad de agentes de control biológico que sean capaces de competir en condiciones de campo, particularmente en presencia de herbicidas y fungicidas que se emplean normalmente en la agricultura comercial y que puedan tener efectos antibióticos sobre los microorganismos.
Compendio
Se proporcionan composiciones y métodos para mejorar la capacidad de una población de agentes biológicos o agentes de biocontrol para competir y sobrevivir sobre el terreno. Al mejorar la población de los agentes biológicos, la población de agentes modificada es capaz de crecer, competir con otras cepas microbianas y hongos, y proporcionar protección a las plantas frente a los patógenos. Además, los agentes de control biológico modificados promueven el crecimiento y el rendimiento de las plantas. En particular, se seleccionan o modifican genéticamente agentes biológicos modificados y poblaciones modificadas de dichos agentes que son tolerantes o resistentes a los biocidas; tolerantes o resistentes a herbicidas; tolerantes o resistentes a fungicidas; tolerantes o resistentes a pesticidas; o tolerantes o resistentes a los productos químicos de protección de cultivos. De esta manera, se mejora la protección de los cultivos frente a agentes patógenos o plagas que causan enfermedades.
Los agentes biológicos modificados son capaces de crecer en presencia de al menos un herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos que se emplea en la agricultura comercial. Dichos agentes biológicos modificados son capaces de crecer y reproducirse en suelos donde se han aplicado tales herbicidas, fungicidas, pesticidas, u otros productos químicos para la protección de cultivos. Los agentes biológicos modificados hacen que los suelos sean supresores o resistentes a patógenos o plagas que causan enfermedades. Dichas poblaciones modificadas de agentes biológicos se pueden añadir a los suelos para prevenir patógenos fúngicos y las enfermedades que causan, o para inhibir la alimentación por plagas de insectos o nematodos, promoviendo el crecimiento de las plantas y aumentando el rendimiento de los cultivos. Por lo tanto, la presente invención es útil para mejorar la competitividad de los agentes biológicos modificados, particularmente sobre otros agentes microbianos que no son resistentes a herbicidas, fungicidas, pesticidas, u otros productos químicos para la protección de cultivos. Por lo tanto, las composiciones de la invención incluyen agentes biológicos seleccionados o modificados genéticamente y poblaciones modificadas de agentes de biocontrol. Estos agentes biológicos modificados se pueden emplear como inoculantes o como recubrimiento de semillas para plantas y semillas. También se pueden aplicar como una aplicación en pulverización directamente a las partes aéreas de las plantas, y se pueden mezclar con el herbicida u otro producto químico al que se hayan modificado para volverse tolerantes. Como se indica, la presencia de los agentes biológicos modificados en condiciones de campo mejora la resistencia de las plantas a los patógenos y promueve el crecimiento de las plantas. Dichos agentes biológicos modificados de la invención se pueden emplear con otros agentes para promover el crecimiento y el rendimiento de las plantas.
La invención se refiere a:
1. Una composición que comprende una cantidad eficaz de (a) un agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897 y (b) un fungicida, en donde dicha composición controla un patógeno vegetal fúngico.
2. La composición de la realización 1, que comprende una cantidad eficaz de (a) el agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897 y (b) protioconazol, azoxistrobina, fluopicolida, clorotalonil, o fosetil; en donde dicha composición controla el patógeno vegetal fúngico.
3. La composición de la realización 1 o 2, en donde el patógeno causa la roya asiática de la soja.
4. La composición de la realización 1 o 2, en donde el patógeno vegetal fúngico comprende Rhizoctonia, Pythium, Botrytis o Phakopsora.
5. La composición de la realización 1, que comprende (a) el agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897 y (b) fenhexamida, flutriafol, difenoconazol, tebuconazol, tetraconazol, piraclostrobina, trifloxistrobina, propiconazol, fluoxastrobina, flutolanil, metconazol, o metrafenona; en donde dicha composición controla un patógeno vegetal fúngico.
6. Una formulación que comprende un agente de control biológico NRRL N° B-50897, en donde la formulación se formula como un polvo humectable, un polvo, un gránulo, un líquido acuoso, o un líquido de base oleosa, y dicho agente de control biológico controla un patógeno vegetal fúngico.
7. Una semilla recubierta que comprende una semilla y un recubrimiento sobre la semilla, en donde el recubrimiento comprende un agente de control biológico NRRL N° B-50897.
8. La semilla recubierta de la realización 7, en donde dicho recubrimiento comprende además al menos un pesticida, herbicida, fungicida, o insecticida.
9. La semilla recubierta de la realización 7, en donde el recubrimiento comprende además protioconazol, azoxistrobina, fluopicolida, clorotalonil, o fosetil.
10. La semilla recubierta de la realización 7, en donde el recubrimiento comprende además fenhexamida, flutriafol, difenoconazol, tebuconazol, tetraconazol, piraclostrobina, trifloxistrobina, propiconazol, fluoxastrobina, flutolanil, metconazol, o metrafenona.
11. La semilla recubierta de cualquiera de las realizaciones 7 a 10, en donde dicha semilla recubierta es una monocotiledónea o dicotiledónea.
12. Un método para cultivar una planta que comprende plantar en un área de cultivo una semilla recubierta de cualquiera de las realizaciones 7 a 11.
13. Un método para cultivar una planta que comprende aplicar a una planta, un área de cultivo, o una semilla una cantidad eficaz de un agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897, en donde dicha cantidad eficaz controla un hongo vegetal.
14. El método de la realización 12 o 13, en donde dicha planta es una monocotiledónea o dicotiledónea.
15. El método de la realización 13, en donde dicho método comprende además aplicar una cantidad eficaz de un herbicida, un fungicida, un insecticida, o un pesticida; y el herbicida, el fungicida, el insecticida, o el pesticida se aplican simultánea o secuencialmente con el agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897; en donde opcionalmente el fungicida comprende protioconazol, azoxistrobina, fluopicolida, clorotalonil, o fosetil, en donde opcionalmente el fungicida comprende fenhexamida, flutriafol, difenoconazol, tebuconazol, tetraconazol, piraclostrobina, trifloxistrobina, propiconazol, fluoxastrobina, flutolanil, metconazol, o metrafenona.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona una curva de crecimiento de las diversas cepas en presencia de glifosato.
Descripción detallada
Se proporcionan composiciones y métodos para mejorar los agentes de control biológico. Un agente de control biológico o agente de biocontrol para los propósitos de la presente invención se emplea para describir un microorganismo que se emplea para controlar patógenos de plantas y plagas de plantas que causan enfermedades. Los agentes de control biológico de la invención se han modificado de modo que son capaces de crecer en presencia de al menos un biocida. Un biocida es una sustancia química que puede ejercer un efecto de control sobre un organismo mediante medios químicos o biológicos. Los biocidas incluyen pesticidas, tales como fungicidas; herbicidas; insecticidas, otros productos químicos para la protección de cultivos, y similares. Las composiciones de la divulgación incluyen uno o más agentes de control biológico aislados que se han seleccionado por su resistencia a biocidas, tales como herbicidas, fungicidas, pesticidas, u otros productos químicos para la protección de cultivos; un agente de biocontrol recombinante que se ha transformado para contener un herbicida, fungicida, pesticida, u otro gen resistente a los productos químicos para la protección de cultivos; una población modificada de agentes de biocontrol en donde la población es resistente a al menos un herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos; y composiciones que comprenden estas poblaciones modificadas de agentes de biocontrol. La población modificada puede comprender microorganismos que se han seleccionado por su resistencia a herbicidas, fungicidas, pesticidas, u otros productos químicos de protección de cultivos o se han transformado con un gen que confiere resistencia o tolerancia a dicho herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos. Por tanto, la divulgación comprende cultivos puros sustancialmente, o cultivos puros biológicamente, de tales agentes de biocontrol modificados o agentes biológicos modificados. Un "cultivo bacteriano puro biológicamente" se refiere a un cultivo de bacterias que no contiene ninguna otra especie bacteriana en cantidades a detectar mediante técnicas bacteriológicas normales. Dicho de otra manera, es un cultivo en el que prácticamente todas las células bacterianas presentes son de la cepa seleccionada. Un agente de biocontrol modificado incluye agentes de biocontrol que han adquirido un rasgo debido a la presión de selección y agentes de biocontrol recombinantes que se han transformado con un gen que confiere resistencia o tolerancia a al menos un herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos.
La invención abarca además un agente de control biológico modificado particular. Dicho agente incluye AIP1620. El AIP1620 es una cepa Pseudomonas que se ha seleccionado por su tolerancia al glifosato. Los agentes adicionales incluyen AIP050999. El AIP050999 es una cepa Pseudomonas que se ha seleccionado por su tolerancia al glufosinato.
El AIP1620 se depositó en el depósito de patentes del Centro Nacional para la Investigación de la Utilización Agrícola Servicio de Investigación Agrícola, Departamento de Agricultura de EE.UU., 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE.UU. el 31 de enero de 2014, y se le asignó el NRRL N° B-50897. El AIP050999 se depositó en el depósito de Patentes del Centro Nacional para la Investigación de la Utilización Agrícola Servicio de Investigación Agrícola, Departamento de Agricultura de EE.UU., 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE.UU. el 23 de enero de 2015, y se le asignó el NRRL N° B-50999. Cada uno de estos depósitos se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines del Procedimiento de Patentes. Este depósito se realizó simplemente como una conveniencia para los expertos en la técnica y no es una admisión que se requiera un depósito según 35 U.S.C. §112.
