JP7299204B2 - 改変された生物防除因子およびその使用 - Google Patents

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Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１４年１月３１日に出願された米国仮出願第６１／９３３，９５４号および２０１５年１月１６日に出願された米国仮出願第６２／１０４，１２２号に対する利益を主張し、両出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
（発明の分野）
本発明は、改善された特性を有する、改変された生物防除因子および集団に関する。
（背景）
植物の病気および有害生物は、世界中の栽培者によって生産される食物、飼料、および繊維の品質および量を維持するために防除される必要がある。植物の病気は、真菌、細菌、ウイルスおよび線形動物によって主に引き起こされる。植物の有害生物としては、とりわけ、Ｌｅｐｄｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、およびＨｅｍｉｐｔｅｒａに由来する咀嚼昆虫、吸汁昆虫、および穿刺昆虫が挙げられる。化学農薬は、農作物をこのような有害生物および病気から保護するために農業において広く使用されている。これら化学製品は、農作物有害生物、病気、および雑草と戦って、改善された収量を生じる。農作物保護および有害生物防除がなければ、食物生産および生産された食物の品質は低下する。しかし、化学農薬の使用は、あるレベルのリスクを負わせる。なぜならその多くは、適切に使用されなければ健康および環境を危険にさらし得る特性を有するからである。
農薬、除草剤、もしくは他の農作物保護化学物質の使用の継続に伴う問題は、防除因子に対する抵抗性の発生である。農薬抵抗性は、種の大部分の個体を一度は死滅させた用量における防除因子に対する有害生物集団の感受性の低下である。従って、抵抗性管理の一助となるように異なる作用様式を伴う新製品が必要とされる。
系統発生的に多様な微生物が、種々の植物病原体および有害生物の天然の拮抗因子として作用し得ることは、長く公知であった。植物宿主と生物防除をもたらす微生物との間の相互作用としては、抗生作用、競合、宿主抵抗性の誘発、および捕食が挙げられ得る。単離物のスクリーニングおよび試験によって、商品化のための多くの候補がもたらされた。微生物の生物農薬は、植物の病気および有害生物の管理のための重要な選択肢を代表する。特に、商業的農業において一般に使用されており、かつ微生物に対して抗生物質効果を有し得る除草剤および殺真菌剤の存在下で、圃場条件下において競合することができる生物学的防除因子が必要とされている。
（要旨）
生物学的因子もしくは生物防除因子の集団が、圃場環境において競合しかつ生存する能力を改善するための組成物および方法が、提供される。生物学的因子の集団を改善することによって、因子の改変された集団は、増殖し、他の微生物株および真菌と競合し、病原体からの植物の保護を提供することができる。さらに、改変された生物学的防除因子は、植物生長および収量を増進する。特に、殺生物剤寛容性もしくは抵抗性であるか；除草剤寛容性もしくは抵抗性であるか；殺真菌剤寛容性もしくは抵抗性であるか；農薬寛容性もしくは抵抗性であるか；または農作物保護化学物質に対して寛容性もしくは抵抗性である、改変された生物学的因子およびこのような因子の改変された集団が、選択されるかまたは操作される。このようにして、病気の原因因子もしくは有害生物からの農作物の保護は、増強される。
上記改変された生物学的因子は、商業的農業において使用される少なくとも１種の除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質の存在下で増殖し得る。このような改変された生物学的因子は、このような除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質が適用された土壌の中で増殖および生殖し得る。上記改変された生物学的因子は、上記土壌を、病気の原因である病原体もしくは有害生物に対して抑制性もしくは抵抗性にする。このような生物学的因子の改変された集団は、真菌病原体およびこれらが引き起こす病気を防止するために、または昆虫有害生物もしくは線虫による摂食を阻害するために、土壌に添加され得、植物生長を増進しかつ農作物収量を増大させる。従って、本発明は、特に、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対して抵抗性でない他の微生物因子を上回って、改変された生物学的因子の競合性を増強するために有用である。従って、本発明の組成物は、選択もしくは操作された生物学的因子および生物防除因子の改変された集団を含む。これら改変された生物学的因子は、接種物として、または植物および種子のための種子コーティングとして使用され得る。上記生物学的因子はまた、植物の地上部に直接スプレー適用として適用され得、それらが改変されて寛容性になった除草剤もしくは他の化学物質と混合され得る。示されるように、圃場条件下での上記改変された生物学的因子の存在は、病原体への上記植物の抵抗性を増強し、植物生長を増進する。本発明のこのような改変された生物学的因子は、植物生長および収量を増進するために、他の因子とともに使用され得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
生物防除因子を改善するための方法であって、該方法は、該生物防除因子を少なくとも１種の除草剤、殺真菌剤、農薬、または他の農作物保護化学物質に対して抵抗性であるように改変する工程を包含する方法。
（項目２）
前記生物防除因子は、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質の存在下で増殖させて、抵抗性株を選択することによって改変される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生物防除因子は、前記除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対する抵抗性を付与する遺伝子で該生物防除因子を形質転換することによって改変される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記生物防除因子は、細菌性生物防除因子である、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群より選択される、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である、項目５に記載の方法。（項目７）
