CN110915818A - 经修饰的生物防治剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于改善生物试剂群体在田间背景下竞争和存活的能力的方法。通过改善生物试剂群体，所述经修饰的试剂群体能够生长，与其他微生物株系和真菌竞争，并且给植物提供针对病原体的保护作用。特别地，选择或改造耐受除草剂或抗除草剂的经修饰的生物试剂和经修饰的此类试剂的群体。以该方式，提高了针对致病因子的保护作用。可以向土壤添加此类经修饰的生物试剂群体，以防止真菌病原体和它们所引起的疾病，从而促进植物生长。因此。本发明对于提高经修饰的生物试剂的竞争性(特别地，相对于其他不抗除草剂的微生物试剂而言)来说是有用的。本发明的组合物包含经选择或经改造的抗除草剂的生物试剂以及经修饰的生物防治剂群体。这些经修饰的生物试剂可以用作接种物或者用作种子包衣，以用于植物和种子。

Description

经修饰的生物防治剂及其用途
本申请是CN201580010096.2的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年1月31日提交的美国临时申请系列号61/933,954和2015年1月16日提交的美国临时申请系列号62/104,122的权益，这两个申请的内容通过提及而以其整体合并入本文。
发明领域
本发明涉及经修饰的生物防治剂和群体，其具有经改善的特性。背景
在全世界范围内，需要对植物疾病和有害生物进行防治以保持由种植者所生产的食物、饲料和纤维的品质和数量。植物疾病主要由真菌、细菌、病毒和线虫引起。植物有害生物尤其包括来自鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)和半翅目(Hemiptera)的咀嚼型、吮吸型和刺吸型昆虫。在农业生产中广泛地使用化学杀有害生物剂来保护作物免于此类有害生物和疾病侵害。这些化学产品对抗作物有害生物、疾病和杂草，从而导致经改善的产量。没有作物保护和有害生物防治，食物生产和所生产出的食物的品质将会下降。然而，化学杀有害生物剂的使用强加了一定水平的风险，因为许多化学杀有害生物剂具有可以危及健康和环境的特性，如果不适当地使用的话。
伴随着杀有害生物剂、除草剂或其他作物保护化学药剂的连续使用的问题是发展出对于防治剂的抗性。杀有害生物剂抗性是有害生物群体对于处于曾经杀死该物种大多数个体的剂量的防治剂的易感性降低。因此，需要具有不同作用方式的新产品以帮助抗性管理。
长久以来已经知道，在系统发生上多种多样的微生物可以充当各种植物病原体和有害生物的天然拮抗物。导致生物防治的在植物宿主和微生物之间的相互作用可以包括抗生、竞争、宿主抗性的诱导以及捕食。筛选和测试分离物已产生了许多用于商业化的候选物。微生物生物杀有害生物剂代表了用于管理植物疾病和有害生物的一个重要选项。存在着对于这样的生物防治剂的需要，所述生物防治剂能够在田间条件下(特别地在于商业性农业生产中通常使用的除草剂和杀真菌剂存在下)竞争，并且可以对于微生物具有抗生效应。
发明概述
本发明提供了用于改善生物试剂或生物防治剂群体在田间背景下竞争和存活的能力的组合物和方法。通过改善生物试剂群体，所述经修饰的试剂群体能够生长，与其他微生物株系和真菌竞争，并且给植物提供针对病原体的保护作用。另外，经修饰的生物防治剂促进植物生长和产量。特别地，选择或改造耐受杀生物剂或抗杀生物剂的、耐受除草剂或抗除草剂的、耐受杀真菌剂或抗杀真菌剂的、耐受杀有害生物剂或抗杀有害生物剂的或者对于作物保护化学药剂具有耐受性或抗性的经修饰的生物试剂和经修饰的此类试剂的群体。以该方式，提高了使得作物免于致病因子或有害生物(pest)侵害的保护作用。
所述经修饰的生物试剂能够在至少一种在商业性农业生产中使用的除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂(pesticide)或其他作物保护化学药剂存在下生长。此类经修饰的生物试剂能够在其中已经施用了此类除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的土壤中生长和繁殖。所述经修饰的生物试剂使得所述土壤对于致病性病原体或有害生物具有抑制性或抗性。可以向土壤添加此类经修饰的生物试剂群体以防止真菌病原体和它们所引起的疾病，或者阻止被昆虫有害生物或线虫取食，从而促进植物生长和增加作物产量。因此。本发明对于提高经修饰的生物试剂的竞争性(特别地，相对于其他对于除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂不具有抗性的微生物试剂而言)来说是有用的。因此，本发明的组合物包含经选择或经改造的生物试剂以及经修饰的生物防治剂群体。这些经修饰的生物试剂可以用作接种物或者用作种子包衣，以用于植物和种子。它们也可以以直接向植物地上部分的喷洒施用来进行施用，并且可以与它们进行了修饰从而所能耐受的除草剂或其他化学药剂相混合。如所指出的，在田间条件下所述经修饰的生物试剂的存在提高植物对于病原体的抗性并促进植物生长。本发明的此类经修饰的生物试剂可以与其他促进植物生长和产量的试剂一起进行使用。
本发明的实施方案包括：
1.用于改善生物防治剂的方法，所述方法包括将所述生物防治剂修饰成对于至少一种除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂具有抗性。
2.实施方案1的方法，其中所述生物防治剂通过在除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂存在下生长以选择出抗性株系来进行修饰。
3.实施方案1的方法，其中所述生物防治剂通过用赋予对于所述除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的抗性的基因转化所述生物防治剂来进行修饰。
4.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述生物防治剂为细菌生物防治剂。
5.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述生物防治剂选自由下列各项组成的组：假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、溶杆菌属(Lysobacter)、木霉属(Trichoderma)、拟青霉属(Paecilomyces)、粘帚霉属(Gliocladium)、蛇葡萄霉属(Ampelomyces)、腐霉属(Pythium)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、色杆菌属(Chromobacterium)、青霉属(Penicillium)、盾壳霉属(Coniothyrium)、毛壳属(Chaetomium)、漆斑菌属(Myrothecium)、短梗霉属(Aureobasidium)、泛菌属(Pantoea)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、链霉菌属(Streptomyces)、贪噬菌属(Variovorax)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、乳杆菌属(Lactobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、黄单胞菌属(Xanthomonas)。
6.实施方案5的方法，其中所述细菌生物防治剂为假单胞菌属细菌。
7.实施方案6的方法，其中所述假单胞菌属物种为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。
8.实施方案1-7中任一项的方法，其中所述除草剂选自由下列各项组成的组：草甘膦、草铵膦(谷氨酰胺合酶抑制剂)、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂(支链氨基酸合成抑制剂)。
9.经修饰的生物防治剂，其中所述生物防治剂已经在除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂压力下进行了选择，并且对于所述除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂具有抗性。
10.实施方案9的经修饰的生物防治剂，其中所述经修饰的生物防治剂为细菌生物防治剂。
11.实施方案9的经修饰的生物防治剂，其中所述生物防治剂选自由下列各项组成的组：假单胞菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、溶杆菌属、木霉属、拟青霉属、粘帚霉属、蛇葡萄霉属、腐霉属、梅奇酵母属、色杆菌属、青霉属、盾壳霉属、毛壳属、漆斑菌属、短梗霉属、泛菌属、伯克霍尔德氏菌属、链霉菌属、贪噬菌属、巴斯德氏芽菌属、黄单胞菌属。
12.实施方案10的经修饰的生物防治剂，其中所述细菌生物防治剂为假单胞菌属细菌。
13.实施方案12的经修饰的生物防治剂，其中所述假单胞菌属物种为荧光假单胞菌或绿针假单胞菌。
14.实施方案9-13中任一项的经修饰的生物防治剂，其中所述除草剂选自由下列各项组成的组：草甘膦、草铵膦(谷氨酰胺合酶抑制剂)、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂(支链氨基酸合成抑制剂)。
15.重组的生物防治剂，其中所述生物防治剂已经用使得该生物防治剂具有除草剂抗性的除草剂抗性基因进行了转化。
16.实施方案15的重组的生物防治剂，其中所述经修饰的生物防治剂为细菌生物防治剂。
17.实施方案16的重组的生物防治剂，其中所述细菌生物防治剂选自由下列各项组成的组：假单胞菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、溶杆菌属、粘帚霉属、腐霉属、色杆菌属、青霉属、泛菌属、伯克霍尔德氏菌属、链霉菌属、贪噬菌属、巴斯德氏芽菌属和黄单胞菌属。
18.实施方案17的重组的生物防治剂，其中所述细菌生物防治剂为假单胞菌属细菌。
19.实施方案18的重组的生物防治剂，其中所述假单胞菌属物种为荧光假单胞菌或绿针假单胞菌。
20.实施方案15-19中任一项的重组的生物防治剂，其中所述除草剂选自由下列各项组成的组：草甘膦、草铵膦(谷氨酰胺合酶抑制剂)、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂(支链氨基酸合成抑制剂)。
21.经修饰的生物防治剂群体，其中所述群体实质性地包含实施方案1-20中任一项的生物防治剂。
22.用于防治植物病原体的制剂，所述制剂包含经修饰的生物防治剂群体和合适的载体，其中所述生物防治剂是抗除草剂的。
23.实施方案22的制剂，其中所述群体包含经修饰的细菌生物防治剂。
24.实施方案22的制剂，其中所述群体包含重组的生物防治剂。
25.实施方案22-24中任一项的制剂，其中所述生物防治剂以对于在农田施用量的杀生物剂存在下改善植物健康、生长或产量来说足够的有效量存在。
26.实施方案25的制剂，其中所述生物防治剂包含以NRRL编号B-50897进行保藏的菌株，并且所述杀生物剂为草甘膦。