Por "herbicida, fungicida, pesticida, u otra tolerancia química de protección de cultivos o herbicida, fungicida, pesticida, u otra resistencia química de protección de cultivos" se entiende a la capacidad de un organismo (es decir, la planta, el agente de biocontrol, el agente bacteriano de biocontrol, etc.) de sobrevivir y reproducirse después de la exposición a una dosis del herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos que normalmente es letal para el organismo de tipo salvaje.
Los agentes biológicos o agentes de biocontrol de la invención incluyen microorganismos y hongos que controlan los patógenos de las plantas que causan enfermedades y promueven la salud, el crecimiento, y el rendimiento de las plantas. Cualquiera de estos agentes biológicos o de control biológico se puede modificar mediante selección o transformación y producir un agente biológico o de biocontrol modificado o un agente biológico o de biocontrol recombinante. Por tanto, la divulgación abarca un agente de biocontrol modificado aislado. Los agentes de biocontrol modificados se pueden cultivar para producir una población de agentes de biocontrol. Por "población modificada de agentes biológicos o de biocontrol" se entiende una población de agentes que comprende sustancialmente un cultivo del agente seleccionado o el agente recombinante que tiene el rasgo de interés, tal como resistencia a un herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos. Por comprende sustancialmente se entiende que la población ha crecido y producido a partir del agente de biocontrol modificado o recombinante. Es decir, los agentes de biocontrol modificados o recombinantes se pueden cultivar para producir un cultivo puro biológicamente. Se reconoce que tales cultivos puros biológicamente se pueden emplear juntos para mejorar la salud, el crecimiento, o el rendimiento de las plantas.
Se puede emplear cualquier agente biológico o de biocontrol en los métodos de la divulgación. Los microorganismos particulares de interés incluyen cepas de las bacterias Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Lysobacter, Gliocladium, Pythium, Chromobacterium, Penicillium, Pantoea, Lactobacillus, Paenibacillus, Burkholderia, Streptomyces, Variovorax, Pasteuria, Xanthomonas, etc. Los hongos de interés incluyen Aureobasidium, Ampelomyces, Beauveria, Metarhizium, Metschnikowia, Myrothecium, Lecanicillium, Chaetomium, Cordyceps, Coniothyrium, Dactylella, Gliocladium, Aspergillis, Paecilomyces, Trichoderma, Pisolithus, Glomus, etc. Véase, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos 5.348.742; 5.496.547; 5.756.087; 5.955.348; 6.060.051; 6.635.425; y la Publicación de Patente U.S. 20130142759. Hay muchos agentes de biocontrol en el mercado y cualquiera de ellos se pueden modificar según la presente divulgación. Dichos agentes incluyen: Agrobacterium radiobacter K84; Trichoderma atroviride; Bacillus subtilis GB03; Bacillus firmus 1-1582; Trichoderma asperellum (ICC 012); T. gamsii (ICC 080); Bacillus pumilus cepa QST 2808; Bacillus subtilis cepa QST 713; B. subtilis cepa MBI 600; Paecilomyces fumosoroseus; Gliocladium catenulatum; Trichoderma harzianum rifai cepa KRL-AG2; Trichoderma harzianum T-22; Trichoderma harzianum T-22; Trichoderma virens cepa G-41; Trichoderma harzianum T-22; Bacillus subtilis QST 713; Bacillus amyloliquefaciens cepa D747; Trichoderma (Gliocladium) virens GL-21; Paecilomyces lilacinus; Paecilomyces fumosoroseus; Ampelomyces quisqualis; B. subtilis DSM 17231; B. licheniformis DSM 17236; Pythium oligandrum DV 74; Bacillus subtilis GB03; Trichoderma asperellum; T. gamsii; Pseudomonas syringae ESC-10; Metschnikowia fructicola; Trichoderma harzianum T-22; Pseudomonas chlororaphis MA 342; B. amyloliquifaciens; Chrombacterium subtsugae cepa PRAA4-1; B. subtilis amyloliquefaciens FZB24; Penicillium bilaii; Paecilomyces fumosoroseus FE 9901; Streptomyces lydicus WYEC 108; P. syringae A506; Coniothyrium minitans; Paecilomyces lilacinus cepa 251; Streptomyces lydicus WYEC-108; Bacillus amyloliquifaciens; Trichoderma virens; Trichoderma viride; Ampelomyces quisqualis; Chaetomium globosum; Pseudomonas fluorescens; Bacillus subtilis; Bacillus pumulis; Myrothecium verrucaria AARC-0255; Streptomyces actinobacterium cepa K61; Gliocladium catenulatum J1446; Aureobasidium pullulans cepa DSM 14940; y A. pullulans cepa DSM 14941. Se pueden encontrar productos adicionales para el control de enfermedades biológicas en la red informática mundial o Web en: nevegetable.org/table-22-biological-disease-control-products.
Los patógenos que causan enfermedades incluyen hongos, bacterias, virus y nematodos. Los agentes de biocontrol de la divulgación son aquellos que se dirigen a cualquiera de los patógenos de las plantas. Los patógenos diana incluyen, pero no se limitan a, Alternaría, Botrytis, Fusarium, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Cercospora, Colletotrichum, Cladosporium, -Erisyphae spp., Microsphaera syringae, Peronospora spp., Plasmopara spp, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia, Diplocarpon, Venturia, Mycosphaerella, Phomopsis, Taphrina, Elsinoe, Sclerotinia, Verticillum, Gnomonia, Fusicladium, Nectria, Phyllosticta, Diplocarpon, Albugo, Gignardia, Botrytis,, Exobasidium. Entomosporium, Exobasidium, Pestalotia,, Phoma, Cristulariella, Phakopsora, Thelaviopsis, Puccinia, Peronospora, Bremia, Pantoea, Clavibacter.
La resistencia a herbicidas, fungicidas, pesticidas, u otros productos químicos de protección de cultivos es la capacidad de un organismo de sobrevivir y reproducirse después de la exposición a una dosis del herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos que normalmente sería letal para el organismo de tipo salvaje o reduciría sustancialmente el crecimiento del organismo de tipo salvaje. La resistencia se puede inducir o identificar debido a la selección o se puede inducir mediante modificación genética. Para identificar y producir una población modificada de agentes de biocontrol a través de la selección, los agentes de biocontrol se cultivan en presencia del herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos, como la presión de selección. Los agentes susceptibles mueren mientras que los resistentes sobreviven para reproducirse sin competencia. A medida que los agentes de biocontrol se cultivan en presencia del herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos, los agentes de biocontrol resistentes se reproducen con éxito y se vuelven dominantes en la población, convirtiéndose en una población modificada de agentes de biocontrol. Los métodos para seleccionar cepas resistentes son conocidos e incluyen las Patentes U.S. Nos 4.306.027 y 4.094.097. Por lo tanto, la divulgación incluye un cultivo biológicamente puro de una cepa de biocontrol resistente. Las cepas resistentes de la invención tienen las mismas características de identificación que la cepa sensible original, excepto que son significativamente más tolerantes al herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos particular. Por tanto, su identificación es posible de manera fácil en comparación con las características de la cepa sensible conocida.
Los herbicidas incluyen glifosato, inhibidores de ACCasa (propionato de arloxifenoxi (FOPS)); inhibidores de ALS (sulfonilurea (SU)), imidazolinona (IMI), pirimidinas (PM)); inhibidor de la proteína de los microtúbulos (dinitroanilina (ADN)); auxinas sintéticas (fenoxi (P)), ácido benzoico (BA), ácido carboxílico (CA)); Inhibidor del fotosistema II (triazina (TZ)), triazinona (TN), nitrilos (NT), benzotiadiazinonas (BZ), ureas (US)); Inhibidor de EPSP sintasa (glicinas (GC)); Inhibidor de la síntesis de glutamina (ácido fosfínico (PA)); Inhibidor de DOXP sintasa (isoxazolidinona (IA)); Inhibidor de HPPD (pirazol (PA)), tricetona (TE)); Inhibidores de PPO (difeniléter (DE), N-fenilftalimida (NP) (Ari triazinona (AT)); inhibidores de VLFA (cloroacetamida (CA)), oxiacetamida (OA)); inhibidor del fotosistema I (bipiridilos (BP)); y similares.
Los pesticidas incluyen imidacloprid clotianidina, compuestos de arilpirazol (Patente WO2007103076); organofosforados, fenilpirazoles, piretroides caramoiloximas, pirazoles, amidinas, hidrocarburos halogenados, carbamatos y derivados de los mismos, terbufos, clorpirifós, fipronil, cloretoxifos, telfutrina, carbofurano, imidacloprid, tebupirimfos (5.849.320).