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓである、項目６に記載の方法。（項目８）
前記除草剤は、グリホサート、グルホシネート（グルタミンシンターゼインヒビター）、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン除草剤（分枝鎖アミノ酸合成インヒビター）からなる群より選択される、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
改変された生物防除因子であって、ここで該生物防除因子は、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質の圧の下で選択されており、該除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対して抵抗性である、改変された生物防除因子。
（項目１０）
前記改変された生物防除因子は、細菌性生物防除因子である、項目９に記載の改変された生物防除因子。
（項目１１）
前記生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群より選択される、項目９に記載の改変された生物防除因子。
（項目１２）
前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である、項目１０に記載の改変された生物防除因子。
（項目１３）
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓである、項目１２に記載の改変された生物防除因子。
（項目１４）
前記除草剤は、グリホサート、グルホシネート（グルタミンシンターゼインヒビター）、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン除草剤（分枝鎖アミノ酸合成インヒビター）からなる群より選択される、項目９～１３のいずれか１項に記載の改変された生物防除因子。（項目１５）
組換え生物防除因子であって、ここで該生物防除因子は、該生物防除因子を除草剤抵抗性にする除草剤抵抗性遺伝子で形質転換されている、組換え生物防除因子。
（項目１６）
前記改変された生物防除因子は、細菌性生物防除因子である、項目１５に記載の組換え生物防除因子。
（項目１７）
前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群より選択される、項目１６に記載の組換え生物防除因子。
（項目１８）
前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である、項目１７に記載の組換え生物防除因子。
（項目１９）
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓである、項目１８に記載の組換え生物防除因子。
（項目２０）
前記除草剤は、グリホサート、グルホシネート（グルタミンシンターゼインヒビター）、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン除草剤（分枝鎖アミノ酸合成インヒビター）からなる群より選択される、項目１５～１９のいずれか１項に記載の組換え生物防除因子。
（項目２１）
生物防除因子の改変された集団であって、ここで該集団は、項目１～２０のいずれか１項に記載の生物防除因子を実質的に含む、生物防除因子の改変された集団。
（項目２２）
生物防除因子の改変された集団および適切なキャリアを含む、植物病原体を防除するための製剤であって、ここで該生物防除因子は、除草剤抵抗性である、製剤。
（項目２３）
前記集団は、改変された細菌性生物防除因子を含む、項目２２に記載の製剤。
（項目２４）
前記集団は、組換え生物防除因子を含む、項目２２に記載の製剤。
（項目２５）
前記生物防除因子は、ある圃場適用割合の殺生物剤の存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、項目２２～２４のいずれか１項に記載の製剤。
（項目２６）
前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株を含み、前記殺生物剤は、グリホサートである、項目２５に記載の製剤。
（項目２７）
前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された株を含み、前記殺生物剤は、グルホシネートである、項目２５に記載の製剤。
（項目２８）
生物防除因子が圃場環境において競合する能力を改善するための方法であって、該方法は、改変された生物防除因子が、除草剤の存在下で増殖することができるように該生物学的因子を改変する工程を包含する、方法。
（項目２９）
植物生長を増進するための方法であって、該方法は、生物防除因子の改変された集団を含む組成物を、該植物が生長している土壌に適用する工程を包含する、方法。
（項目３０）
前記生物防除因子は、グリホサートもしくはグルホシネートに対して抵抗性であるように改変されている、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
農作物、種子もしくは栽培地に、殺生物剤の有効量および改変された生物防除因子の有効量の組み合わせを適用する工程を包含する、植物を生長させるための方法であって、ここで
（ａ）該殺生物剤の該有効量は、目的の生物を選択的に防除する一方で、該農作物は顕著に損害を受けないようなものであり；そして
（ｂ）該改変された生物防除因子の該有効量は、同じ濃度の改変されていない生物防除因子が該殺生物剤の該有効量と組み合わせて適用される場合に起こる植物の健康状態、収量および／もしくは生長と比較したときに、該植物の健康状態、収量および／もしくは生長において統計的に有意な増大をもたらすために十分である、
方法。
（項目３２）