27.实施方案25的制剂，其中所述生物防治剂包含以NRRL编号B-50999进行保藏的菌株AIP050999，并且所述杀生物剂为草铵膦。
28.用于改善生物防治剂在田间背景下竞争的能力的方法，所述方法包含修饰所述生物试剂，从而使得所述经修饰的生物防治剂能够在除草剂存在下生长。
29.用于促进植物生长的方法，所述方法包括将包含经修饰的生物防治剂群体的组合物施用至其中正生长着所述植物的土壤。
30.实施方案29的方法，其中所述生物防治剂已经被修饰成对于草甘膦或草铵膦具有抗性。
31.用于种植植物的方法，所述方法包括向作物、种子或栽培区域施用有效量的杀生物剂和有效量的经修饰的生物防治剂的组合，其中
(a)所述有效量的杀生物剂达到选择性地防治目的生物而所述作物不被显著地损害的程度；和
(b)所述有效量的经修饰的生物防治剂足以导致在植物健康、产量和/或生长方面的在统计学上显著的增加，当与在与所述有效量的杀生物剂相组合地施用相同浓度的未修饰的生物防治剂时出现的植物健康、产量和/或生长相比较时。
32.实施方案31的方法，其中同时施用所述经修饰的生物防治剂和所述杀生物剂。
33.实施方案32的方法，其中顺次施用所述经修饰的生物防治剂和所述杀生物剂。
34.实施方案31-33中任一项的方法，其中所述生物防治剂包含以NRRL编号B-50897进行保藏的菌株。
35.实施方案34的方法，其中所述杀生物剂为草甘膦，并且其中所述有效量的草甘膦达到选择性地防治杂草而所述作物不被显著地损害的程度。
36.实施方案31-33中任一项的方法，其中所述生物防治剂包含以NRRL编号B-50999进行保藏的菌株AIP050999，并且所述杀生物剂为草铵膦。
37.实施方案36的方法，其中所述杀生物剂为草铵膦，并且其中所述有效量的草铵膦达到选择性地防治杂草而所述作物不被显著地损害的程度。
38.经培养的生物防治剂群体，其中所述经培养的群体通过下述方式来产生：使试剂群体在除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或作物保护化学药剂压力下进行生长，以选择对于所述除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂具有抗性的生物防治剂的经纯化的培养物。
39.实施方案38的经培养的生物防治剂群体，其中所述生物防治剂以对于在农田施用量的杀生物剂存在下改善植物健康、生长或产量来说足够的有效量存在。
40.分离的在生物学上纯的生物防治剂培养物，其中所述生物防治剂对于选自除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或作物保护化学药剂的杀生物剂具有抗性，其中所述培养物通过在所述杀生物剂存在下生长来产生。
41.实施方案40的分离的在生物学上纯的生物防治剂培养物，其中所述生物防治剂以对于在农田施用量的杀生物剂存在下改善植物健康、生长或产量来说足够的有效量存在。
42.实施方案38的方法，其中所述组合物包含合适的载体。
43.从以NRRL编号B-50897进行保藏的菌株生长出的细菌培养物，其中所述细菌培养物具有抗真菌活性并且能够在草甘膦存在下生长。
44.权利要求43的细菌培养物，其中所述以NRRL编号B-50897进行保藏的菌株以对于在农田施用量的草甘膦存在下改善植物健康、生长或产量来说足够的有效量存在。
45.从以NRRL编号B-50999进行保藏的菌株AIP050999生长出的细菌培养物，其中所述细菌培养物具有抗真菌活性并且能够在草铵膦存在下生长。
46.权利要求45的细菌培养物，其中所述以NRRL编号B-50999进行保藏的菌株AIP050999以对于在农田施用量的草铵膦存在下改善植物健康、生长或产量来说足够的有效量存在。
附图简述
图1提供了在草甘膦存在下各种菌株的生长曲线。
发明详述
本发明提供了用于改善生物防治剂的组合物和方法。为了本发明的目的，生物试剂或生物防治剂用于描述用于防治致病性植物病原体和植物有害生物的微生物。本发明的生物防治剂已进行了修饰，从而它们能够在至少一种杀生物剂存在下生长。杀生物剂是可以通过化学或生物学手段对微生物发挥防治效应的化学物质。杀生物剂包括杀有害生物剂，例如杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂，其他作物保护化学药剂，等等。本发明的组合物包含一种或多种分离的生物防治剂，其已经就对于杀生物剂例如除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的抗性进行了选择；重组的生物防治剂，其已经被转化成包含抗除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的基因；经修饰的生物防治剂群体，其中所述群体对于至少一种除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂具有抗性；和含有这些经修饰的生物防治剂群体的组合物。所述经修饰的群体可以包含已经就除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂抗性进行了选择的或者已经用赋予对于此类除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的抗性或耐受性的基因进行了转化的微生物。因此，本发明包括此类经修饰的生物防治剂或经修饰的生物试剂的实质上纯的培养物或在生物学上纯的培养物。“在生物学上纯的细菌培养物”是指这样的细菌培养物，其不以能通过标准细菌学技术检测到的量包含其他细菌物种。换言之，它是这样的培养物，其中几乎所有所存在的细菌细胞都属于所选择的菌株。经修饰的生物防治剂包括已经由于选择压力而获得了性状的生物防治剂，和已经用赋予对于至少一种除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的抗性或耐受性的基因进行了转化的重组的生物防治剂。
本发明进一步包括特定的经修饰的生物防治剂。这样的试剂包括AIP1620。AIP1620是已经就草甘膦耐受性进行了选择的假单胞菌属菌株。另外的试剂包括AIP050999。AIP050999是已经就草铵膦耐受性进行了选择的假单胞菌属菌株。
AIP1620于2014年1月31日保藏于美国农业部(U.S.Department of Agriculture)的农业研究机构(Agricultural Research Service)的国家农业利用研究中心(NationalCenter for Agricultural Utilization Research)的专利保藏所(1815NorthUniversity Street,Peoria,Illinois61604U.S.A.)，并被分配了NRRL编号B-50897。AIP050999于2015年1月23日保藏于美国农业部(U.S.Department of Agriculture)的农业研究机构(Agricultural Research Service)的国家农业利用研究中心(National Centerfor Agricultural Utilization Research)的专利保藏所(1815North UniversityStreet,Peoria,Illinois 61604U.S.A.)，并被分配了NRRL编号B-50999。这些保藏中的每一个将会按照“国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约”的条款进行维持。该保藏仅仅是作为为了本领域技术人员的便利而进行的，而不是承认按照35U.S.C.§112需要保藏。
“除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂耐受性”或者“除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂抗性”意指生物(即植物、生物防治剂、生物防治细菌试剂等)在暴露于通常对于野生型生物来说致死的除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的剂量后存活和繁殖的能力。
本发明的生物试剂或生物防治剂包括防治致病性植物病原体并且促进植物健康、生长和产量的微生物和真菌。这些生物试剂或生物防治剂中的任一种可以通过选择或转化来进行修饰，并且产生经修饰的生物试剂或生物防治剂或者重组的生物试剂或生物防治剂。因此，本发明包括分离的经修饰的生物防治剂。可以使所述经修饰的生物防治剂进行生长，以产生生物防治剂群体。“经修饰的生物试剂或生物防治剂群体”意指这样的试剂群体，其实质性地包含具有目的性状(例如，对于除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的抗性)的经选择的试剂或重组的试剂的培养物。“实质性地包含”意指，所述群体已经从所述经修饰的或重组的生物防治剂中生长并产生出来。也就是说，可以使所述经修饰的或重组的生物防治剂进行生长，以产生在生物学上纯的培养物。应当认识到，此类在生物学上纯的培养物可以一起使用，以提高植物健康、生长或产量。
在本发明的方法中可以使用任何生物试剂或生物防治剂。特别的目的微生物包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、溶杆菌属、粘帚霉属、腐霉属、色杆菌属、青霉属、泛菌属、乳杆菌属、类芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、链霉菌属、贪噬菌属、巴斯德氏芽菌属、黄单胞菌属等的细菌的菌株。目的真菌包括短梗霉属、蛇葡萄霉属、白僵菌属(Beauveria)、绿僵菌属(Metarhizium)、梅奇酵母属、漆斑菌属、蚧孢属(Lecanicillium)、毛壳属、虫草属(Cordyceps)、盾壳霉属、隔指孢属(Dactylella)、粘帚霉属、曲霉属(Aspergillis)、拟青霉属、木霉属、豆马勃属(Pisolithus)、球囊霉属(Glomus)等。参见例如，美国专利号5,348,742、5,496,547、5,756,087、5,955,348、6,060,051、6,635,425，和美国专利公开20130142759；所有这些通过提及而合并入本文。许多生物防治剂是有销售的，并且可以将它们中的任一种根据本发明进行修饰。