Los fungicidas incluyen fungicidas de nitrógeno alifático (butilamina, cimoxanil, dodicina, dodina, guazatina, iminoctadina); fungicidas de amida (benzovindiflupir, carpropamid, cloraniformetan, ciflufenamida, diclocimet, diclocimet, dimoxistrobina, fenaminstrobina, fenoxanil, flumetover, furametpyr, isofetamida, isopirazam, mandestrobina, mandipropamid, orisastrobina, pentiopirad, procloraz, quinazamid, siltiofam, triforina); fungicidas de acilaminoácidos (benalaxil, benalaxil-M, furalaxil, metalaxil, metalaxil-M, pefurazoato, valifenalato); fungicidas de anilida (benalaxil, benalaxil-M, bixafen, boscalid, carboxina, fenhexamida, fluxapiroxad, isotianil, metalaxil, metalaxil-M, metsulfovax, ofurace, oxadixil, oxicarboxina, penflufen, piracarbolid, sedaxane, tifluzamida, tiadinil, vanguard); fungicidas de benzanilida (benodanil, flutolanil, mebenil, mepronil, salicilanilida, tecloftalam); fungicidas de furanilida (fenfuram, furalaxil, furcarbanilo, metfuroxam); fungicidas de sulfonanilida (flusulfamida); fungicidas de benzamida (ácido benzohidroxámico, fluopicolida, fluopiram, tioximida, triclamida, zarilamida, zoxamida); fungicidas de furamida (ciclafuramida, furmeciclox); fungicidas de fenilsulfamida (diclofluanida, tolilfluanida); fungicidas de sulfonamida (amisulbrom, ciazofamida); fungicidas de valinamida (bentiavalicarb, iprovalicarb); fungicidas antibióticos (aureofungina, blasticidina-S, cicloheximida, griseofulvina, kasugamicina, moroxidina, natamicina, polioxinas, polioxorim, estreptomicina, validamicina); fungicidas de estrobilurina (fluoxastrobina, mandestrobina); fungicidas de metoxiacrilato estrobilurina (azoxistrobina, bifujunzhi, cumoxistrobina, enoxastrobina, flufenoxistrobina, jiaxiangjunzhi, picoxistrobina, piraoxistrobina); fungicidas de metoxicarbanilato y estrobilurina (piraclostrobina, pirametostrobina, triclopiricarb); fungicidas de metoxiiminoacetamida estrobilurina (dimoxistrobina, fenaminstrobina, metominostrobina, orisastrobina); fungicidas de metoxiiminoacetato de estrobilurina (kresoxim-metil, trifloxistrobina); fungicidas aromáticos (bifenilo, clorodinitronaftalenos, cloroneb, clorotalonil, cresol, dicloran, fenjuntong, hexaclorobenceno, pentaclorofenol, quintozeno, pentaclorofenóxido de sodio, tecnazeno, triclorotrinitrobencenos); fungicidas arsenicales (asomato, urbacida); fungicidas de aril fenil cetona (metrafenona, piriofenona); fungicidas de bencimidazol (albendazol, benomil, carbendazim, clorfenazol, cipendazol, debacarb, fuberidazol, mecarbinzid, rabenzazol, tiabendazol); fungicidas precursores de bencimidazol (furofanato, tiofanato, tiofanato-metilo); fungicidas de benzotiazol (bentalurón, bentiavalicarb, bentiazol, clobentiazona, probenazol); fungicidas botánicos (alicina, berberina, carvacrol, carvona, osthol, sanguinarina, santonina); fungicidas de difenilo puente (bitionol, diclorofeno, difenilamina, hexaclorofeno, parinol); fungicidas de carbamato (bentiavalicarb, furofanato, yodocarb, iprovalicarb, picarbutrazox, propamocarb, piribencarb, tiofanato, tiofanato-metilo, tolprocarb); fungicidas de bencimidazolilcarbamato (albendazol, benomil, carbendazima, cipendazol, debacarb, mecarbinzid); fungicidas de carbanilato (dietofencarb, piraclostrobina, pirametostrobina, triclopyricarb); fungicidas de conazol, fungicidas de conazol (imidazoles) (climbazol, clotrimazol, imazalil, oxpoconazol, procloraz, triflumizol); fungicidas de conazol (triazol) (azaconazol, bromuconazol, cyproconazol, diclobutrazol, difenoconazol, diniconazol, diniconazol-M, epoxiconazol, etaconazol, fenbuconazol, fluquinconazol, flusilazol, flutriafol, furconazol, furconazol-cis, hexaconazol, imibenconazol, ipconazol, metconazol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, protioconazol, quinconazol, simeconazol, tebuconazol, tetraconazol, triadimefon, triadimenol, triticonazol, uniconazol, uniconazol-P); fungicidas de cobre (acypetacs-cobre, mezcla de Burdeos, mezcla de Borgoña, mezcla de Cheshunt, acetato de cobre, carbonato de cobre, básico, hidróxido de cobre, naftenato de cobre, oleato de cobre, oxicloruro de cobre, silicato de cobre, sulfato de cobre, sulfato de cobre, básico, cromato de cobre y zinc, cufraneb, cuprobam, óxido cuproso, mancobre, oxina-cobre, saisentong, tiodiazol-cobre); fungicidas de cianoacrilato (benzamacril, phenamacril); fungicidas de dicarboximida (famoxadona, fluoroimida); fungicidas de diclorofenil dicarboximida (clozolinato, diclozolina, iprodiona, isovalediona, miclozolina, procimidona, vinclozolina); fungicidas de ftalimida (captafol, captan, ditalimfos, folpet, tioclorfenfim); fungicidas de dinitrofenol (binapacryl, dinobuton, dinocap, dinocap-4, dinocap-6, meptildinocap, dinocton, dinopenton, dinosulfon, dinoterbon, DNOC); fungicidas de ditiocarbamato (amobam, asomato, azitiram, carbamorf, cufraneb, cuprobam, disulfiram, ferbam, metam, nabam, tecoram, tiram, urbacida, ziram); fungicidas cíclicos de ditiocarbamato (dazomet, etem, milneb); fungicidas poliméricos de ditiocarbamato (mancobre, mancozeb, maneb, metiram, policarbamato, propineb, zineb); fungicidas de ditiolano (isoprotiolano, saijunmao); fungicidas fumigantes (disulfuro de carbono, cianógeno, ditioéter, bromuro de metilo, yoduro de metilo, tetratiocarbonato de sodio); fungicidas de hidrazida (benquinox, saijunmao); fungicidas de imidazol (ciazofamida, fenamidona, fenapanil, glodina, iprodiona, isovalediona, pefurazoato, triazóxido); fungicidas de conazol (imidazoles) (climbazol, clotrimazol, imazalil, oxpoconazol, procloraz, triflumizol); fungicidas inorgánicos (azida de potasio, tiocianato de potasio, azida de sodio, azufre, véase también fungicidas de cobre, véase también fungicidas de mercurio inorgánico); fungicidas de mercurio; fungicidas de mercurio inorgánicos (cloruro de mercurio, óxido de mercurio, cloruro de mercurio); fungicidas de organomercurio ((3-etoxipropil) bromuro de mercurio, acetato de etilmercurio, bromuro de etilmercurio, cloruro de etilmercurio, etilmercurio 2,3-dihidroxipropilmercaptido, fosfato de etilmercurio, W-(etilmercurio)-p-toluenosulfonanilida, hidrargafeno, cloruro de 2-metoxietilmercurio, benzoato de metilmercurio, diciandiamida de metilmercurio, pentaclorofenóxido de metilmercurio, 8-fenilmercurioxiquinolina, fenilmercuriurea, acetato de fenilmercurio, cloruro de fenilmercurio, derivado de fenilmercurio de pirocatecol, nitrato de fenilmercurio; fungicidas de morfolina (aldimorf, benzamorf, carbamorf, dimetomorf, dodemorf, fenpropimorf, flumorf, tridemorf); fungicidas organofosforados (ampropilfos, ditalimfos, EBP, edifenfos, fosetil, hexiltiofos, inezina, iprobenfos, izopamfos, kejunlin, fosdifeno, pirazofos, tolclofos-metil, triamifos); fungicidas de organoestaño (decafentin, fentin, óxido de tributilestaño); fungicidas de oxatina (carboxina, oxicarboxina); fungicidas de oxazol (clozolinato, diclozolina, drazoxolon, famoxadona, himexazol, metazoxolon, miclozolina, oxadixilo, oxatiapiprolina, pirisoxazol, vinclozolina); fungicidas de polisulfuro (polisulfuro de bario, polisulfuro de calcio, polisulfuro de potasio, polisulfuro de sodio); fungicidas de pirazol (benzovindiflupir, bixafen, fenpirazamina, fluxapiroxad, furametpir, isopirazam, oxatiapiprolina, penflufen, pentiopirad, piraclostrobina, pirametostrobina, piraoxistrobina, rabenzazol, sedaxano); fungicidas de piridina (boscalid, butiobato, dipiritiona, fluazinam, fluopicolida, fluopiram, parinol, picarbutrazox, piribencarb, piridinitrilo, pirifenox, pirisoxazol, piroxicloro, piroxifur, triclopiricarb); fungicidas de pirimidina (bupirimato, diflumetorim, dimetirimol, etirimol, fenarimol, ferimzona, nuarimol, triarimol); fungicidas de anilinopirimidina (ciprodinil, mepanipirim, pirimetanil); fungicidas de pirrol (dimetaclona, fenpiclonil, fludioxonil, fluoroimida); fungicidas de amonio cuaternario (berberina, sanguinarina); fungicidas de quinolina (etoxiquina, halacrinato, sulfato de 8-hidroxiquinolina, quinacetol, quinoxifeno, tebufloquina); fungicidas quinónicos (cloranil, diclona, ditianona); fungicidas de quinoxalina (quinometionato, clorquinox, tioquinox); fungicidas de tiadiazol (etridiazol, saisentong, tiodiazol-cobre, zinc tiazol); fungicidas de tiazol (etaboxam, isotianil, metsulfovax, octilinona, oxatiapiprolina, tiabendazol, tifluzamida); fungicidas de tiazolidina (flutianil, tiadifluor); fungicidas de tiocarbamato (methasulfocarb, protiocarb); fungicidas de tiofeno (etaboxam, isofetamid, siltiofam); fungicidas de triazina (anilazina); fungicidas de triazol (amisulbrom, bitertanol, fluotrimazol, triazbutil); fungicidas de conazol (triazoles) (azaconazol, bromuconazol, ciproconazol, diclobutrazol, difenoconazol, diniconazol, diniconazol-M, epoxiconazol, etaconazol, fenbuconazol, fluquinconazol, flusilazol, flutriazol, furconazol, furconazol-cis, hexaconazol, huanjunzuo, imibenconazol, ipconazol, metconazol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, protioconazol, quinconazol, simeconazol, tebuconazol, tetraconazol, triadimefon, triadimenol, triticonazol, uniconazol, uniconazol-P); fungicidas de triazolopirimidina (ametoctradina); fungicidas de urea (bentaluron, pencicuron, quinazamid); fungicidas de zinc (acipetacs-zinc, cromato de cobre y zinc, cufraneb, mancozeb, metiram, policarbamato, polioxorim-zinc, propineb, naftenato de zinc, tiazol de zinc, triclorofenóxido de zinc, zineb, ziram); fungicidas no clasificados (acibenzolar, acipetacs, alcohol alílico, cloruro de benzalconio, betoxazina, bromotalonil, quitosano, cloropicrina, DBCP, ácido deshidroacético, diclomezina, pirocarbonato de dietilo, etilicina, fenaminosulf, fenitropan,fenpropidina, formaldehído, furfural, hexaclorobutadieno, metilisocianato, nitroestireno, nitrotal-isopropilo, OCH, laurato de pentaclorofenilo, 2-fenilfenol, ftalida, piperalina, propamidina, proquinazida, piroquilon, ortofenilfenóxido de sodio, espiroxamina, sultropeno, ticiofeno, triciclazol) o mefenoxam.