前記改変された生物防除因子および前記殺生物剤は、同時に適用される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記改変された生物防除因子および前記殺生物剤は、逐次的に適用される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株を含む、項目３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記殺生物剤は、グリホサートであり、グリホサートの前記有効量は、雑草を選択的に防除する一方で、前記農作物が顕著に損傷を受けないようなものである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された株ＡＩＰ０５０９９９を含み、前記殺生物剤は、グルホシネートである、項目３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記殺生物剤は、グルホシネートであり、グルホシネートの前記有効量は、雑草を選択的に防除する一方で、前記農作物が顕著に損傷を受けないようなものである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
生物防除因子の培養された集団であって、ここで該培養された集団は、除草剤、殺真菌剤、農薬もしくは農作物保護化学物質の圧の下で因子の集団を増殖させて、該除草剤、殺真菌剤、農薬もしくは他の農作物保護化学物質に対して抵抗性である生物防除因子の精製された培養物を選択することによって生産される、生物防除因子の培養された集団。
（項目３９）
前記生物防除因子は、ある圃場適用割合の殺生物剤の存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、項目３８に記載の生物防除因子の培養された集団。
（項目４０）
生物防除因子の単離された生物学的に純粋な培養物であって、ここで該生物防除因子は、除草剤、殺真菌剤、農薬もしくは農作物保護化学物質から選択される殺生物剤に対して抵抗性であり、該培養物は、該殺生物剤の存在下で増殖させることによって生産される、生物防除因子の単離された生物学的に純粋な培養物。
（項目４１）
前記生物防除因子は、ある圃場適用割合の殺生物剤の存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、項目４０に記載の生物防除因子の単離された生物学的に純粋な培養物。
（項目４２）
前記組成物は、適切なキャリアを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株から増殖される細菌培養物であって、ここで該細菌培養物は、抗真菌活性を有し、グリホサートの存在下で増殖できる、細菌培養物。
（項目４４）
ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された前記株は、ある圃場適用割合のグリホサートの存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、項目４３に記載の細菌培養物。
（項目４５）
ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された株ＡＩＰ０５０９９９から増殖される細菌培養物であって、ここで該細菌培養物は、抗真菌活性を有し、グルホシネートの存在下で増殖できる、細菌培養物。
（項目４６）
ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された前記株ＡＩＰ０５０９９９は、ある圃場適用割合のグルホシネートの存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、項目４５に記載の細菌培養物。
本発明の実施形態として、以下が挙げられる：
１． 生物防除因子を改善するための方法であって、該方法は、該生物防除因子を少なくとも１種の除草剤、殺真菌剤、農薬、または他の農作物保護化学物質に対して抵抗性であるように改変する工程を包含する方法。
２． 前記生物防除因子は、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質の存在下で増殖させて、抵抗性株を選択することによって改変される、実施形態１に記載の方法。
３． 前記生物防除因子は、前記除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対する抵抗性を付与する遺伝子で該生物防除因子を形質転換することによって改変される、実施形態１に記載の方法。
４． 前記生物防除因子は、細菌性生物防除因子である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５． 前記生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群より選択される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
６． 前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である、実施形態５に記載の方法。
７． 前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓである、実施形態６に記載の方法。
８． 前記除草剤は、グリホサート、グルホシネート（グルタミンシンターゼインヒビター）、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン除草剤（分枝鎖アミノ酸合成インヒビター）からなる群より選択される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９． 改変された生物防除因子であって、ここで該生物防除因子は、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質の圧の下で選択されており、該除草、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対して抵抗性である、改変された生物防除因子。
１０． 前記改変された生物防除因子は、細菌性生物防除因子である、実施形態９に記載の改変された生物防除因子。
１１． 前記生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群より選択される、実施形態９に記載の改変された生物防除因子。
１２． 前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である、実施形態１０に記載の改変された生物防除因子。
１３． 前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓである、実施形態１２に記載の改変された生物防除因子。
１４． 前記除草剤は、グリホサート、グルホシネート（グルタミンシンターゼインヒビター）、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン除草剤（分枝鎖アミノ酸合成インヒビター）からなる群より選択される、実施形態９～１３のいずれか１つに記載の改変された生物防除因子。