此类试剂包括：放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)K84；深绿木霉(Trichoderma atroviride)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GB03；坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)I-1582；棘孢木霉(Trichodermaasperellum)(ICC012)；盖姆斯木霉(T.gamsii)(ICC 080)；短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)菌株QST 2808；枯草芽孢杆菌菌株QST 713；枯草芽孢杆菌菌株MBI 600；玫瑰烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)；链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)；哈茨木霉(Trichoderma harzianum rifai)菌株KRL-AG2；哈茨木霉T-22；哈茨木霉T-22；变绿木霉(Trichoderma virens)菌株G-41；哈茨木霉T-22；枯草芽孢杆菌QST 713；解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株D747；变绿木霉(变绿粘帚霉(Gliocladium virens))GL-21；丁香拟青霉(Paecilomyces lilacinus)；玫瑰烟色拟青霉；使君子蛇葡萄霉(Ampelomyces quisqualis)；枯草芽孢杆菌DSM 17231；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DSM 17236；寡雄腐霉(Pythium oligandrum)DV 74；枯草芽孢杆菌GB03；棘孢木霉；盖姆斯木霉；丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)ESC-10；果生梅奇酵母(Metschnikowiafructicola)；哈茨木霉T-22；绿针假单胞菌MA 342；解淀粉芽孢杆菌；铁杉下色杆菌(Chrombacterium subtsugae)菌株PRAA4-1；解淀粉枯草芽孢杆菌(B.subtilisamyloliquefaciens)FZB24；拜莱青霉(Penicillium bilaii)；玫瑰烟色拟青霉FE 9901；利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)WYEC 108；丁香假单胞菌A506；小盾壳霉(Coniothyriumminitans)；丁香拟青霉菌株251；利迪链霉菌WYEC-108；解淀粉芽孢杆菌；变绿木霉；绿色木霉(Trichoderma viride)；使君子蛇葡萄霉；球毛壳(Chaetomium globosum)；荧光假单胞菌；枯草芽孢杆菌；短小芽孢杆菌；疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)AARC-0255；放线细菌链霉菌(Streptomyces actinobacterium)菌株K61；链孢粘帚霉J1446；出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株DSM 14940；和出芽短梗霉菌株DSM14941。另外的生物疾病防治产品可以在万维网上于nevegetable.org/table-22-biological-disease-control-products处找到。
致病性病原体包括真菌、细菌、病毒和线虫。本发明的生物防治剂是靶向任何植物病原体的那些。靶病原体包括但不限于，链格孢属(Alternaria)、葡萄孢属(Botrytis)、镰孢属(Fusarium)、欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属、黄单胞菌属、尾孢属(Cercospora)、刺盘孢属(Colletotrichum)、枝孢属(Cladosporium)、Erisyphae spp.、丁香叉丝壳(Microsphaera syringae)、霜霉属物种(Peronospora spp.)、单轴霉属物种(Plasmoparaspp.)、疫霉属(Phytophthora)、腐霉属、丝核菌属(Rhizoctonia)、双壳属(Diplocarpon)、黑星菌属(Venturia)、球腔菌属(Mycosphaerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)、外囊菌属(Taphrina)、痂囊腔菌属(Elsinoe)、核盘菌属(Sclerotinia)、轮枝孢属(Verticillum)、日规壳属(Gnomonia)、黑星孢属(Fusicladium)、丛赤壳属(Nectria)、叶点霉属(Phyllosticta)、双壳属、白锈属(Albugo)、球座菌属(Guignardia)、葡萄孢属、外担菌属(Exobasidium)、虫形孢属(Entomosporium)、外担菌属、盘多毛孢属(Pestalotia)、茎点霉属(Phoma)、冠毛菌属(Cristulariella)、层锈菌属(Phakopsora)、根串珠霉属(Thelaviopsis)、柄锈菌属(Puccinia)、霜霉属、盘梗霉属(Bremia)、泛菌属、棍状杆菌属(Clavibacter)。
除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂抗性是生物在暴露于通常对于野生型生物来说将会是致死的或将会实质上降低野生型生物的生长的除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂的剂量后存活和繁殖的能力。抗性可以由于选择而被诱导或鉴定，或者它可以通过基因工程来诱导。为了通过选择来鉴定和产生经修饰的生物防治剂群体，使生物防治剂在作为选择压力的除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂存在下进行生长。易感的试剂被杀死，而具有抗性的试剂存活从而无竞争地进行繁殖。由于生物防治剂在除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂存在下生长，因而具有抗性的生物防治剂成功地繁殖并成为在群体中占优势，从而变成经修饰的生物防治剂群体。用于选择抗性株系的方法是已知的，并且包括美国专利号4,306,027和4,094,097，其通过提及而合并入本文。因此，本发明包括具有抗性的生物防治株系的在生物学上纯的培养物。本发明的抗性株系具有与原始敏感株系相同的鉴定特征，除了它们对于特定的除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂显著地更耐受外。因此，通过与已知敏感株系的特征进行比较，它们的鉴定是容易地可能的。
除草剂包括：草甘膦；ACC酶抑制剂(芳氧基苯氧基丙酸酯类(FOPS))；ALS抑制剂(磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、嘧啶类(PM))；微管蛋白抑制剂(二硝基苯胺类(DNA))；合成的植物生长素(苯氧基类(P)、苯甲酸类(BA)、羧酸类(CA))；光合系统II抑制剂(三嗪类(TZ)、三嗪酮类(TN)、腈类(NT)、苯并噻二嗪酮类(BZ)、脲类(US))；EPSP合酶抑制剂(甘氨酸类(GC))；谷氨酰胺合成抑制剂(次膦酸类(PA))；DOXP合酶抑制剂(异
Figure BDA0002299784510000132
唑烷酮类(IA))；HPPD抑制剂(吡唑类(PA)、三酮类(TE))；PPO抑制剂(二苯醚类(DE)、N-苯基苯邻二甲酰亚胺类(NP)、芳基三嗪酮类(AT))；VLFA抑制剂(氯乙酰胺类(CA)、羟乙酰胺类(OA))；光合系统I抑制剂(联吡啶钅翁(BP))；等等。
杀有害生物剂包括：吡虫啉，噻虫胺，芳基吡唑类化合物(WO2007103076)；有机磷酸酯类，苯基吡唑，拟除虫菊酯类，氨基甲酰基肟类，吡唑类，脒类，卤代烃类，氨基甲酸酯类及其衍生物，特丁硫磷，毒死蜱，氟虫腈，氯氧磷，七氟菊酯，克百威，吡虫啉，丁基嘧啶磷(5,849,320)。
杀真菌剂包括：脂族含氮杀真菌剂(丁胺，霜脲氰，多敌菌，多果定，双胍辛胺醋酸盐，双胍辛胺)；酰胺类杀真菌剂(苯并烯氟菌唑(benzovindiflupyr)，环丙酰菌胺，双胺灵，环氟苄酰胺，双氯氰菌胺，醚菌胺，烯肟菌胺(fenaminstrobin)，稻瘟酰胺，氟酰菌胺，呋吡菌胺，异丙噻菌胺(isofetamid)，吡唑萘菌胺(isopyrazam)，mandestrobin，双炔酰菌胺，苯氧菌胺，肟醚菌胺，吡噻菌胺(penthiopyrad)，咪鲜胺，醌菌腙，硅噻菌胺，嗪氨灵)；酰基氨基酸类杀真菌剂(苯霜灵，苯霜灵-M，呋霜灵，甲霜灵，甲霜灵-M，稻瘟酯，缬菌胺(valifenalate))；N-酰基苯胺类杀真菌剂(苯霜灵，苯霜灵-M，联苯吡菌胺(bixafen)，烟酰胺，萎锈灵，环酰菌胺，氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)，异噻菌胺(isotianil)，甲霜灵，甲霜灵-M，噻菌胺，呋酰胺，
Figure BDA0002299784510000131
霜灵，氧化萎锈灵，氟唑菌苯胺(penflufen)，吡喃灵，氟唑环菌胺(sedaxane)，噻氟菌胺，噻酰菌胺(tiadinil)，vanguard)；N-苯甲酰苯胺类杀真菌剂(麦锈灵，氟酰胺，邻酰胺，灭锈胺，N-水杨酰苯胺，叶枯酞)；N-糠酰苯胺类杀真菌剂(甲呋酰胺，呋霜灵，灭菌胺，呋菌胺)；N-磺酰苯胺类杀真菌剂(磺菌胺)；苯甲酰胺类杀真菌剂(苯基异羟肟酸，氟吡菌胺，氟吡菌酰胺(fluopyram)，硫氰苯甲酰胺，水杨菌胺，氰菌胺，苯酰菌胺)；糠酰胺类杀真菌剂(环糠酰胺，拌种胺)；苯基硫酰胺类杀真菌剂(苯氟磺胺，甲苯氟磺胺)；磺酰胺类杀真菌剂(吲唑磺菌胺(amisulbrom)，氰霜唑)；缬氨酰胺类杀真菌剂(苯噻菌胺(benthiavalicarb)，异丙菌胺)；抗生素类杀真菌剂(金色制霉素，灭瘟素，放线菌酮，灰黄霉素，春雷霉素，吗啉胍，那他霉素，多抗霉素，多氧霉素，链霉素，有效霉素)；嗜球果伞素类杀真菌剂(氟嘧菌酯，mandestrobin)；甲氧基丙烯酸酯嗜球果伞素类杀真菌剂(嘧菌酯，吡氟菌酯(bifujunzhi)，丁香菌酯(coumoxystrobin)，烯肟菌酯(enoxastrobin)，氟菌螨酯(flufenoxystrobin)，甲香菌酯(jiaxiangjunzhi)，啶氧菌酯(picoxystrobin)，唑菌酯(pyraoxystrobin))；甲氧基苯氨基甲酸酯嗜球果伞素类杀真菌剂(吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)，唑胺菌酯(pyrametostrobin)，氯啶菌酯(triclopyricarb))；甲氧基亚氨基乙酰胺嗜球果伞素类杀真菌剂(醚菌胺，烯肟菌胺，苯氧菌胺，肟醚菌胺)；甲氧基亚氨基乙酸酯嗜球果伞素类杀真菌剂(醚菌酯，肟菌酯)；芳香族杀真菌剂(联苯，氯代二硝基萘类，地茂散，百菌清，甲酚，氯硝胺，酚菌酮(fenjuntong)，六氯苯，五氯酚，五氯硝基苯，五氯酚钠，四氯硝基苯，三氯三硝基苯类)；含砷杀真菌剂(福美砷，福美甲胂(urbacide))；芳基苯基酮类杀真菌剂(苯菌酮，pyriofenone)；苯并咪唑类杀真菌剂(丙硫多菌灵，苯菌灵，多菌灵，苯咪唑菌，氰菌灵，咪菌威，麦穗宁，咪卡病西，吡咪唑菌，噻菌灵)；苯并咪唑前体类杀真菌剂(呋菌隆，硫菌灵，甲基硫菌灵)；苯并噻唑类杀真菌剂(丙唑草隆，苯噻菌胺，苯噻硫氰，灭瘟唑，烯丙苯噻唑)；植物杀真菌剂(大蒜素，小檗碱，香芹酚，香芹酮，欧芹酚甲醚，血根碱，山道年)；桥连二苯基类杀真菌剂(硫氯酚(bithionol)，双氯酚，二苯胺，毒菌酚，氯苯吡啶)；氨基甲酸酯类杀真菌剂(苯噻菌胺，呋菌隆，碘代丙炔基丁基氨基甲酸酯(iodocarb)，异丙菌胺，picarbutrazox，霜霉威，吡菌苯威(pyribencarb)，硫菌灵，甲基硫菌灵，tolprocarb)；苯并咪唑基氨基甲酸酯类杀真菌剂(丙硫多菌灵，苯菌灵，多菌灵，氰菌灵，咪菌威，咪卡病西)；苯氨基甲酸酯类杀真菌剂(乙霉威，吡唑醚菌酯，唑胺菌酯，氯啶菌酯)；康唑(conazole)类杀真菌剂，康唑类杀真菌剂(咪唑类)(咪菌酮，克霉唑(clotrimazole)，抑霉唑，