Como se indica, los agentes de biocontrol recombinantes que tienen resistencia a un herbicida, fungicida, pesticida, u otro producto químico de protección de cultivos se pueden preparar mediante técnicas de modificación por ingeniería genética y tales agentes de biocontrol modificados o recombinantes se pueden cultivar para producir una población modificada de agentes de biocontrol. Un agente de biocontrol recombinante se produce mediante la introducción de polinucleótidos en la célula huésped de biocontrol mediante transformación. Los métodos para transformar microorganismos son conocidos y están disponibles en la técnica. Véase, en general, Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J. Mol. Biol. 166, 557-77; Seidman, C.E. (1994) en: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. eds., John Wiley e Hijos, Nueva York; Choi et al. (2006) J. Microbiol. Methods 64:391-397; Wang et al. 2010. J. Chem. Technol. Biotechnol. 85:775-778. La transformación puede ocurrir por absorción natural de ADN desnudo por células competentes de su entorno en el laboratorio. Alternativamente, las células se pueden hacer competentes mediante exposición a cationes divalentes en condiciones frías, mediante electroporación, mediante exposición a polietilenglicol, mediante tratamiento con nanopartículas fibrosas, u otros métodos bien conocidos en la técnica.
Los genes de resistencia a herbicidas para su uso en la transformación de un agente de biocontrol recombinante incluyen, pero no se limitan a, genes de desintoxicación de fumonisinas (Patente U.S. N° 5.792.931); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas, en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea, tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o Basta (por ejemplo, gen bar); y resistencia al glifosato (gen EPSPS)); y resistencia a HPPD (Patente WO 96/38576, Patentes U.S. Nos 6.758.044; 7.250.561; 7.935.869; y 8.124.846), u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida Basta, el gen nptIl codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y los mutantes del gen ALS codifican resistencia a los herbicidas de sulfonilurea, que incluyen clorsulfuron, metsulfuron, sulfometuron, nicosulfuron, rimsulfuron, flazasulfuron, sulfosulfuron, y triasulfuron, y las imidazolinonas herbicidas que incluyen imazetapir, imazaquin, imazapir, e imazametabenz.
Las poblaciones modificadas de agentes de control biológico de la invención se pueden formular como polvos humectables, polvos, gránulos, productos líquidos de base acuosa u oleosa, y similares. Tales formulaciones comprenderán los agentes de control biológico modificados además de vehículos y otros agentes. Las formulaciones se pueden emplear como inoculantes de campo para el control biológico, recubrimientos de semillas, etc. Es decir, las poblaciones de control biológico modificadas se pueden emplear de cualquier manera conocida en la técnica, que incluye el recubrimiento de semillas con una cantidad eficaz de los agentes modificados, en la aplicación en surco de las poblaciones de biocontrol modificado directamente en el suelo, en aplicación foliar, mezclando en una mezcla para plantación en macetas, y en el control de enfermedades posteriores a la cosecha. Tales métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. N° 5.348.742 y en la Solicitud Europea EP0472494 A2 publicada. El biocontrol incluye el control de poblaciones de organismos residentes y la introducción de organismos específicos para reducir enfermedades.
El agente de biocontrol proporcionado en la presente memoria se puede mezclar con un fungicida, insecticida, o herbicida para mejorar su actividad o la actividad del producto químico al que se ha añadido. En algunos casos, la combinación del agente de biocontrol y el producto químico puede mostrar una actividad sinérgica, donde la mezcla de los dos excede lo esperado por su simple efecto aditivo.
Los agentes de control biológico modificados de la invención se pueden emplear para reducir significativamente las enfermedades, promover el crecimiento y el rendimiento de las plantas, y para reducir la dependencia de los pesticidas tradicionales. Los agentes modificados de la invención se pueden emplear con otros pesticidas para un programa de manejo de plagas integrado eficaz. En una realización, las poblaciones de biocontrol modificadas se pueden mezclar en una formulación con pesticidas conocidos de la manera descrita en la Patente WO 94/10845.
Las poblaciones de biocontrol modificadas se aplican en una cantidad eficaz. Una cantidad eficaz de una población de biocontrol modificada es una cantidad suficiente para controlar o inhibir el patógeno. En otras realizaciones, la cantidad eficaz del agente de biocontrol modificado es una cantidad suficiente para promover o aumentar la salud, el crecimiento o el rendimiento de las plantas en presencia de una tasa de aplicación de un biocida en el campo agrícola. La tasa de aplicación del agente de biocontrol modificado y/o el biocida puede variar según el patógeno al que se dirige, el cultivo a proteger, la eficacia de las poblaciones de biocontrol modificadas, la gravedad de la enfermedad, las condiciones climáticas, y similares. Generalmente para una inoculación de campo, la tasa de aplicación del agente de biocontrol modificado es de 1012 a 1016 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea. (Esto corresponde aproximadamente de 10 g a 10 kg de ingrediente activo (i.a.) por hectárea si el i.a. es 100 mil millones de UFC por g). En otras realizaciones, para una inoculación de campo, la tasa de aplicación del agente de biocontrol modificado es de 3 x 1015 a 1 x 1017 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea. (Esto corresponde aproximadamente de 30 kg a 1000 kg de ingrediente activo por hectárea si el i.a. es 100 mil millones de UFC por g). En otras realizaciones, para una inoculación de campo, la tasa de aplicación del agente de biocontrol modificado es de 3 x 1015 a 1 x 1017 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea; aproximadamente 1x1012 a aproximadamente 1x1013 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea, aproximadamente 1x1013 a aproximadamente 1x1014 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea, aproximadamente 1x1014 a aproximadamente 1x1015 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea, aproximadamente 1x1015 a aproximadamente 1x1016 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea o aproximadamente 1x1016 a aproximadamente 1x1017 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea. En otras realizaciones, para una inoculación de campo, la tasa de aplicación del agente de biocontrol modificado es de al menos aproximadamente 1x1013, aproximadamente 1x1014, aproximadamente 1x1015, aproximadamente 1x1016 o aproximadamente 1x1017 unidades formadoras de colonias (UFC) por hectárea. En otras realizaciones, la tasa de aplicación del agente de biocontrol modificado es de 10 g 50 kg, 50 kg a 100 kg, 100 kg a 200 kg, 200 kg a 300 kg, 300 kg a 400 kg, 400 kg a 500 kg, 500 kg a 600 kg, 600 kg a 700 kg, 700 kg a 800 kg, 800 kg a 900 kg, 900 kg a 1000 kg de ingrediente activo por hectárea si el i.a. es 100 mil millones de UFC por g. En otras realizaciones, la tasa de aplicación del agente de biocontrol modificado es de al menos 10 g, 50 kg, 100 kg, 200 kg, 300 kg, 400 kg, 500 kg, 600 kg, 700 kg, 800 kg, 900 kg, 1000 kg de ingrediente activo por hectárea si el i.a. es 100 mil millones de UFC por g. En realizaciones específicas, el agente de biocontrol modificado aplicado comprende la cepa depositada como NRRL N° B-50897 y/o la cepa AIP050999 depositada como NRRL N° B-50999.
Se puede aplicar al cultivo cualquier tasa de aplicación agrícola apropiada para un biocida, por ejemplo, se puede aplicar una cantidad eficaz del biocida que controle un organismo determinado (es decir, una plaga de interés, tal como hongos, insectos, malezas, enfermedades, etc). Los métodos para analizar la cantidad eficaz del agente de biocontrol modificado incluyen, por ejemplo, cualquier aumento significativo estadísticamente en la salud, el rendimiento y/o el crecimiento de la planta que se produzca tras la aplicación de una cantidad eficaz del agente de biocontrol y una tasa de aplicación de campo de un biocida en comparación con la salud, el rendimiento y/o el crecimiento de la planta que se produce cuando se aplica la misma concentración de un agente de biocontrol no modificado en combinación con la cantidad eficaz del biocida.
Por lo tanto, una realización adicional de la divulgación proporciona un método para controlar o inhibir el crecimiento de un patógeno vegetal aplicando la población de agentes de control biológico modificados de la divulgación a un entorno en el que el patógeno vegetal puede crecer. La aplicación puede ser a la planta, a partes de la planta, a las semillas de las plantas a proteger, o al suelo en el que la planta a proteger está creciendo o crecerá. La aplicación a la planta o a las partes de la planta puede ser antes o después de la cosecha. La aplicación a las semillas será antes de plantar las semillas.