１５． 組換え生物防除因子であって、ここで該生物防除因子は、該生物防除因子を除草剤抵抗性にする除草剤抵抗性遺伝子で形質転換されている、組換え生物防除因子。
１６． 前記改変された生物防除因子は、細菌性生物防除因子である、実施形態１５に記載の組換え生物防除因子。
１７． 前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群より選択される、実施形態１６に記載の組換え生物防除因子。
１８． 前記細菌性生物防除因子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である、実施形態１７に記載の組換え生物防除因子。
１９． 前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓである、実施形態１８に記載の組換え生物防除因子。
２０． 前記除草剤は、グリホサート、グルホシネート（グルタミンシンターゼインヒビター）、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン除草剤（分枝鎖アミノ酸合成インヒビター）からなる群より選択される、実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の組換え生物防除因子。
２１． 生物防除因子の改変された集団であって、ここで該集団は、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の生物防除因子を実質的に含む、生物防除因子の改変された集団。
２２． 生物防除因子の改変された集団および適切なキャリアを含む、植物病原体を防除するための製剤であって、ここで該生物防除因子は、除草剤抵抗性である、製剤。
２３． 前記集団は、改変された細菌性生物防除因子を含む、実施形態２２に記載の製剤。
２４． 前記集団は、組換え生物防除因子を含む、実施形態２２に記載の製剤。
２５． 前記生物防除因子は、ある圃場適用割合の殺生物剤の存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、実施形態２２～２４のいずれか１つに記載の製剤。
２６． 前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株を含み、前記殺生物剤は、グリホサートである、実施形態２５に記載の製剤。
２７． 前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された株ＡＩＰ０５０９９９を含み、前記殺生物剤は、グルホシネートである、実施形態２５に記載の製剤。
２８． 生物防除因子が圃場環境において競合する能力を改善するための方法であって、該方法は、改変された生物防除因子が、除草剤の存在下で増殖することができるように該生物学的因子を改変する工程を包含する、方法。
２９． 植物生長を増進するための方法であって、該方法は、生物防除因子の改変された集団を含む組成物を、該植物が生長している土壌に適用する工程を包含する、方法。
３０． 前記生物防除因子は、グリホサートもしくはグルホシネートに対して抵抗性であるように改変されている、実施形態２９に記載の方法。
３１． 農作物、種子もしくは栽培地に、殺生物剤の有効量および改変された生物防除因子の有効量の組み合わせを適用する工程を包含する、植物を生長させるための方法であって、ここで
（ａ）該殺生物剤の該有効量は、目的の生物を選択的に防除する一方で、該農作物は顕著に損害を受けないようなものであり；そして
（ｂ）該改変された生物防除因子の該有効量は、同じ濃度の改変されていない生物防除因子が該殺生物剤の該有効量と組み合わせて適用される場合に起こる植物の健康状態、収量および／もしくは生長と比較したときに、該植物の健康状態、収量および／もしくは生長において統計的に有意な増大をもたらすために十分である、
方法。
３２． 前記改変された生物防除因子および前記殺生物剤は、同時に適用される、実施形態３１に記載の方法。
３３． 前記改変された生物防除因子および前記殺生物剤は、逐次的に適用される、実施形態３２に記載の方法。
３４． 前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株を含む、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５． 前記殺生物剤は、グリホサートであり、グリホサートの前記有効量は、雑草を選択的に防除する一方で、前記農作物が顕著に損傷を受けないようなものである、実施形態３４に記載の方法。
３６． 前記生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された株ＡＩＰ０５０９９９を含み、前記殺生物剤は、グルホシネートである、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３７． 前記殺生物剤は、グルホシネートであり、グルホシネートの前記有効量は、雑草を選択的に防除する一方で、前記農作物が顕著に損傷を受けないようなものである、実施形態３６に記載の方法。
３８． 生物防除因子の培養された集団であって、ここで該培養された集団は、除草剤、殺真菌剤、農薬もしくは農作物保護化学物質の圧の下で因子の集団を増殖させて、該除草剤、殺真菌剤、農薬もしくは他の農作物保護化学物質に対して抵抗性である生物防除因子の精製された培養物を選択することによって生産される、生物防除因子の培養された集団。
３９． 前記生物防除因子は、ある圃場適用割合の殺生物剤の存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、実施形態３８に記載の生物防除因子の培養された集団。
４０． 生物防除因子の単離された生物学的に純粋な培養物であって、ここで該生物防除因子は、除草剤、殺真菌剤、農薬もしくは農作物保護化学物質から選択される殺生物剤に対して抵抗性であり、該培養物は、該殺生物剤の存在下で増殖させることによって生産される、生物防除因子の単離された生物学的に純粋な培養物。
４１． 前記生物防除因子は、ある圃場適用割合の殺生物剤の存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、実施形態４０に記載の生物防除因子の単離された生物学的に純粋な培養物。
４２． 前記組成物は、適切なキャリアを含む、実施形態３８に記載の方法。