Figure BDA0002299784510000151
咪唑，咪鲜胺，氟菌唑)；康唑类杀真菌剂(三唑类)(氧环唑，糠菌唑，环唑醇，苄氯三唑醇，苯醚甲环唑，烯唑醇，烯唑醇-M，氟环唑，乙环唑，腈苯唑，氟喹唑，氟硅唑，粉唑醇，呋菌唑，顺式呋菌唑，己唑醇，亚胺唑，种菌唑，叶菌唑，腈菌唑，戊菌唑，丙环唑，丙硫菌唑，唑喹菌酮，硅氟唑，戊唑醇，四氟醚唑，三唑酮，三唑醇，灭菌唑，烯效唑，烯效唑-P)；铜类杀真菌剂(八九十混酸铜，波尔多混合液，伯更狄混合液，切欣特混合液，乙酸铜，碳酸铜，碱式的，氢氧化铜，环烷酸铜，油酸铜，氯氧化铜，硅酸铜，硫酸铜，硫酸铜，碱式的，铬酸铜锌，硫杂灵，福美铜氯，氧化亚铜，锰铜混剂，喹啉铜，噻森铜(saisentong)，噻二唑铜)；氰基丙烯酸酯类杀真菌剂(苄烯酸，氰烯菌酯(phenamacril))；二羧酰亚胺类杀真菌剂(
Figure BDA0002299784510000152
唑菌酮，氟氯菌核利)；二氯苯基二羧酰亚胺类杀真菌剂(乙菌利，菌核利，异菌脲，氯苯咪菌酮，甲菌利，腐霉利，乙烯菌核利)；苯邻二甲酰亚胺类杀真菌剂(敌菌丹，克菌丹，灭菌磷，灭菌丹，苯菌胺)；二硝基苯酚类杀真菌剂(乐杀螨，消螨通，敌螨普，敌螨普-4，敌螨普-6，硝苯菌酯(meptyldinocap)，敌菌死，硝戊酯，硝辛酯，硝丁酯，DNOC)；二硫代氨基甲酸酯类杀真菌剂(代森铵，福美砷，肼硫双，吗菌威，硫杂灵，福美铜氯，戒酒硫，福美铁，安百亩，代森钠，福代硫，福美双，福美甲胂，福美锌)；环状二硫代氨基甲酸酯类杀真菌剂(棉隆，代森硫，代森环)；多聚二硫代氨基甲酸酯类杀真菌剂(锰铜混剂，代森锰锌，代森锰，代森联，聚氨基甲酸酯，丙森锌，代森锌)；二硫戊环类杀真菌剂(稻瘟灵，噻菌茂(saijunmao))；熏蒸剂类杀真菌剂(二硫化碳，氰，二硫醚，甲基溴，甲基碘，四硫代碳酸钠)；酰肼类杀真菌剂(醌肟腙，噻菌茂)；咪唑类杀真菌剂(氰霜唑，咪唑菌酮，咪菌腈，果绿啶，异菌脲，氯苯咪菌酮，稻瘟酯，咪唑嗪)；康唑类杀真菌剂(咪唑类)(咪菌酮，克霉唑，抑霉唑，
Figure BDA0002299784510000161
咪唑，咪鲜胺，氟菌唑)；无机杀真菌剂(叠氮化钾，硫氰酸钾，叠氮化钠，硫，还可参见铜类杀真菌剂，还可参见无机汞类杀真菌剂)；汞类杀真菌剂；无机汞类杀真菌剂(氯化汞，氧化汞，氯化亚汞)；有机汞类杀真菌剂(溴化(3-乙氧基丙基)汞，乙酸乙基汞，溴化乙基汞，氯化乙基汞，2,3-二羟基丙基硫醇乙基汞，磷酸乙基汞，N-(乙基汞)-对–甲苯磺酰苯胺，汞加芬，氯化2-甲氧基乙基汞，苯甲酸甲基汞，甲基汞双氰胺，五氯苯酚甲基汞，8-苯汞基羟喹啉，苯汞基脲，乙酸苯基汞，氯化苯基汞，焦儿茶酚的苯基汞衍生物，硝酸苯基汞，水杨酸苯基汞，硫柳汞，乙酸甲苯基汞)；吗啉类杀真菌剂(aldimorph，苯杂吗，吗菌威，烯酰吗啉，十二环吗啉，丁苯吗啉，氟吗啉，十三吗啉)；有机磷类杀真菌剂(氨丙膦酸，灭菌磷，EBP，敌瘟磷，藻菌磷，环己硫磷，枯瘟净，异稻瘟净，壬氧膦铵，克菌磷(kejunlin)，氯瘟磷，吡菌磷，甲基立枯磷，三唑磷胺)；有机锡类杀真菌剂(癸磷锡，三苯锡，氧化三丁基锡)；氧硫杂环己二烯类杀真菌剂(萎锈灵，氧化萎锈灵)；
Figure BDA0002299784510000162
唑类杀真菌剂(乙菌利，菌核利，肼菌酮，
Figure BDA0002299784510000163
唑菌酮，
Figure BDA0002299784510000164
霉灵，肼叉
Figure BDA0002299784510000165
唑酮，甲菌利，
Figure BDA0002299784510000166
霜灵，oxathiapiprolin，啶菌
Figure BDA0002299784510000167
唑(pyrisoxazole)，乙烯菌核利)；多硫化物类杀真菌剂(多硫化钡，多硫化钙，多硫化钾，多硫化钠)；吡唑类杀真菌剂(苯并烯氟菌唑，联苯吡菌胺，胺苯吡菌酮(fenpyrazamine)，氟唑菌酰胺，呋吡菌胺，吡唑萘菌胺，oxathiapiprolin，氟唑菌苯胺，吡噻菌胺，吡唑醚菌酯，唑胺菌酯，唑菌酯，吡咪唑菌，氟唑环菌胺)；吡啶类杀真菌剂(烟酰胺，丁硫啶，吡菌硫，氟啶胺，氟吡菌胺，氟吡菌酰胺，氯苯吡啶，picarbutrazox，吡菌苯威，啶菌腈，啶斑肟，啶菌
Figure BDA0002299784510000168
唑，吡氧氯，氯吡呋醚，氯啶菌酯)；嘧啶类杀真菌剂(乙嘧酚磺酸酯，氟嘧菌胺，二甲嘧酚，乙嘧酚，氯苯嘧啶醇，嘧菌腙，氟苯嘧啶醇，嘧菌醇)；苯胺基嘧啶类杀真菌剂(嘧菌环胺，嘧菌胺，嘧霉胺)；吡咯类杀真菌剂(菌核净，拌种咯，咯菌腈，氟氯菌核利)；季铵类杀真菌剂(小檗碱，血根碱)；喹啉类杀真菌剂(乙氧喹啉，丙烯酸喹啉酯，8-羟基喹啉硫酸酯，喹菌醇(quinacetol)，苯氧喹啉，tebufloquin)；醌类杀真菌剂(四氯对醌，二氯萘醌，二氰蒽醌)；喹喔啉类杀真菌剂(灭螨猛，四氯喹
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啉，克杀螨)；噻二唑类杀真菌剂(土菌灵，噻森铜，噻二唑铜，噻唑锌)；噻唑类杀真菌剂(噻唑菌胺，异噻菌胺(isotianil)，噻菌胺，辛噻酮，oxathiapiprolin，噻菌灵，噻氟菌胺)；噻唑烷类杀真菌剂(flutianil，噻二氟)；硫代氨基甲酸酯类杀真菌剂(磺菌威，硫菌威)；噻吩类杀真菌剂(噻唑菌胺，异丙噻菌胺，硅噻菌胺)；三嗪类杀真菌剂(敌菌灵)；三唑类杀真菌剂(吲唑磺菌胺，联苯三唑醇，三氟苯唑，叶锈特)；康唑类杀真菌剂(三唑类)(氧环唑，糠菌唑，环唑醇，苄氯三唑醇，苯醚甲环唑，烯唑醇，烯唑醇-M，氟环唑，乙环唑，腈苯唑，氟喹唑，氟硅唑，粉唑醇，呋菌唑，顺式呋菌唑，己唑醇，环菌唑(huanjunzuo)，亚胺唑，种菌唑，叶菌唑，腈菌唑，戊菌唑，丙环唑，丙硫菌唑，唑喹菌酮，硅氟唑，戊唑醇，四氟醚唑，三唑酮，三唑醇，灭菌唑，烯效唑，烯效唑-P)；三唑并嘧啶类杀真菌剂(唑嘧菌胺(ametoctradin))；脲类杀真菌剂(丙唑草隆，戊菌隆，醌菌腙)；锌类杀真菌剂(八九十混酸锌，铬酸铜锌，硫杂灵，代森锰锌，代森联，聚氨基甲酸酯，多氧霉素锌，丙森锌，环烷酸锌，噻唑锌，三氯苯酚锌，代森锌，福美锌)；未分类的杀真菌剂(噻二唑素，八九十混酸，烯丙醇，苯扎氯铵，bethoxazin，溴菌腈，壳聚糖，氯化苦，DBCP，脱氢乙酸，哒菌酮，焦碳酸二乙酯，乙蒜素，敌磺钠，种衣酯，苯锈啶，甲醛，糠醛，六氯丁二烯，异硫氰酸甲酯，硝基苯乙烯，酞菌酯，OCH，月桂酸五氯苯酯，2-苯基苯酚，四氯苯酞，病花灵，普罗帕脒，丙氧喹啉，咯喹酮，邻苯基苯酚钠，螺环菌胺，戊苯砜，噻菌腈，三环唑)或精甲霜灵。
如所指出的，对于除草剂、杀真菌剂、杀有害生物剂或其他作物保护化学药剂具有抗性的重组的生物防治剂可以通过基因工程技术来制备，并且使此类经改造的或重组的生物防治剂进行生长从而产生经修饰的生物防治剂群体。重组的生物防治剂通过将多核苷酸经由转化而引入到生物防治宿主细胞中来产生。用于转化微生物的方法是本领域中已知的和可得的。通常可参见，Hanahan,D.(1983)Studies on transformation of Escherichiacoli with plasmids.J.Mol.Biol.166,557-77；Seidman,C.E.(1994)In:CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等人编辑,John Wiley and Sons,NY；Choi等人,(2006)J.Microbiol.Methods.64:391-397；Wang等人,2010.J.Chem.Technol.Biotechnol.85:775-778。转化可以通过在实验室中感受态细胞从其环境中自然地摄取裸DNA而发生。备选地，可以通过在冷的条件下暴露于二价阳离子、通过电穿孔、通过暴露于聚乙二醇、通过用纤维纳米颗粒进行处理或者通过本领域中熟知的其他方法来使细胞成为处于感受态的。
用于在转化重组的生物防治剂中使用的除草剂抗性基因包括但不限于：伏马菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)；导致除草剂(特别是磺酰脲类型的除草剂)抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂，例如膦丝菌素或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因)；和HPPD抗性(WO 96/38576，美国专利号6,758,044、7,250,561、7,935,869和8,124,846)，或者本领域中已知的其他此类基因。这些文献的公开内容通过提及而合并入本文。bar基因编码对于除草剂basta的抗性，nptII基因编码对于抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，和ALS-基因突变体编码对于磺酰脲类除草剂(包括氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、啶嘧磺隆、磺酰磺隆和醚苯磺隆)和咪唑啉酮类除草剂(包括咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸、咪唑烟酸和咪草酸)的抗性。
可以将本发明的经修饰的生物防治剂群体配制成可湿性粉剂、撒粉(dusts)、颗粒剂、水性或油基液体产品，等等。除了载体和其他试剂外，此类制剂将会包含所述经修饰的生物防治剂。所述制剂可以用作用于生物防治的田间接种物、种子包衣等。也就是说，可以以本领域中已知的任何方式来使用所述经修饰的生物防治群体，包括用有效量的经修饰的试剂包被种子，在犁沟中将经修饰的生物防治群体直接施用到土壤中，在叶面施用中混合入罐装混合物中，和在收获后疾病防治中。此类方法是本领域中已知的，并且例如描述在美国专利号5,348,742和公开的欧洲申请EP0472494A2中，这两篇文献都通过提及而合并入本文。生物防治包括常住生物群体的管理和特定生物的引入以减少疾病。
可以将本文中所提供的生物防治剂与杀真菌剂、杀昆虫剂或除草剂相混合以提高其活性或者其所添加至的化学药剂的活性。在一些情况下，生物防治剂和化学药剂的组合可以显示出协同活性，其中两者的混合物超过了从它们的简单的加合效应所预期的。
本发明的经修饰的生物防治剂可以用于显著地减少疾病，促进植物生长和产量，以及减少对于传统杀有害生物剂的依赖。可以将本发明的经修饰的试剂与其他杀有害生物剂一起进行使用以为了有效的综合性有害生物管理计划。在一个实施方案中，可以以在WO94/10845(其通过提及而合并入本文)中所描述的方式将所述经修饰的生物防治群体混合入具有已知杀有害生物剂的制剂中。