En otras realizaciones, un cultivo, área de cultivo, semilla y/o maleza se puede tratar con una combinación de una cantidad eficaz del agente de control modificado y un cantidad eficaz de un biocida. Por "tratado con una combinación" o "aplicando una combinación" del agente de biocontrol modificado y un biocida para un cultivo, área de cultivo o campo se entiende que uno o más de un campo, cultivo vegetal, semilla y/o maleza en particular se tratan con uno o más de los agentes de biocontrol modificados y uno o más biocidas para que se logre el efecto deseado. Además, la aplicación de uno o ambos de los agentes de biocontrol modificados y el biocida puede ocurrir antes de la siembra del cultivo (por ejemplo, en el suelo, la semilla, o la planta).Por otra parte, la aplicación del agente de biocontrol modificado y el biocida puede ser simultánea o las aplicaciones pueden ser en momentos diferentes (secuenciales), siempre que se logre el efecto deseado.
En una realización no limitante, el agente de biocontrol modificado es resistente al glifosato y aumenta además la salud, el rendimiento o el crecimiento de la planta cuando se aplica en una cantidad eficaz, y el biocida comprende glifosato o un derivado activo del mismo. En tales métodos, una semilla, planta o área de cultivo se trata con una combinación de una cantidad eficaz del agente de biocontrol modificado que es resistente al glifosato y una cantidad eficaz de glifosato, en donde la cantidad eficaz de glifosato es tal que controla selectivamente malezas mientras que el cultivo no se daña significativamente. En tales realizaciones, la cantidad eficaz del agente de biocontrol modificado es suficiente para dar como resultado un aumento significativo estadísticamente en la salud, el rendimiento y/o el crecimiento de la planta en comparación con la salud, el rendimiento y/o el crecimiento de la planta que se produce cuando se aplica la misma concentración de un agente de biocontrol no modificado en combinación con la cantidad eficaz de glifosato o derivado activo del mismo. En una realización adicional, el agente de biocontrol comprende una cantidad eficaz de AIP1620.
En otra realización no limitante, el agente de biocontrol modificado es resistente al glufosinato y aumenta además la salud, el rendimiento o el crecimiento de la planta cuando se aplica en una cantidad eficaz, y el biocida comprende glufosinato o un derivado activo del mismo. En tales métodos, una semilla, planta o área de cultivo se trata con una combinación de una cantidad eficaz del agente de biocontrol modificado que es resistente al glufosinato y una cantidad eficaz de glufosinato, en donde la cantidad eficaz de glufosinato es tal que controla selectivamente malezas mientras que el cultivo no se daña significativamente. En tales realizaciones, la cantidad eficaz del agente de biocontrol modificado es suficiente para dar como resultado un aumento significativo estadísticamente en la salud, el rendimiento y/o el crecimiento de la planta en comparación con la salud, el rendimiento y/o el crecimiento de la planta que se produce cuando se aplica la misma concentración de un agente de biocontrol no modificado en combinación con la cantidad eficaz de glufosinato o derivado activo del mismo. En una realización adicional, el agente de biocontrol comprende una cantidad eficaz de AIP050999.
Como se emplea en la presente memoria, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido celular vegetal a partir de los que se pueden regenerar plantas, callos vegetales, grupos de plantas, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras y similares. Se entiende por grano la semilla madura producida por cultivadores comerciales con fines distintos al cultivo o reproducción de la especie. La progenie, variantes, y mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos.
El agente de biocontrol modificado se puede emplear con cualquier especie de planta, que incluyen, pero no se limitan a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorra (Setaria italica), mijo de dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), piña (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales, y coníferas.
Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo., Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), habas de lima (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis, tal como el pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis), y melón almizclero (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo.
Las coníferas que se pueden emplear en la práctica de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, pinos, talescomo el pino taeda (Pinus taeda), pino elliotii (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus contorta), y pino de Monterrey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta occidental (Tsuga canadensis); abeto de Sitka (Picea glauca); la secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos, tales como el abeto plateado (Abies amabilis) y el abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros, tales como el cedro rojo occidental (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas de la presente divulgación son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc). En otras realizaciones, se emplea una planta de maíz o soja.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Experimental
Ejemplo 1: Producción de mutantes de AIP0069 resistentes al glifosato.
Introducción
Actualmente en la agricultura se utilizan agentes biológicos para reducir el riesgo y mejorar el rendimiento. Un atributo importante de estos agentes biológicos es que deben ser compatibles con los productos químicos que se pueden aplicar también en la práctica agrícola comercial. El glifosato es un herbicida químico que representa aproximadamente el 25% del mercado mundial de herbicidas y se aplica a una tasa de alrededor de 200 millones de libras por año. Este herbicida inhibe la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa (EPSPS) que cataliza una etapa en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en plantas y muchas bacterias. Por lo tanto, el glifosato disminuye la viabilidad de los organismos, que incluye a cualquier agente de biocontrol que dependa de EPSPS, y se ha informado que altera la comunidad microbiana de las plantas. Este informe describe la introducción exitosa de la tolerancia al glifosato en una cepa de Pseudomonas fluorescens empleada en el control biológico de varios patógenos fúngicos importantes de las plantas, que incluyen Pythium y Rhizoctonia, los agentes causales en la agricultura importante de la enfermedad del complejo "Damping off" o marchitamiento fúngico.. Además de mejorar la compatibilidad química de este agente de biocontrol, la introducción de resistencia al glifosato ofrece ventajas adicionales en la producción comercial.
Además del ejemplo de glifosato proporcionado en la presente memoria, otros productos químicos agrícolas pueden inhibir el crecimiento de bacterias deseables de control biológico o que promueven el crecimiento de las plantas. Ejemplos incluyen los herbicidas glufosinato (inhibidor de la glutamina sintasa), herbicidas de sulfonilurea e imidazolinona (inhibidores de la síntesis de aminioácidos de cadena ramificada) y los antibióticos estreptomicina, oxitetraciclina y kasugamicina.
Materiales y métodos y resultados
La cepa de control biológico Pseudomonas fluorescens AIP0069 se sembró por estría sobre placas de agar que contienen glifosato de 0 ó 5 mM. El medio basal consiste en 11,3 g de Na2HPÜ4- 7H2O, 3 g KH2PO4, 1 g de NhUCl, 10 g de glutamato monosódico, 31 g de melaza, 493 mg de MgSO4- 7H2O, 50 mg de ZnSO4- 7H2O, 5 mg de FeSO4-7H2O, y 0,3 g de tiamina por litro de agua desionizada. En ausencia de glifosato, eran visibles numerosas colonias bacterianas después de incubar durante la noche a 25°C. En presencia de glifosato 5 mM no eran visibles colonias después de una incubación similar, sin embargo, después de una incubación prolongada de varios días se observaron algunas colonias. Estas colonias se aislaron y se cultivaron en medio líquido a múltiples concentraciones de glifosato. Un aislado, llamado GlyphR1, era diez veces más resistente al glifosato que la cepa AIP0069 parental (Figura 1). Se espera que esta cepa mejorada sea más competitiva y, por lo tanto, más eficaz como control biológico que AIP0069 o cepas similares sensibles al glifosato en sistemas agrícolas donde el glifosato está presente en el suelo y los cultivos. Además, el glifosato se puede emplear como agente selectivo durante la producción, formulación y/o almacenamiento de esta cepa para evitar la contaminación por otras bacterias.
Ejemplo 2: Actividad de control biológico de mutantes resistentes al glifosato.
Las bacterias se inocularon en 50 ml de medio de caldo que consiste en 11,3 g de Na2HPO4- 7H2O, 3 g KH2PO4, 1 g de NH4Cl, 10 g de glutamato monosódico, 30 g de melaza, 493 mg de MgSO4- 7H2O, 50 mg de ZnSO4- 7H2O, y 5 mg de FeSO4- 7H2O por litro de agua desionizada. Los cultivos se hicieron crecer en matraces con deflectores de 250 ml en una incubadora con agitación a 28°C, 250 rpm durante 2 días. Las células se recogieron mediante centrifugación a 3500 xg durante 10 minutos. Los sobrenadantes del cultivo se desecharon y las células se resuspendieron en agua desionizada estéril hasta los volúmenes de los cultivos originales. AIP0323, un mutante de AIP0069 que no tiene actividad antifúngica, se incluyó como control negativo.
Se produjo el grano de arroz infestado con Rhizoctonia solani como se describe anteriormente (K.A. Holmes y D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophora parasítica var. nicotianae as a biocontrol for Phytophora parasítica on Catharanthus roseus. Plant Disease 78:193-199). El arroz infestado se pulverizó en una licuadora y se tamizó a través de un tamiz n° 10 (abertura de 2 mm). El grano pulverizado se mezcló con medio de germinación a una proporción de 2 g por litro.
Las semillas de Impatiens se plantaron en el medio de germinación infestado en bandejas de producción de plugs tamaño 402, se trataron con 0,3 ml de bacterias resuspendidas por plug y se cultivaron en condiciones estándar de producción en invernadero. Hubo 2 repeticiones para cada tratamiento experimental con 20 plugs por repetición. El número de plántulas sanas se evaluó después de dos semanas. Los datos en la Tabla 1 de a continuación demuestran que las variantes AIP0404 y AIP1620 resistentes al glifosato mantienen la actividad antifúngica completa, en comparación con la cepa progenitora, AIP0069.
Tabla 1
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La cepa de biocontrol se puede emplear para controlar Fusarium de la espiga, la roya asiática de la soja, Rhizoctonia, Botrytis, Pythium, enfermedades del césped, y similares.
Ejemplo 3.