４３． ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株から増殖される細菌培養物であって、ここで該細菌培養物は、抗真菌活性を有し、グリホサートの存在下で増殖できる、細菌培養物。
４４． ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された前記株は、ある圃場適用割合のグリホサートの存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、請求項４３に記載の細菌培養物。
４５． ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された株ＡＩＰ０５０９９９から増殖される細菌培養物であって、ここで該細菌培養物は、抗真菌活性を有し、グルホシネートの存在下で増殖できる、細菌培養物。
４６． ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された前記株ＡＩＰ０５０９９９は、ある圃場適用割合のグルホシネートの存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を改善するために十分な有効量で存在する、請求項４５に記載の細菌培養物。
図１は、グリホサートの存在下での種々の株の増殖曲線を提供する。
（詳細な説明）
生物学的防除因子を改善するための組成物および方法が提供される。本発明の目的の生物学的因子もしくは生物防除因子は、病気の原因となる植物病原体および植物有害生物を防除するために使用される微生物を説明するために使用される。本発明の生物学的防除因子は、これらが少なくとも１種の殺生物剤の存在下で増殖できるように改変されている。殺生物剤は、化学的手段もしくは生物学的手段によって生物に対して防除効果を発揮し得る化学物質である。殺生物剤としては、農薬、例えば、殺真菌剤；除草剤；殺虫剤、他の農作物保護化学物質などが挙げられる。本発明の組成物は、殺生物剤（例えば、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質）に対する抵抗性に関して選択された１種またはより多くの単離された生物防除因子；除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質への抵抗性遺伝子を含むように形質転換された組換え生物防除因子；少なくとも１種の除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対して抵抗性である、生物防除因子の改変された集団；ならびにこれら生物防除因子の改変された集団を含む組成物を含む。上記改変された集団は、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質への抵抗性について選択されたか、またはこのような除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質への抵抗性もしくは寛容性を付与する遺伝子で形質転換された微生物を含み得る。従って、本発明は、このような改変された生物防除因子もしくは改変された生物学的因子の、実質的に純粋な培養物もしくは生物学的に純粋な培養物を含む。「生物学的に純粋な細菌培養物」とは、通常の細菌学技術によって検出される量で、他の細菌種を含まない細菌の培養物を指す。別の方法で述べると、それは、存在する上記細菌細胞の事実上全てが選択された株である培養物である。改変された生物防除因子として、選択圧に起因する形質を獲得した生物防除因子、および少なくとも１種の除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質への抵抗性もしくは寛容性を付与する遺伝子で形質転換された組換え生物防除因子が挙げられる。
本発明は、特定の改変された生物学的防除因子をさらに包含する。このような因子は、ＡＩＰ１６２０を含む。ＡＩＰ１６２０は、グリホサート寛容性に関して選択されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株である。さらなる因子は、ＡＩＰ０５０９９９を含む。ＡＩＰ０５０９９９は、グルホシネート寛容性に関して選択されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株である。
ＡＩＰ１６２０を、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．）に２０１４年１月３１日に寄託し、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７が割り当てられた。ＡＩＰ０５０９９９を、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｐｅｏｒｉａ，
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．）に２０１５年１月２３日に寄託し、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９が割り当てられた。これら寄託物の各々は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項の下で維持される。この寄託は当業者の便宜としてのみ行われたものであり、寄託が米国特許法第１１２条の下で要求されるという自認ではない。
「除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質への寛容性または除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質への抵抗性」とは、生物（すなわち、植物、生物防除因子、生物防除細菌因子など）が、その野生型生物に対して通常は致死的である除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質のある用量への曝露後に、生存しかつ生殖する能力を意図する。