以有效量施用所述经修饰的生物防治群体。经修饰的生物防治群体的有效量是对于防治或抑制病原体来说足够的量。在其他实施方案中，经修饰的生物防治剂的有效量是对于在农田施用量的杀生物剂存在下促进或增加植物健康、生长或产量来说足够的量。所述经修饰的生物防治剂和/或所述杀生物剂的施用量可以根据所靶向的病原体、待保护的作物、所述经修饰的生物防治群体的效力、疾病的严重度、气候条件等而变化。通常，对于田间接种，经修饰的生物防治剂的施用量为1012至1016个菌落形成单位(CFU)/公顷(这相应于大约10g至10kg活性成分/公顷，如果活性成分为1000亿CFU/g)。在其他实施方案中，对于田间接种，经修饰的生物防治剂的施用量为3×1015至1×1017个菌落形成单位(CFU)/公顷(这相应于大约30kg至1000kg活性成分/公顷，如果活性成分为1000亿CFU/g)。在其他实施方案中，对于田间接种，经修饰的生物防治剂的施用量为3×1015至1×1017个菌落形成单位(CFU)/公顷，大约1×1012至大约1×1013个菌落形成单位(CFU)/公顷，大约1×1013至大约1×1014个菌落形成单位(CFU)/公顷，大约1×1014至大约1×1015个菌落形成单位(CFU)/公顷，大约1×1015至大约1×1016个菌落形成单位(CFU)/公顷，或大约1×1016至大约1×1017个菌落形成单位(CFU)/公顷。在其他实施方案中，对于田间接种，经修饰的生物防治剂的施用量为至少大约1×1013，大约1×1014，大约1×1015，大约1×1016，或大约1×1017个菌落形成单位(CFU)/公顷。在另外的其他实施方案中，经修饰的生物防治剂的施用量为10g至50kg，50kg至100kg，100kg至200kg，200kg至300kg，300kg至400kg，400kg至500kg，500kg至600kg，600kg至700kg，700kg至800kg，800kg至900kg，900kg至1000kg活性成分/公顷，如果活性成分为1000亿CFU/g。在另外的其他实施方案中，经修饰的生物防治剂的施用量为至少10g，50kg，100kg，200kg，300kg，400kg，500kg，600kg，700kg，800kg，900kg，1000kg活性成分/公顷，如果活性成分为1000亿CFU/g。在特别的实施方案中，所施用的经修饰的生物防治剂包含以NRRL编号B-50897进行保藏的菌株和/或以NRRL编号B-50999进行保藏的菌株AIP050999。
可以向作物施用关于杀生物剂的任何合适的农业施用量，例如可以施用有效量的防治给定生物(即目的有害生物，例如真菌、昆虫、杂草、疾病等)的杀生物剂。关于所述经修饰的生物防治剂的有效量的分析检定方法包括例如，在施用有效量的生物防治剂和田间施用量的杀生物剂后出现的在植物健康、产量和/或生长方面的任何在统计学上显著的增加，当与在与所述有效量的杀生物剂相组合地施用相同浓度的未修饰的生物防治剂时出现的植物健康、产量和/或生长相比较时。
因此，本发明的一个进一步的实施方案提供了用于通过向其中可能生长有植物病原体的环境施用本发明的经修饰的生物防治剂的群体来防治或抑制植物病原体生长的方法。所述施用可以是向植物，向植物的部分，向待保护的植物的种子，或者向其中正生长着或将会生长有待保护的植物的土壤。向植物或植物部分的施用可以在收获之前或之后。向种子的施用将会在栽种种子之前。
在其他实施方案中，可以用有效量的经修饰的防治剂和有效量的杀生物剂的组合来处理作物、栽培区域、种子和/或杂草。“用经修饰的生物防治剂和杀生物剂的组合来处理作物、栽培区域或田地”或者“向作物、栽培区域或田地施用经修饰的生物防治剂和杀生物剂的组合”意指，用一种或多种经修饰的生物防治剂和一种或多种杀生物剂来处理一个或多个特定的田地、植物作物、种子和/或杂草，从而取得所希望的效果。进一步地，所述经修饰的生物防治剂和所述杀生物剂之一或两者的施用可以在作物栽种之前发生(例如，向土壤、种子或植物)。此外，所述经修饰的生物防治剂和所述杀生物剂的施用可以是同时的，或者所述施用可以是在不同的时间(顺次的)，只要取得所希望的效果。
在一个非限制性的实施方案中，所述经修饰的生物防治剂对于草甘膦具有抗性，并进一步地增加植物健康、产量或生长，当以有效量进行施用时，并且所述杀生物剂包含草甘膦或其活性衍生物。在这样的方法中，用有效量的对于草甘膦具有抗性的经修饰的生物防治剂和有效量的草甘膦的组合来处理种子、植物或栽培区域，其中所述有效量的草甘膦达到选择性地防治杂草而所述作物不被显著地损害的程度。在这样的实施方案中，所述有效量的经修饰的生物防治剂足以导致在植物健康、产量和/或生长方面的在统计学上显著的增加，当与在与所述有效量的草甘膦或其活性衍生物相组合地施用相同浓度的未修饰的生物防治剂时出现的植物健康、产量和/或生长相比较时。在一个进一步的实施方案中，所述生物防治剂包含有效量的AIP1620。
在另一个非限制性的实施方案中，所述经修饰的生物防治剂对于草铵膦具有抗性，并进一步地增加植物健康、产量或生长，当以有效量进行施用时，并且所述杀生物剂包含草铵膦或其活性衍生物。在这样的方法中，用有效量的对于草铵膦具有抗性的经修饰的生物防治剂和有效量的草铵膦的组合来处理种子、植物或栽培区域，其中所述有效量的草铵膦达到选择性地防治杂草而所述作物不被显著地损害的程度。在这样的实施方案中，所述有效量的经修饰的生物防治剂足以导致在植物健康、产量和/或生长方面的在统计学上显著的增加，当与在与所述有效量的草铵膦或其活性衍生物相组合地施用相同浓度的未修饰的生物防治剂时出现的植物健康、产量和/或生长相比较时。在一个进一步的实施方案中，所述生物防治剂包含有效量的AIP050999。
如在本文中所使用的，术语“植物”包括植物细胞，植物原生质体，从其可以再生出植物的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物块，和在植物或植物部分例如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝条、果实、果核、穗、穗轴、外壳、梗、根、根尖、花药等中的完好未动的植物细胞。谷粒意指商业种植者为了除了种植或繁殖该物种之外的目的而生产的成熟种子。再生出的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围之内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
可以对任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)，使用所述经修饰的生物防治剂。目的植物物种的例子包括但不限于：玉米(玉蜀黍(Zea mays))，芸苔属物种(Brassica sp.)(例如，欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是那些可用作籽油来源的芸苔属物种，苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))，水稻(稻(Oryzasativa))，黑麦(黑麦(Secale cereale))，高粱(两色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum))、黍(稷(Panicummiliaceum))、狐尾粟(小米(Setaria italica))、龙爪稷(穇子(Eleusine coracana)))，向日葵(向日葵(Helianthus annuus))，红花(红花(Carthamus tinctorius))，小麦(普通小麦(Triticum aestivum))，大豆(大豆(Glycine max))，烟草(烟草(Nicotiana tabacum))，土豆(马铃薯(Solanum tuberosum))，花生(落花生(Arachis hypogaea))，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，番薯(甘薯(Ipomoeabatatus))，木薯(木薯(Manihot esculenta))，咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))，椰子(椰子(Cocos nucifera))，菠萝(凤梨(Ananas comosus))，柑橘树(柑橘属物种(Citrusspp.))，可可(可可树(Theobroma cacao))，茶(茶(Camellia sinensis))，香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))，鳄梨(鳄梨(Persea americana))，无花果(无花果(Ficus casica))，番石榴(番石榴(Psidium guajava))，芒果(芒果(Mangifera indica))，橄榄(油橄榄(Oleaeuropaea))，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(腰果(Anacardium occidentale))，澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia))，巴旦杏(扁桃(Prunusamygdalus))，甜菜(甜菜(Beta vulgaris))，甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物，和针叶植物。
蔬菜包括：西红柿(番茄(Lycopersicon esculentum))，莴苣类(例如，莴苣(Lactuca sativa))，四季豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))，利马豆(利马豆(Phaseoluslimensis))，豌豆类(山黧豆属物种(Lathyrus spp.))，和香瓜属(Cucumis)的成员，例如胡瓜(黄瓜(C.sativus))、罗马甜瓜(坎塔卢坡香瓜(C.cantalupensis))和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括：杜鹃花类(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))，八仙花(大叶绣球(Macrophylla hydrangea))，木槿(朱槿(Hibiscus rosasanensis))，蔷薇类(蔷薇属物种(Rosa spp.))，郁金香类(郁金香属物种(Tulipa spp.))，水仙花类(水仙属物种(Narcissus spp.))，矮牵牛(碧冬茄(Petunia hybrida))，康乃馨(麝香石竹(Dianthuscaryophyllus))，猩猩木(一品红(Euphorbia pulcherrima))和菊花。