Los genes que codifican las enzimas EPSPS tolerantes al glifosato se pueden obtener de varias bacterias (A. Schulz et al, 1985. Differential sensitivity of bacterial 5-enoilpyruvylshikimate-3-phosphate synthases to the herbicide glyphosate. FEMS Microbiology Letters, 28:297-301). En particular, son muy resistentes los genes EPSPS de Agrobacterium tumefaciens CP4 (G.F. Barry et al, 1992. Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. páginas. 139-145. En B.K. Singh et al. (e.) Biosynthesis and molecular regulation of amino acids in plants. Am. Soc. Plant Physiologist, Rockville, MD), y Arthrobacter globiformis (C.L. Peters et al, 2010, GRG23 y GRG51 genes conferring herbicide resistance. Patente Us 7.674.958),
Un gen adecuado se amplifica mediante PCR o se elabora sintéticamente empleando técnicas bien conocidas en la técnica. El marco de lectura abierto se clona en el vector plasmídico pKK223-3 (Pharmacia) entre el promotor tacI y el terminador transcripcional rrnB. .El promotor tacI proporciona una fuerte expresión constitutiva de genes en Pseudomonas. Las secuencias de ADN genómico de la cepa AIP0069 se incorporan a cada lado del casete promotor-gen-terminador para dirigir la recombinación homóloga en el cromosoma AIP0069.
El plásmido resultante se moviliza de E. coli para Pseudomonas fluorescens AIP0069 por conjugación, una técnica bien conocida en la técnica, y selección en medio definido que contiene glifosato 100 mM. El plásmido contiene el origen de replicación colE1 de rango estrecho del hospedador y, por lo tanto, no se puede replicar en Pseudomonas. Se obtendrán colonias resistentes al glifosato cuando el casete promotor-gen-terminador se integre en el cromosoma Pseudomonas por recombinación homóloga. Los eventos de cruzamiento único (donde el plásmido completo se integra en el cromosoma) se distinguen de los eventos de entrecruzamiento doble (donde sólo se integra el casete de promotor-gen-terminador deseado) mediante PCR, transferencia de Southern, u otras técnicas bien conocidas en la técnica. Se selecciona un evento de entrecruzamiento doble para su uso.
Ejemplo 4.
Se inocularon cultivos iniciadores AIP1620 empleando colonias de placas de agar Luria y se cultivaron en caldo NBY 0,1X (0,8 g de caldo nutritivo Difco en polvo y 0,5 g de polvo de extracto de levadura por litro de agua desionizada) y se cultivaron a 28°C, 250 rpm. Los cultivos de producción se cultivaron en un caldo que contiene, por litro de agua desionizada: 11,3 g de Na2HPÜ4 - 7H2O, 3,0 g KH2 PO4 , 1,0 g de NhUCl, 10 g de glutamato monosódico, 3,0 g de melaza, 0,49 g de MgSO4 - 7H2O, 50 mg de ZnSO4 - 7H2O, 5 mg de FeSO4 - 7H2O y suficiente ácido clorhídrico para ajustar el pH a aproximadamente 6,2. Se colocaron cincuenta ml de caldo de producción en un matraz de cultivo con deflectores de 250 ml, se inocularon con 0,5 ml de cultivo iniciador y se incubaron a 28°C, 250 rpm. Los cultivos de producción se inocularon en varios momentos y después se recolectaron simultáneamente para producir cultivos con tiempos de incubación de 15, 24, 33, y 43 horas. Se recolectaron cuarenta ml de cada cultivo mediante centrifugación. El caldo de cultivo gastado se desechó y las células se resuspendieron en agua desionizada esterilizada en autoclave hasta un volumen final de 40 ml.
El inóculo de hongos se preparó empleando el método del grano de arroz descrito por Holmes y Benson (K.A. Holmes y D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophora parasítica var. nicotianae for biocontrol of Phytophora parasítica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). Los granos de arroz infestados se pulverizaron en una licuadora y se tamizaron a través de un tamiz n° 10. Este inóculo se mezcló con una mezcla de germinación superfina de Fafard en una proporción de 1,0 g por litro.
La mezcla de germinación inoculada se colocó en 392 plugs de invernadero (Landmark Plastic Corporation, Akron, OH) y se plantó una semilla de impatiens en cada célula. Se aplicaron suspensiones de células AIP1620 en una proporción de 0,3 ml por célula. Las semillas se hicieron germinar en condiciones estándar de invernadero. Hubo 3 repeticiones de cada tratamiento con 20 células por réplica. Después de 10 a 14 días, los ensayos se puntuaron contando el número de plántulas sanas en cada tratamiento. Los resultados se resumen en la Tabla 2 de a continuación.
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Ejemplo 5.
Se realizaron múltiples ensayos de invernadero de células AIP1620 durante un período de 10 meses. Para cada ensayo, los cultivos de AIP1620 se hicieron crecer, se recogieron y se resuspendieron en agua desionizada esterilizada en autoclave esencialmente como se describe en el Ejemplo 4 empleando un tiempo de cultivo de aproximadamente 24 horas. Los ensayos de germinación en invernadero también se realizaron como se describe en el Ejemplo 4, pero la proporción del inóculo de R. Solani varió de 0,25 a 1,0 g de grano de arroz pulverizado por litro de mezcla de germinación, dependiendo del ensayo. Los resultados recopilados de 17 ensayos se muestran en la Tabla 3 de a continuación y demuestran un rendimiento consistente de AIP1620 en el control de la enfermedad por damping off.
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Ejemplo 6.
Se mezclaron cincuenta gramos de pasta celular AIP1620 con 50 g de arcilla de atapulgita Min-U-Gel 400 o Min-U-Gel 200 (Active Minerals International, LLC, Sparks, MD) secada hasta una actividad de agua de menos de 0,3. Se almacenó una porción de cada formulación a 4°C y otra se almacenó a 22°C. La viabilidad de estas formulaciones se ensayó en varios momentos mediante dilución en placas y los resultados se muestran en la Tabla 4 de a continuación. Después de 21 días de almacenamiento, las muestras que se habían almacenado a 4°C se analizaron en un ensayo de germinación de semillas de invernadero y se encontró que conservaban la actividad antifúngica frente a Rhizoctonia solani.
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Ejemplo 7.
Se mezclaron cien gramos de pasta celular AIP1620 con 20 g de silicato de calcio sintético (MicroCel E, Imerys Filtration Minerals, Lompoc, CA) empleando un procesador de alimentos. El material resultante contiene 2,7 x 1010 unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g) de AIP1620, como se determinó mediante dilución en placas. Este material se secó a 40°C hasta una actividad de agua de menos de 0,30, momento en el que contiene 1,4 x 109 UFC/g de AIP1620. La formulación de polvo seco se almacenó en bolsas de mylar selladas al vacío a 22°C. Después de 85 días, el polvo contiene 1,1 x 106 UFC/g de AIP1620 y mantiene actividad antifúngica contra Rhizoctonia solani como se determinó mediante un ensayo de germinación de semillas en invernadero.
Ejemplo 8.
Se mezclaron cien gramos de pasta celular AIP1620 con 5 g de glicerol y 20 g de silicato cálcico sintético empleando un procesador de alimentos. El material resultante contiene 5,7 x 1011 UFC/g de AIP1620, como se determinó mediante dilución en placas. Este material se secó a 40°C hasta una actividad de agua de menos de 0,30, momento en el que contiene 3,1 x 109 UFC/g de AIP1620. La formulación de polvo seco se almacenó en bolsas de mylar selladas al vacío a 22°C. Después de 61 días, el polvo contiene 6,2 x 108 UFC/g de AIP1620 y mantiene actividad antifúngica frente a Rhizoctonia solani como se determinó mediante un ensayo de germinación de semillas en invernadero.
Ejemplo 9.
Se mezclaron cien gramos de pasta celular AIP1620 con 5 g de trehalosa y 20 g de silicato cálcico sintético empleando un procesador de alimentos. El material resultante contiene 5,7 x 1011 UFC/g de AIP1620, como se determinó mediante dilución en placas. Este material se secó a 40°C hasta una actividad de agua de menos de 0,30, momento en el que contiene 4,0 x 108 UFC/g de AIP1620. La formulación de polvo seco se almacenó en bolsas de mylar selladas al vacío a 22°C. Después de 54 días, el polvo contiene 2,7 x 107 UFC/g de AIP1620.
Ejemplo 10.
Se dispersaron cuatro gramos de goma de xantano y se dispersaron en 4 g de aceite de soja. La mezcla resultante se combinó con 100 g de pasta celular AIP1620 y se dejó espesar durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. La mezcla espesada se mezcló con 20 g de silicato cálcico sintético empleando un procesador de alimentos. El material resultante contiene 9,4 x 1011 UFC/g de AIP1620 y se dividió en dos porciones de 50 g. Una porción se secó a 40°C hasta una actividad de agua de <0,30, momento en el que contiene 7,0 x 108 UFC/g de AIP1620.
La otra porción se secó sobre gel de sílice a temperatura ambiente hasta una actividad de agua de <0,10, momento en el que contiene 1,18 x 1010 UFC/g de AIP1620.
Ejemplo 11.
Se prepararon cinco formulaciones diferentes esencialmente como se describe anteriormente en el Ejemplo 4, empleando los excipientes y las proporciones que se muestran en la Tabla 5, de a continuación. Estas formulaciones se secaron a 40°C hasta una actividad de agua de menos de 0,30 y se almacenaron a 4°C.
El inóculo de hongos se preparó empleando el método del grano de arroz descrito por Holmes y Benson (K.A. Holmes y D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasítica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasítica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). Los granos de arroz infestados se pulverizaron en una licuadora y se tamizaron a través de un tamiz n° 10. Este inóculo se mezcló con una mezcla de germinación superfina de Fafard en una proporción de 0,25 g por litro.