可以在实施本发明中使用的针叶植物例如包括：松树类，例如台大(火炬松(Pinustaeda))、沼泽松(湿地松(Pinus elliotii))、美国黄松(西黄松(Pinus ponderosa))、扭松(小干松(Pinus contorta))和蒙特里松(辐射松(Pinus radiata))；黄杉(花旗松(Pseudotsuga menziesii))；西部铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))；锡特卡云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；冷杉类，例如银冷杉(太平洋银枞(Abies amabilis))和香脂冷杉(胶枞(Abies balsamea))；和柏树类，例如西部红柏(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄柏(黄扁柏(Chamaecyparisnootkatensis))。在特别的实施方案中，本发明的植物为作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施方案中，使用玉米或大豆植物。
下面的实施例是作为举例说明而不是作为限制来提供的。
实验
实施例1：AIP0069的草甘膦抗性突变体的产生
引言
现在，正在农业中使用生物试剂以降低风险和改善产量。这些生物试剂的一个重要属性是它们必须与也可以在商业性农业生产实践中施用的化学药剂相容。草甘膦是占全球除草剂市场的大约25％并且以每年大约2亿磅的量施用的化学除草剂。该除草剂抑制在植物和许多细菌中催化在芳香族氨基酸生物合成中的一个步骤的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EPSPS)。因此，草甘膦降低了包括任何依赖EPSPS的生物防治剂在内的生物的生存力，并且已报道了它改变植物微生物群落。该报道描述了将草甘膦耐受性成功地引入到在数种重要的真菌植物病原体(包括腐霉属和丝核菌属，其是在农业上重要的猝倒病复合物中的病因因子)的生物防治中所使用的荧光假单胞菌菌株之中。除了改善该生物防治剂的化学相容性外，草甘膦抗性的引入还提供了额外的在商业性生产中的优点。
除了本文中所提供的草甘膦的例子外，其他农业化学药剂也可以抑制所希望的生物防治剂或植物生长促进性细菌的生长。实例包括草铵膦(谷氨酰胺合酶抑制剂)、磺酰脲类除草剂和咪唑啉酮类除草剂(支链氨基酸合成抑制剂)这些除草剂，以及链霉素、土霉素和春雷霉素这些抗生素。
材料和方法以及结果
将生物防治菌株荧光假单胞菌AIP0069划线接种在包含0或5mM草甘膦的琼脂平板上。基础培养基由11.3g Na2HPO4·7H2O、3g KH2PO4、1g NH4Cl、10g谷氨酸一钠、31g糖蜜、493mg MgSO4·7H2O、50mg ZnSO4·7H2O、5mg FeSO4·7H2O和0.3g硫胺素/升去离子水组成。在草甘膦不存在下，在于25℃温育过夜后可见许多细菌菌落。在5mM草甘膦存在下，在相似的温育后看不到菌落；然而，在数天的延长温育后，看到了很少的菌落。分离出这些菌落，并使其在液体培养基中在多个草甘膦浓度下生长。一种称为GlyphR1的分离物对于草甘膦的抗性是亲本AIP0069菌株的十倍(图1)。在其中草甘膦存在于土壤和作物中的农业系统之中，该经改善的菌株被预期相比于AIP0069或类似的草甘膦敏感型菌株而言是更具竞争性的，并因此作为生物防治剂是更有效的。此外，草甘膦还可以在该菌株的产生、配制和/或贮存期间用作选择试剂以防止被其他细菌污染。
实施例2：草甘膦抗性突变体的生物防治活性
将细菌接种在50ml的由11.3g Na2HPO4·7H2O，3g KH2PO4，1g NH4Cl，10g谷氨酸一钠，30g糖蜜，493mg MgSO4·7H2O，50mg ZnSO4·7H2O和5mg FeSO4·7H2O/升去离子水组成的液体培养基中。在处于28℃的摇动培养箱中，使培养物在250ml的带折流板的烧瓶中在250rpm下生长2天。通过在3500×g下离心10分钟来收集细胞。弃去培养物上清液，并且将细胞重悬浮在无菌的去离子水中至原始培养物的体积。作为阴性对照，包括了AIP0323，其是不具有抗真菌活性的AIP0069的突变体。
如以前所描述的那样(K.A.Holmes和D.M.Benson,1994.Evaluation ofPhytophthora parasitica var.nicotianae as a biocontrol for Phytophthoraparasitica on Catharanthus roseus.Plant Disease,78:193-199)，产生被立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染的水稻谷粒。将受侵染的水稻在搅切机中进行粉碎，并通过#10筛(2mm孔)进行筛选。将经粉碎的谷粒与萌发培养基以2g/升的比率进行混合。
将凤仙花种子在大小402的穴盘中栽种到受侵染的萌发培养基中，用0.3ml重悬浮的细菌/穴进行处理，并且在标准温室生产条件下进行生长。对于每个实验处理存在有两次重复，其中20个穴/重复。在两周后评估健康幼苗的数目。下面在表1中的数据证明了，草甘膦抗性变体AIP0404和AIP1620保留了完全的抗真菌活性，相比于祖先菌株AIP0069而言。
表1
Figure BDA0002299784510000261
该生物防治菌株可以用于防治镰孢头枯萎病、亚洲大豆锈病、丝核菌属物种、葡萄孢属物种、腐霉属物种、草坪疾病等。
实施例3
可以从各种细菌中获得编码耐受草甘膦的EPSPS酶的基因(A.Schulz等人,1985.Differential sensitivity of bacterial5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthases to the herbicide glyphosate.FEMS Microbiology Letters,28:297-301)。特别地，来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4(G.F.Barry等人,1992.Inhibitors of amino acid biosynthesis:Strategies for impartingglyphosate tolerance to crop plants.第139-145页.In B.K.Singh等人(e.)Biosynthesis and molecular regulation of amino acids in plants.Am.Soc.PlantPhysiologists,Rockville,MD)和球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(C.L.Peters等人,2010,GRG23and GRG51genes conferring herbicide resistance.美国专利7,674,958)的EPSPS基因是高度具有抗性的。
通过PCR来扩增或者使用本领域中熟知的技术以合成方式来制备合适的基因。将开放阅读框于tacI启动子和rrnB转录终止子之间克隆到质粒载体pKK223-3(Pharmacia)中。tacI启动子提供了基因在假单胞菌中的强的组成性表达。将来自菌株AIP0069的基因组DNA序列掺入在“启动子-基因-终止子”盒的每一侧以指导向AIP0069染色体中的同源重组。
通过接合(其是本领域中熟知的技术)并在包含100mM草甘膦的确定成分培养基上进行选择来将所得的质粒从大肠杆菌(E.coli)移动至荧光假单胞菌AIP0069。该质粒包含窄宿主范围的colE1复制起点，并因此不能在假单胞菌中进行复制。当将“启动子-基因-终止子”盒通过同源重组而整合到假单胞菌染色体中时，将会获得草甘膦抗性菌落。通过PCR、Southern印迹法或本领域中熟知的其他技术来区分单交换事件(其中整个质粒整合到染色体中)与双交换事件(其中仅整合了所希望的“启动子-基因-终止子”盒)。选择双交换事件用于进行使用。
实施例4
通过使用来自Luria琼脂平板的菌落来将AIP1620起始培养物进行接种，并使其在0.1X NBY培养液(0.8g Difco Nutrient Broth粉末和0.5g酵母提取物粉末/升去离子水)中进行生长和在28℃和250rpm下进行生长。使生产培养物在于每升去离子水中包含下列成分的培养液中进行生长：11.3g Na2HPO4·7H2O、3.0g KH2PO4、1.0g NH4Cl、10g谷氨酸一钠、3.0g糖蜜、0.49g MgSO4·7H2O、50mg ZnSO4·7H2O、5mg FeSO4·7H2O和对于将pH调整至大约6.2来说足够的盐酸。将50ml的生产培养液放置到250ml的带折流板的培养瓶中，用0.5ml起始培养物进行接种，并且在28℃和250rpm下进行温育。在各种时间处将生产培养物进行接种，然后同时收获，从而产生温育时间为15、24、33和43小时的培养物。通过离心来收获40ml的每种培养物。弃去消耗完的培养液，并且将细胞重悬浮在经高压灭菌的去离子水中，直至40ml的最终体积。
使用由Holmes和Benson(K.A.Holmes和D.M.Benson,1994.Evaluation ofPhytophthora parasitica var.nicotianae for biocontrol of Phytophthoraparasitica on Catharanthus roseus.Plant Disease,78:193-199)所描述的水稻谷粒方法来制备真菌接种物。将受侵染的水稻谷粒在搅切机中进行粉碎，并通过#10筛进行筛选。将该接种物以1.0g/升的比率混合到Fafard超细萌发混合物中。
将经接种的萌发混合物放置到392温室穴盘(Landmark Plastic Corporation,Akron,OH)中，并且将一个凤仙花种子栽种入每个孔室中。以0.3ml/孔室的比率施用AIP1620细胞悬浮液。使种子在标准温室条件下萌发。每个处理存在有3次重复，其中20个细胞/重复。在10至14天后，通过对在每个处理中的健康幼苗的数目进行计数来对所述分析检定进行评分。结果概括在下面的表2中。
Figure BDA0002299784510000281
实施例5
在10个月的时间段内进行AIP1620细胞的多个温室试验。对于每个试验，基本上如在实施例4中所描述的那样，使AIP1620培养物进行生长，收获，并重悬浮在经高压灭菌的去离子水中，其中使用大约24小时的培养时间。温室萌发试验也如在实施例4中所描述的那样来进行，但立枯丝核菌接种物比率从0.25g至1.0g经粉碎的水稻谷粒/升萌发混合物进行变化，这取决于试验。从17个试验中汇编出的结果显示在下面的表3中，并且证明了AIP1620在防治猝倒病中的一致的表现。
Figure BDA0002299784510000291
实施例6
将50克的AIP1620细胞糊状物与50g的干燥至小于0.3的水活度的Min-U-Gel 400或Min-U-Gel 200凹凸棒石粘土(Active Minerals International,LLC,Sparks,MD)相混合。将每种制剂的一部分贮存于4℃，和另一部分贮存于22℃。在各种时间处通过稀释平板移植来测试这些制剂的生存力，并且结果显示在下面的表4中。在贮存21天后，在温室种子萌发分析检定中测试了贮存于4℃的样品，并且发现其保持了针对立枯丝核菌的抗真菌活性。