La mezcla inoculada se dividió y se añadió AIP1620 formulado en una proporción de 5 g por litro. Se plantaron semillas de Impatiens en las mezclas inoculadas y tratadas. Las semillas se hicieron germinar en condiciones estándar de invernadero. Después de 10 días, los ensayos se puntuaron contando el número de plántulas sanas en cada tratamiento. Los resultados se resumen en la Tabla 6 de a continuación.
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Ejemplo 12.
Se prepararon varias formulaciones como se describe en los Ejemplos 4 a 8 anteriores, en diferentes momentos. La composición de las diferentes formulaciones se muestra en la Tabla 7, de a continuación. Después de secar hasta una actividad de agua de 0,30 o menos, los materiales formulados se sellaron al vacío en bolsas de mylar y se almacenaron a 22°C.
El inóculo de hongos se preparó empleando el método del grano de arroz descrito por Holmes y Benson (K.A. Holmes y D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). Los granos de arroz infestados se pulverizaron en una licuadora y se tamizaron a través de un tamiz n° 10. Este inóculo se mezcló con una mezcla de germinación superfina de Fafard en una proporción de 0,25 g por litro.
La mezcla inoculada se dividió y se añadió AIP1620 formulado en una proporción de 5 g por litro. El mismo día, se sembró por dilución una submuestra de cada formulación para determinar las UFC/g de AIP1620. Se plantaron semillas de Impatiens en las mezclas inoculadas y tratadas. Las semillas se hicieron germinar en condiciones estándar de invernadero. Después de 10 a 14 días, los ensayos se puntuaron contando el número de plántulas sanas en cada tratamiento. Los resultados se resumen en la Tabla 8 de a continuación.
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Estos resultados demuestran que el AIP1620 formulado mantiene la viabilidad y la actividad, es decir, la capacidad de proteger a las plántulas frente a la enfermedad de damping-off.
Ejemplo 13.
Se mezclaron cincuenta gramos de pasta celular AIP1620 con 50 g de arcilla de atapulgita Min-U-Gel 400 o Min-U-Gel 200 (Active Minerals International, LLC, Sparks, MD), se secaron hasta una actividad de agua de menos de 0,2, y se almacenaron a 22°C. La viabilidad de estas formulaciones se ensayó en varios momentos mediante dilución en placas y los resultados se muestran en la Tabla 9 de a continuación. Después de 21 días, ambas formulaciones se ensayaron en un ensayo de germinación de semillas de invernadero y se encontró que conservaba la actividad antifúngica frente a Rhizoctonia solani.
Tabla 9
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 14.
Se realizaron experimentos de invernadero para demostrar la eficacia de AIP1620 en el control de Botrytis cinerea.
Se inocularon cultivos iniciadores AIP1620 empleando colonias de placas de agar Luria y se cultivaron en caldo NBY 0,1X (0,8 g de caldo nutritivo Difco en polvo y 0,5 g de polvo de extracto de levadura por litro de agua desionizada) y se cultivaron a 28°C, 250 rpm. Los cultivos de producción se cultivaron en un caldo que contiene, por litro de agua desionizada: 11,3 g de Na2HPÜ4 - 7H2O, 3,0 g KH2 PO4 , 1,0 g de NhUCl, 10 g de glutamato monosódico, 3,0 g de melaza, 0,49 g de MgSO4 - 7H2O, 50 mg de ZnSO4 - 7H2 O, 5 mg de FeSO4 - 7H2O y suficiente ácido clorhídrico para ajustar el pH a aproximadamente 6,2. Se colocaron cincuenta ml de caldo de producción en un matraz de cultivo con deflectores de 250 ml, se inocularon con 0,5 ml de cultivo iniciador y se incubaron a 28°C, 250 rpm. Los cultivos de producción se inocularon en varios momentos y después se recolectaron simultáneamente para producir cultivos con tiempos de incubación de 15, 24, 33, y 43 horas. Se recolectaron cuarenta ml de cada cultivo mediante centrifugación. El caldo de cultivo gastado se desechó y las células se resuspendieron en agua desionizada esterilizada en autoclave hasta un volumen final de 40 ml.
Se cultivó Botrytis cinerea en caldo de dextrosa de patata durante 1 a 2 semanas sin agitar. La estera de micelio resultante se retiró del caldo y se homogeneizó en agua desionizada esterilizada en autoclave para producir el inóculo líquido.
Las fresas cultivadas orgánicamente se compraron en un mercado local. Se seleccionaron los frutos sin manchas y se sumergieron en el inóculo de B. cinerea durante 2 a 3 segundos, después se dejan secar durante 60 minutos antes del tratamiento. Se aplicaron los tratamientos con AIP1620 sumergiendo los frutos inoculados en la suspensión celular durante 2-3 segundos. La fruta se colocó después en recipientes de plástico sellados con toallas de papel húmedas para mantener una alta humedad y se almacenó a temperatura ambiente durante 72 a 84 horas. Hubo 14 repeticiones (bayas) en cada tratamiento. Cada baya se calificó en una escala visual de gravedad de deterioro de 0 = sin daño, 1 = 25%, 2 = 50% de daño, 3 = 75% de daño, y 4 = 100% (es decir, cobertura completa de la baya por el hongo). Los resultados se resumen en la Tabla 10 de a continuación.
Figure imgf000016_0003
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Ejemplo 15.
Se llevaron a cabo experimentos de invernadero para demostrar la eficacia de AIP1620 en el control de la enfermedad de damping off causada por el patógeno de la planta oomiceto Pythium aphanadermatum.
Se inocularon cultivos iniciadores AIP1620 empleando colonias de placas de agar Luria y se cultivaron en caldo NBY 0,1X (0,8 g de caldo nutritivo Difco en polvo y 0,5 g de polvo de extracto de levadura por litro de agua desionizada) y se cultivaron a 28°C, 250 rpm. Los cultivos de producción se cultivaron en un caldo que contiene, por litro de agua desionizada: 11,3 g de Na2HPO4- 7H2O, 3,0 g KH2PO4, 1,0 g de NH4Cl, 10 g de glutamato monosódico, 3,0 g de melaza, 0,49 g de MgSO4- 7H2O, 50 mg de ZnSO4- 7H2O, 5 mg de FeSO4- 7H2O y suficiente ácido clorhídrico para ajustar el pH a aproximadamente 6,2. Se colocaron cincuenta ml de caldo de producción en un matraz de cultivo con deflectores de 250 ml, se inocularon con 0,5 ml de cultivo iniciador y se incubaron a 28°C, 250 rpm. Los cultivos de producción se inocularon en varios momentos y se recolectaron después simultáneamente para producir cultivos con tiempos de incubación de 15, 24, 33, y 43 horas. Se recolectaron cuarenta ml de cada cultivo mediante centrifugación. El caldo de cultivo gastado se desechó y las células se resuspendieron en agua desionizada esterilizada en autoclave hasta un volumen final de 40 ml.
El inóculo de P. aphanadermatum se preparó empleando el método del grano de arroz descrito por Holmes y Benson (K.A. Holmes y D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophora parasítica var. nicotianae for biocontrol of Phytophora parasítica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). Los granos de arroz infestados se pulverizaron en una licuadora y se tamizaron a través de un tamiz n° 10. Este inóculo se mezcló con la mezcla de germinación superfina de Fafard en una proporción de 6,0 g por litro (ensayos 1 - 4) o 7,0 g por litro (ensayo 5).
La mezcla de germinación inoculada se colocó en 392 plugs de invernadero (Landmark Plastic Corporation, Akron, OH) y se plantó una semilla de impatiens en cada célula. Se aplicaron suspensiones de células AIP1620 en una proporción de 0,3 ml por célula. Las semillas se hicieron germinar en condiciones estándar de invernadero. Hubo 2 o 3 repeticiones de cada tratamiento con 20 células por repetición. Después de 7 a 17 días, los ensayos se puntuaron contando el número de plántulas sanas en cada tratamiento. Los resultados se resumen en la Tabla 11 de a continuación.
Figure imgf000017_0001
Ejemplo 16. Control de la roya asiática de la soja con AIP1620
Las células AIP1620 se produjeron como se describe en los ejemplos anteriores. Se cultivó Phakopsora pachyrhizi en plantas de soja susceptibles y las ureidinosporas se recolectaron por succión a vacío de las hojas infectadas que manifestaron pústulas erupcionadas (Twizeyimana, M., y Hartman, G. L. 2010. Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival at different temperatures and relative humedities. Plant Disease 94:1453-1460).
Se cultivaron plantas de soja Williams 82 en cámaras de crecimiento de plantas empleando técnicas bien conocidas en la técnica. Cuando las plantas estaban en la etapa V3, la primera hoja trifoliada expandida completamente se roció con células AIP1620 resuspendidas, un estándar de fungicida químico, o agua desionizada (control inoculado). Un día después se inocularon las hojas con una suspensión de ureidinosporas de P. pachyrhizi (1 x 105/ml). Tanto la inoculación como la cepa/fungicida se aplicaron empleando un atomizador conectado a un compresor de aire. Las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 95% de HR con un ciclo diario de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a 21 y 23°C, respectivamente. Después de dos semanas, se puntuó la gravedad de la enfermedad contando el número de uredinios esporulantes en círculos de 1 cm de diámetro seleccionados al azar en las hojas inoculadas. Hubo 3 repeticiones (plantas) para cada tratamiento y 3 recuentos de uredinios para cada repetición. Los resultados se muestran en la tabla 12 de a continuación, y demuestran que las aplicaciones de AIP1620 controlan eficazmente la roya asiática de la soja causada por Phakopsora pachyrhizi.