Figure BDA0002299784510000301
实施例7
使用食品加工机来将100克的AIP1620细胞糊状物与20g的合成硅酸钙(MicroCelE,Imerys Filtration Minerals,Lompoc,CA)相混合。所得的材料包含2.7×1010个菌落形成单位/克(CFU/g)的AIP1620，这是通过稀释平板移植来测定的。将该材料在40℃下干燥至小于0.30的水活度，此时它包含1.4×109CFU/g的AIP1620。将经干燥的粉末制剂于22℃贮存在真空密封的聚酯薄膜袋中。在85天后，该粉末包含1.1×106CFU/g的AIP1620，并且保持针对立枯丝核菌的抗真菌活性，这是通过温室种子萌发分析检定来测定的。
实施例8
使用食品加工机来将100克的AIP1620细胞糊状物与5g的甘油和20g的合成硅酸钙相混合。所得的材料包含5.7×1011CFU/g的AIP1620，这是通过稀释平板移植来测定的。将该材料在40℃下干燥至小于0.30的水活度，此时它包含3.1×109CFU/g的AIP1620。将经干燥的粉末制剂于22℃贮存在真空密封的聚酯薄膜袋中。在61天后，该粉末包含6.2×108CFU/g的AIP1620，并且保持针对立枯丝核菌的抗真菌活性，这是通过温室种子萌发分析检定来测定的。
实施例9
使用食品加工机来将100克的AIP1620细胞糊状物与5g的海藻糖和20g的合成硅酸钙相混合。所得的材料包含5.7×1011CFU/g的AIP1620，这是通过稀释平板移植来测定的。将该材料在40℃下干燥至小于0.30的水活度，此时它包含4.0×108CFU/g的AIP1620。将经干燥的粉末制剂于22℃贮存在真空密封的聚酯薄膜袋中。在54天后，该粉末包含2.7×107CFU/g的AIP1620。
实施例10
将4克黄原胶分散入4g大豆油中。将所得的混合物与100g AIP1620细胞糊状物相组合，并且让其在室温下稠化大约5分钟。使用食品加工机来将稠化了的混合物混合到20g合成硅酸钙中。所得的材料包含9.4×1011CFU/g的AIP1620，并且将其分成两个50g的部分。将一个部分在40℃下干燥至<0.30的水活度，此时它包含7.0×108CFU/g的AIP1620。
将另一个部分在室温下在硅胶上干燥至<0.10的水活度，此时它包含1.18×1010CFU/g的AIP1620。
实施例11
基本上如在上面的实施例4中所描述的那样，制备五种不同的制剂，其中使用在下面的表5中所显示的赋形剂和比例。将这些制剂在40℃下干燥至小于0.30的水活度并贮存于4℃。
使用由Holmes和Benson(K.A.Holmes和D.M.Benson,1994.Evaluation ofPhytophthora parasitica var.nicotianae for biocontrol of Phytophthoraparasitica on Catharanthus roseus.Plant Disease,78:193-199)所描述的水稻谷粒方法来制备真菌接种物。将受侵染的水稻谷粒在搅切器中进行粉碎，并通过#10筛进行筛选。将该接种物以0.25g/升的比率混合到Fafard超细萌发混合物中。
分割该经接种的混合物，并且以5g/升的比率添加经配制的AIP1620。将凤仙花种子栽种到该经接种且经处理的混合物中。使种子在标准温室条件下萌发。在10天后，通过对在每个处理中的健康幼苗的数目进行计数来对所述分析检定进行评分。结果概括在下面的表6中。
Figure BDA0002299784510000321
Figure BDA0002299784510000322
实施例12
在不同的时间处，如在上面的实施例4至8中所描述的那样来制备数种制剂。不同制剂的组成显示在下面的表7中。在干燥至0.30或更低的水活度后，将经配制的材料真空密封入聚酯薄膜袋中并贮存于22℃。
使用由Holmes和Benson(K.A.Holmes和D.M.Benson,1994.Evaluation ofPhytophthora parasitica var.nicotianae for biocontrol of Phytophthoraparasitica on Catharanthus roseus.Plant Disease,78:193-199)所描述的水稻谷粒方法来制备真菌接种物。将受侵染的水稻谷粒在搅切机中进行粉碎，并通过#10筛进行筛选。将该接种物以0.25g/升的比率混合到Fafard超细萌发混合物中。
分割该经接种的混合物，并且以5g/升的比率添加经配制的AIP1620。在同一天，将每种制剂的子样品进行稀释平板移植以测定AIP1620的CFU/g。将凤仙花种子栽种到该经接种且经处理的混合物中。使种子在标准温室条件下萌发。在10至14天后，通过对在每个处理中的健康幼苗的数目进行计数来对所述分析检定进行评分。结果概括在下面的表8中。
Figure BDA0002299784510000331
Figure BDA0002299784510000341
这些结果证明，经配制的AIP1620保持了生存力和活性，即保护幼苗免于猝倒病侵害的能力。
实施例13
将50克的AIP1620细胞糊状物与50g的干燥至小于0.2的水活度的Min-U-Gel 400或Min-U-Gel 200凹凸棒石粘土(Active Minerals International,LLC,Sparks,MD)相混合，并贮存于22℃。在各种时间处通过稀释平板移植来测试这些制剂的生存力，并且结果显示在下面的表9中。在21天后，在温室种子萌发分析检定中测试了这两种制剂，并且发现它们均保持了针对立枯丝核菌的抗真菌活性。
表9
Figure BDA0002299784510000351
实施例14
进行温室实验以证明AIP1620在防治灰葡萄孢(Botrytis cinerea)中的效力。
通过使用来自Luria琼脂平板的菌落来将AIP1620起始培养物进行接种，并使其在0.1X NBY培养液(0.8g Difco Nutrient Broth粉末和0.5g酵母提取物粉末/升去离子水)中进行生长和在28℃和250rpm下进行生长。使生产培养物在于每升去离子水中包含下列成分的培养液中进行生长：11.3g Na2HPO4·7H2O、3.0g KH2PO4、1.0g NH4Cl、10g谷氨酸一钠、3.0g糖蜜、0.49g MgSO4·7H2O、50mg ZnSO4·7H2O、5mg FeSO4·7H2O和对于将pH调整至大约6.2来说足够的盐酸。将50ml的生产培养液放置到250ml的带折流板的培养瓶中，用0.5ml起始培养物进行接种，并且在28℃和250rpm下进行温育。在各种时间处将生产培养物进行接种，然后同时收获，从而产生温育时间为15、24、33和43小时的培养物。通过离心来收获40ml的每种培养物。弃去消耗完的培养液，并且将细胞重悬浮在经高压灭菌的去离子水中，直至40ml的最终体积。
使灰葡萄孢在马铃薯右旋糖培养液上在没有摇动的情况下生长1至2周。从培养液中移出所得的菌丝丛，并将其在经高压灭菌的去离子水中进行匀浆，从而产生液体接种物。
在本地市场上购买以有机方式生长出的草莓。选择无瑕疵的果实，并将其浸入灰葡萄孢接种物中2至3秒钟，然后让其在处理之前干燥60分钟。通过将经接种的果实浸入细胞悬浮液中2-3秒钟来实施AIP1620处理。然后，将果实放置到具有用于维持高湿度的湿纸巾的密封塑料容器中，并在室温下贮存72至84小时。在每个处理中存在有14次重复(草莓)。基于下述的目视酸败严重度量表来对每个草莓进行评级：0＝无损伤，1＝25％损伤，2＝50％损伤，3＝75％损伤，和4＝100％损伤(即，草莓被真菌完全覆盖)。结果概括在下面的表10中。
Figure BDA0002299784510000361
实施例15
进行温室实验以证明AIP1620在防治由卵菌植物病原体瓜果腐霉(Pythiumaphanadermatum)引起的猝倒病中的效力。
通过使用来自Luria琼脂平板的菌落来将AIP1620起始培养物进行接种，并使其在0.1X NBY培养液(0.8g Difco Nutrient Broth粉末和0.5g酵母提取物粉末/升去离子水)中进行生长和在28℃和250rpm下进行生长。使生产培养物在于每升去离子水中包含下列成分的培养液中进行生长：11.3g Na2HPO4·7H2O、3.0g KH2PO4、1.0g NH4Cl、10g谷氨酸一钠、3.0g糖蜜、0.49g MgSO4·7H2O、50mg ZnSO4·7H2O、5mg FeSO4·7H2O和对于将pH调整至大约6.2来说足够的盐酸。将50ml的生产培养液放置到250ml的带折流板的培养瓶中，用0.5ml起始培养物进行接种，并且在28℃和250rpm下进行温育。在各种时间处将生产培养物进行接种，然后同时收获，从而产生温育时间为15、24、33和43小时的培养物。通过离心来收获40ml的每种培养物。弃去消耗完的培养液，并且将细胞重悬浮在经高压灭菌的去离子水中，直至40ml的最终体积。
使用由Holmes和Benson(K.A.Holmes和D.M.Benson,1994.Evaluation ofPhytophthora parasitica var.nicotianae for biocontrol of Phytophthoraparasitica on Catharanthus roseus.Plant Disease,78:193-199)所描述的水稻谷粒方法来制备瓜果腐霉的接种物。将受侵染的水稻谷粒在搅切机中进行粉碎，并通过#10筛进行筛选。将该接种物以6.0g/升(试验1-4)或7.0g/升(试验5)的比率混合到Fafard超细萌发混合物中。
将经接种的萌发混合物放置到392温室穴盘(Landmark Plastic Corporation,Akron,OH)中，并且将一个凤仙花种子栽种入每个孔室中。以0.3ml/孔室的比率施用AIP1620细胞悬浮液。使种子在标准温室条件下萌发。每个处理存在有2或3次重复，其中20个细胞/重复。在7至17天后，通过对在每个处理中的健康幼苗的数目进行计数来对所述分析检定进行评分。结果概括在下面的表11中。
Figure BDA0002299784510000371
实施例16：用AIP1620来防治亚洲大豆锈病
如在前面的实施例中所描述的那样来产生AIP1620细胞。使豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)在易感的大豆植物上生长，并通过真空吸引来从被感染的叶子(其显现出发出的隆斑(pustule))上收获夏孢子(Twizeyimana,M.和Hartman,G.L.2010.Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniosporesurvival at different temperatures and relative humidities.Plant Disease.94:1453-1460)。
通过使用本领域中熟知的技术来使Williams 82大豆植物在植物生长室内进行生长。当植物处于V3-阶段时，用重悬浮的AIP1620细胞、化学杀真菌剂标准物或去离子水(未接种的对照)喷洒第一个完全展开的具三小叶的叶子。一天后，将所述叶子用豆薯层锈菌夏孢子的悬浮液(1×105/ml)进行接种。接种和菌株/杀真菌剂都通过使用连接至空气压缩机的喷雾器来进行施用。将植物保持在处于95％RH的生长室中，其中具有分别在21℃和23℃下12小时光照和12小时黑暗的日循环。在两周后，通过对在经接种的叶子上在随机选择的直径为1cm的圆圈内孢子形成性夏孢子堆的数目进行计数来对疾病严重度进行评分。对于每个处理存在有3次重复(植物)，并且对于每次重复存在有3次夏孢子堆计数。结果显示在下面的表12中，并且证明AIP1620的施用有效地防治了由豆薯层锈菌引起的亚洲大豆锈病。
表12
处理 孢子形成性夏孢子堆/直径为1cm的圆圈
经接种的对照 22.1
化学标准物 0.0
AIP1620 1.8
实施例17：AIP1620与商业杀真菌剂的相容性
在将该菌株与3种商业杀真菌剂相混合后，测量AIP1620的生存力，每种商业杀真菌剂包含不同的活性成分(表13)。选择杀真菌剂浓度以模拟在用于田间施用的典型罐混合物中的那些浓度。
在10mL试管中，使AIP1620在3mL LB培养基中在28℃和250rpm下生长24小时。通过离心来收获细胞粒状沉淀，并悬浮在3mL dH2O中。将900微升的细胞悬浮液与100微升的10X杀真菌剂储液相混合，并在28℃下温育5分钟或120分钟。
Figure BDA0002299784510000391
在与杀真菌剂一起进行温育后，如上面所描述的那样通过离心来收获细胞，重悬浮在去离子水中。通过使用本领域中熟知的技术，将等分试样在去离子水中进行系列稀释，在LB琼脂上进行铺平板，并在28℃下温育2天。对细菌菌落进行计数，并计算在原始溶液中的菌落形成单位的数目/ml(CFU/ml)。数据显示在下面的表14中，并且证明AIP1620的生存力并没有由于与这些经配制的杀真菌剂相混合而不利地受到影响。
Figure BDA0002299784510000392
实施例18：AIP1620与杀真菌剂的混合物针对由豆薯层锈菌引起的亚洲大豆锈病 的保护活性的评价
将细菌接种在50ml的由11.3g Na2HPO4·7H2O，3g KH2PO4，1g NH4Cl，10g谷氨酸一钠，30g糖蜜，493mg MgSO4·7H2O，50mg ZnSO4·7H2O和5mg FeSO4·7H2O/升去离子水组成的液体培养基中。在处于28℃的摇动培养箱中，使培养物在250ml的带折流板的烧瓶中在250rpm下生长2天。通过在3500×g下离心10分钟来收集细胞。弃去培养物上清液，并且将细胞重悬浮在无菌的去离子水中至原始培养物的体积。作为阴性对照，包括了AIP0323，其是不具有抗真菌活性的AIP0069的突变体。
通过真空吸引从被真菌感染的叶子(其显现出发出的隆斑)上收获豆薯层锈菌的夏孢子。将孢子以105/mL重悬浮在水中，并作为气溶胶通过使用气笔而接种在离脱的大豆叶上，其中使用本领域中已知的技术(Twizeyimana,M.和Hartman,G.L.2010.CulturingPhakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival atdifferent temperatures and relative humidities.Plant Disease.94:1453-1460)。
将AIP1620的混合物重悬浮在水中，并且以包括下列的各种比率来制备杀真菌活性成分：106、107、108、109或1010个AIP1620细胞/mL，其与处于1/10X、1/3X、1/2X或1X的正常田间使用量的杀真菌活性成分相混合，所述正常田间使用量通过基于关于“喷洒体积/公顷或英亩”的假设将来自所公布的标签的田间用量转换为g/mL来计算。
将经接种的大豆叶用处于上面滴度的生物防治剂，和用处于上面用量的杀真菌剂，以及用处于上面指定的滴度和用量的以各种组合的生物防治剂和杀真菌剂的混合物进行处理。此外，留下一些经接种的离脱叶不进行处理，或者用作为对照的AIP0323进行处理。对于生物防治剂、化学药剂或混合物的每个处理，使用至少3个叶子(或叶子断片)。以21℃下12小时光照/23℃下12小时黑暗，将离脱叶在生长室内在高湿度中进行温育。在10-14天后，观察叶子，并根据可见的夏孢子堆的数目/cm2来进行评分。
使用Colby等式来确定从所述混合物预期的杀真菌效果(参见Colby,S.R.,Calculation of the synergistic and antagonistic response of herbicidecombinations Weeds.1967,15,20-22，其通过提及而以其整体合并入本文)。
使用下面的等式来计算包含两种活性成分A和B的混合物的预期活性：
所预期的＝A+B-(A×B/100)
A＝所观察到的在与混合物中所使用的浓度相同的浓度下活性组分A的效力；
B＝所观察到的在与混合物中所使用的浓度相同的浓度下活性组分B的效力。
观察到有代表性的协同相互作用(包括所采用的施用量和所得的疾病防治)，并如下进行记录：
％DC＝疾病防治百分比
％DC Obs＝所观察到的疾病防治百分比
％DC Exp＝所预期的疾病防治百分比
协同作用系数＝％DC Obs/％DC Exp。
实施例19：已获得了对于除草剂草铵膦的抗性的生物防治菌株荧光假单胞菌 AIP000069的群体的选择
将50微升的在28℃下在0.5X LB中生长了24小时的AIP000069培养物涂布在包含具有0或100mM草铵膦的M63Plus培养基的平板上。所述M63Plus培养基由13.6g KH2PO4、9.92g C6H12O6、2g(NH4)2SO4、5.5mg CaCl2、0.278mg FeSO4·7H2O和10.16mg MgCl2·6H2O/升去离子水组成。在草铵膦不存在下，在将平板在28℃下温育2天后可见许多细菌菌落(菌苔)。在100mM草铵膦存在下，在相似的温育后看不到菌落；然而，在数天的延长温育后，生长出单个菌落。将该菌落在包含100mM草铵膦的M63琼脂平板上进行划线接种直至分离。将所得的分离物命名为AIP050999。将AIP050999的生长与亲本菌株AIP000069和菌株AIP001620的草甘膦抗性形式进行比较。结果概括在下面的表15中。
Figure BDA0002299784510000421
在说明书中所提及的所有出版物和专利申请指明了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过提及而合并入本文，其程度与当每一单个出版物或专利申请被明确和单独地指明通过提及而合并时相同。
虽然为了清楚理解的目的通过举例说明和实施例而略为详细地描述了上述发明，但是将会显而易见的是，在所附的权利要求书的范围内可以施行某些变化和修饰。

Claims (18)

1.用于改善生物防治剂的方法，所述方法包括将具有生物防治活性的假单胞菌属(Pseudomonas)细菌体外修饰成对于至少一种除草剂具有抗性，其中所述除草剂选自由下列各项组成的组：草甘膦、草铵膦(谷氨酰胺合酶抑制剂)、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂(支链氨基酸合成抑制剂)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述假单胞菌属细菌为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)细菌。
3.经修饰的生物防治剂，其中所述生物防治剂已经在除草剂压力下进行了体外选择并且对于所述除草剂具有抗性，其中所述生物防治剂是具有生物防治活性的假单胞菌属细菌，其中所述除草剂选自由下列各项组成的组：草甘膦、草铵膦(谷氨酰胺合酶抑制剂)、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂(支链氨基酸合成抑制剂)。
4.根据权利要求3所述的经修饰的生物防治剂，其中所述假单胞菌属细菌为荧光假单胞菌或绿针假单胞菌细菌。
5.根据权利要求3或4所述的经修饰的生物防治剂，其中所述假单胞菌属细菌包含以NRRL编号B-50897进行保藏的菌株。
6.经修饰的生物防治剂，其中所述生物防治剂包含具有生物防治活性和对于草甘膦的抗性并且以NRRL编号B-50897进行保藏的假单胞菌属细菌菌株，其中所述菌株的亲本经体外修饰以具有所述对于草甘膦的抗性。
7.防治植物病原体的方法，其包括向作物、种子或栽培区域施用有效量的生物防治剂和杀真菌剂的组合，其中所述生物防治剂以NRRL编号B-50897进行保藏并且是活的绿针假单胞菌菌株，其中所述杀真菌剂包含环酰菌胺、嘧菌酯、戊唑醇、苯醚甲环唑、百菌清或氟菌唑，其中所述杀真菌剂以小于1X的所述植物病原体的标签的田间使用率施用于所述作物或种子，并且其中所述有效量防治所述植物病原体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述杀真菌剂以约1/3X或约1/2X的所述植物病原体的标签的田间使用率施用于所述作物或种子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物防治剂以约1012至约1016个菌落形成单位(CFU)/公顷施用。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物病原体包括真菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述真菌包括豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)。
12.根据权利要求7所述的方法，其中同时施用所述生物防治剂和所述杀真菌剂。
13.根据权利要求7所述的方法，其中顺次施用所述生物防治剂和所述杀真菌剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法包括在栽培区域种植包被有所述生物防治剂的种子，并向所述种子、从所述种子生长出的作物或所述栽培区域以小于1X的所述植物病原体的标签的田间使用率将所述杀真菌剂施用于所述作物或种子。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
16.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述真菌包括葡萄孢属(Botrytis)真菌、刺盘孢属(Colletotrichum)真菌、疫霉属(Phytophthora)真菌、腐霉属(Pythium)真菌或层锈菌属(Phakopsora)。
18.防治植物病原体的方法，其包括向作物、种子或栽培区域施用有效量的生物防治剂和杀真菌剂的组合，其中所述生物防治剂以NRRL编号B-50897进行保藏并且是活的绿针假单胞菌菌株，其中所述杀真菌剂包含环酰菌胺、嘧菌酯、戊唑醇、苯醚甲环唑、百菌清或氟菌唑，其中所述有效量防治所述植物病原体，并且其中与将所述杀真菌剂单独施用于作物、种子或栽培区域相比，所述生物防治剂的量有效降低所述杀真菌剂的量，以实现至少等量的所述植物病原体的防治。
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