Tabla 12
Figure imgf000017_0002
Ejemplo 17. Compatibilidad de AIP1620 con fungicidas comerciales
La viabilidad de AIP1620 se midió después de mezclar los fungicidas comerciales de la cepa 3, cada uno de los cuales contiene un ingrediente activo diferente (Tabla 13). Las concentraciones de fungicidas se seleccionaron para simular las de una mezcla de tanque típica para aplicaciones de campo.
Se cultivó AIP1620 en 3 mL de medio LB en un tubo de 10 mL durante 24 horas a 28°C, 250 rpm. Los sedimentos celulares se recolectaron por centrifugación y se suspendieron en 3 mL de dH20. Se mezclaron novecientos microlitros de suspensión celular con 100 microlitros de disolución madre de fungicida 10X y se incubaron a 28°C durante 5 minutos o 120 minutos.
Figure imgf000018_0002
Después de la incubación con los fungicidas, las células se recolectaron por centrifugación como se describe anteriormente, y se resuspendieron en agua desionizada. Se diluyeron en serie alícuotas en agua desionizada, se sembraron en placas de agar LB y se incubaron a 282C durante 2 días empleando técnicas bien conocidas en la técnica. Se contaron las colonias bacterianas y se calculó el número de unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml) en las disoluciones originales. Los datos se muestran en la Tabla 14 de a continuación y demuestran que la viabilidad de AIP1620 no se ve afectada negativamente por la mezcla con estos fungicidas formulados.
Tabla 14. Viabilidad de las células AIP1620 después de la incubación con formulaciones de fungicidas en una mezcla de tanque simulada.
Figure imgf000018_0001
Ejemplo 18. Evaluación de la actividad protectora de mezclas de AIP1620 y fungicidas frente a la roya de la soja asiática causada por Phakopsora pachyrhizi.
Las bacterias se inoculan en 50 ml de medio de caldo que consiste en 11,3 g de Na2HPÜ4- 7H2O, 3 g KH2PO4, 1 g de NH4Cl, 10 g de glutamato monosódico, 30 g de melaza, 493 mg de MgSO4- 7H2O, 50 mg de ZnSO4- 7H2O, y 5 mg de FeSO4- 7H2O por litro de agua desionizada. Los cultivos se hacen crecer en matraces con deflectores de 250 ml en una incubadora con agitación a 28°C, 250 rpm durante 2 días. Las células se recogen mediante centrifugación a 3500 x g durante 10 minutos. Los sobrenadantes del cultivo se desechan y las células se resuspenden en agua desionizada estéril hasta los volúmenes de los cultivos originales. AIP0323, un mutante de AIP0069 que no tiene actividad antifúngica, se incluye como control negativo.
Las ureidinosporas de Phakopsora pachyrhizi se recolectan por succión a vacío de hojas infectadas con el hongo que manifiestan pústulas erupcionadas. Las esporas se resuspenden en agua a 10A5/mL y se inoculan en hojas de soja desprendidas como un aerosol utilizando un aerógrafo empleando técnicas conocidas en la técnica (Twizeyimana, M., y Hartman, G. L. 2010. Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival at different temperatures and relative humedities. Plant Disease 94:1453-1460).
Se preparan mezclas de células AIP1620 resuspendidas en agua e ingredientes activos fungicidas en varias proporciones que comprenden 10A6, 10A7, 10A8, 10A9 o 10A10 células AIP1620/mL, mezcladas con el ingrediente activo fungicida a 1/10X, 1/3X, 1/2X, o 1X la tasa de uso de campo normal, calculada al convertir la tasa de campo de la etiqueta publicada a g/mL, en base a una suposición sobre el volumen de pulverización por hectárea o acre.
Las hojas de soja inoculadas se tratan con el agente de biocontrol a los títulos anteriores, y con los fungicidas a las tasas anteriores, así como con mezclas de agente de biocontrol y fungicida en varias combinaciones a los títulos y proporciones especificados anteriormente. Además, algunas hojas desprendidas inoculadas se dejan sin tratar, o se tratan con AIP0323 como controles. Se utilizan al menos 3 hojas (o segmentos de hojas) para cada tratamiento del agente de biocontrol, producto químico, o mezcla. Las hojas desprendidas se incuban a alta humedad en una cámara de crecimiento a 12 horas de luz, 21°C / 12 horas de oscuridad, 23°C. Después de 10-14 días, las hojas se observan y puntúan según el número de uredinios visibles/cmA2.
La ecuación de Colby se emplea para determinar los efectos fungicidas esperados de las mezclas. (Véase Colby, S. R., Calculation of the synergistic and antagonistic response of herbicide combinations. Weeds 1967, 15, 20-22).
La siguiente ecuación se utiliza para calcular la actividad esperada de mezclas que contienen dos ingredientes activos, A y B:
Esperado = A+B-(AxB/100)
A = eficacia observada del componente activo A a la misma concentración tal como se usa en la mezcla;
B = eficacia observada del componente activo B a la misma concentración tal como se usa en la mezcla.
Las interacciones sinérgicas representativas, que incluyen las proporciones de aplicación empleadas y dan como resultado el control de enfermedades, se observan y registran de la siguiente manera:
% DC = porcentaje de control de la enfermedad
% DC Obs = porcentaje de control de la enfermedad observado
% DC Exp = Porcentaje de control de enfermedad esperado
Factor de sinergia =% DC Obs /% DC Exp
Ejemplo 19. Selección de una población de la cepa de control biológico Pseudomonas fluorescens AIP000069 que ha adquirido resistencia al herbicida Glufosinato
50 microlitros de cultivo AIP000069, cultivados en LB 0,5X durante 24 horas a 28°C, se extendieron sobre placas que contienen medio M63 Plus con glufosinato 0 o 100 mM El medio M63 Plus consiste en 13,6 g de KH2 PO4 , 9,92 g C6H12O6 , 2 g (NH4)2SO4 , 5,5 mg de CaCl2 , 0,278mg FeSO4 - 7H2O, y 10,16 mg de MgCb- 6H2O por litro de agua desionizada. En ausencia de glufosinato, eran visibles numerosas colonias bacterianas (un césped) después de incubar las placas durante 2 días a 28°C. En presencia de glufosinato 100 mM, no eran visibles colonias después de una incubación similar, sin embargo, después de una incubación prolongada de varios días, creció una única colonia. Esta colonia se sembró por estría para aislarla en una placa de agar M63 que contiene glufosinato 100 mM. El aislado resultante se denominó AIP050999. El crecimiento de AIP050999 se comparó con la cepa parental, AIP000069, y una versión resistente al glifosato de la cepa AIP001620. Los resultados se resumen en la tabla 15 de a continuación.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una cantidad eficaz de (a) un agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897 y (b) un fungicida,
en donde dicha composición controla un patógeno vegetal fúngico.
2. La composición de la reivindicación 1, que comprende una cantidad eficaz de (a) el agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897 y (b) protioconazol, azoxistrobina, fluopicolida, clorotalonil, o fosetil; en donde dicha composición controla el patógeno vegetal fúngico.
3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde el patógeno causa la roya asiática de la soja.
4. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde el patógeno vegetal fúngico comprende Rhizoctonia, Pythium, Botrytis o Phakopsora.
5. La composición de la reivindicación 1, que comprende (a) el agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897 y (b) fenhexamida, flutriafol, difenoconazol, tebuconazol, tetraconazol, piraclostrobina, trifloxistrobina, propiconazol, fluoxastrobina, flutolanil, metconazol, o metrafenona; en donde dicha composición controla un patógeno vegetal fúngico.
6. Una formulación que comprende un agente de control biológico NRRL N° B-50897, en donde la formulación se formula como un polvo humectable, un polvo, un gránulo, un líquido acuoso, o un líquido de base oleosa,, y dicho agente de control biológico controla un patógeno vegetal fúngico.
7. Una semilla recubierta que comprende una semilla y un recubrimiento sobre la semilla, en donde el recubrimiento comprende un agente de control biológico NRRL N° B-50897.
8. La semilla recubierta de la reivindicación 7, en donde dicho recubrimiento comprende además al menos un pesticida, herbicida, fungicida, o insecticida.
9. La semilla recubierta de la reivindicación 7, en donde el recubrimiento comprende además protioconazol, azoxistrobina, fluopicolida, clorotalonil, o fosetil.
10. La semilla recubierta de la reivindicación 7, en donde el recubrimiento comprende además fenhexamida, flutriafol, difenoconazol, tebuconazol, tetraconazol, piraclostrobina, trifloxistrobina, propiconazol, fluoxastrobina, flutolanil, metconazol, o metrafenona.
11. La semilla recubierta de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicha semilla recubierta es una monocotiledónea o dicotiledónea.
12. Un método para cultivar una planta que comprende plantar en un área de cultivo una semilla recubierta de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
13. Un método para cultivar una planta que comprende aplicar a una planta, un área de cultivo, o una semilla una cantidad eficaz de un agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897, en donde dicha cantidad eficaz controla un hongo vegetal.
14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde dicha planta es una monocotiledónea o dicotiledónea.
15. El método de la reivindicación 13, en donde dicho método comprende además aplicar una cantidad eficaz de un herbicida, un fungicida, un insecticida, o un pesticida; y el herbicida, el fungicida, el insecticida, o el pesticida se aplican simultánea o secuencialmente con el agente de control biológico que comprende NRRL N° B-50897; en donde opcionalmente el fungicida comprende protioconazol, azoxistrobina, fluopicolida, clorotalonil, o fosetil, en donde opcionalmente el fungicida comprende fenhexamida, flutriafol, difenoconazol, tebuconazol, tetraconazol, piraclostrobina, trifloxistrobina, propiconazol, fluoxastrobina, flutolanil, metconazol, o metrafenona.
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