本発明の生物学的因子もしくは生物防除因子として、病気の原因となる植物病原体を防除しかつ植物の健康状態、生長、および収量を増進する、微生物および真菌が挙げられる。これら生物学的もしくは生物防除因子のうちのいずれも、選択もしくは形質転換によって改変され得、改変された生物学的もしくは生物防除因子または組換えの生物学的もしくは生物防除因子を生産し得る。従って、本発明は、単離され改変された生物防除因子を包含する。上記改変された生物防除因子は、生物防除因子の集団を生産するために増殖させられ得る。「生物学的もしくは生物防除因子の改変された集団」とは、目的の形質（例えば、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対する抵抗性）を有する、選択された因子もしくは組換え因子の培養物を実質的に含む因子の集団を意図する。実質的に含むとは、上記集団が上記改変されたもしくは上記組換えの生物防除因子から増殖および生産されていることを意図する。すなわち、上記改変されたもしくは組換えの生物防除因子は、生物学的に純粋な培養物を生産するために増殖させられ得る。このような生物学的に純粋な培養物が植物の健康状態、生長、もしくは収量を増強するために一緒に使用され得ることが、認識されている。
任意の生物学的もしくは生物防除因子は、本発明の方法において使用され得る。特定の目的の微生物としては、以下の細菌株が挙げられる：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓなど。目的の真菌としては、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ、Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ、Ｇｌｏｍｕｓなどが挙げられる。例えば、米国特許第５，３４８，７４２号；同第５，４９６，５４７号；同第５，７５６，０８７号；同第５，９５５，３４８号；同第６，０６０，０５１号；同第６，６３５，４２５号；および米国特許出願公開番号２０１３０１４２７５９（これらは全て本明細書に参考として援用される）を参照のこと。多くの生物防除因子は市場に出ており、それらのうちのいずれも、本発明に従って改変され得る。そのような因子として、以下が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ Ｋ８４；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＢ０３；Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｉｒｍｕｓ Ｉ－１５８２；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ（ＩＣＣ ０１２）；Ｔ． ｇａｍｓｉｉ（ＩＣＣ ０８０）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ株ＱＳＴ ２８０８；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＱＳＴ ７１３；Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＭＢＩ ６００；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｒｉｆａｉ株ＫＲＬ－ＡＧ２；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ Ｔ－２２；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ Ｔ－２２；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ株Ｇ－４１；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ Ｔ－２２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＱＳＴ ７１３；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｄ７４７；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ （Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ） ｖｉｒｅｎｓ ＧＬ－２１；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ；Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓ；Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＳＭ １７２３１；Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １７２３６；Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ ＤＶ ７４；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＢ０３；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ；Ｔ． ｇａｍｓｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ＥＳＣ－１０；Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ Ｔ－２２；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ＭＡ ３４２；Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ；Ｃｈｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ株ＰＲＡＡ４－１；Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ２４；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｉｌａｉｉ；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ ＦＥ ９９０１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｙｄｉｃｕｓ ＷＹＥＣ １０８；Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ Ａ５０６；Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ ｍｉｎｉｔａｎｓ；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ株２５１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｙｄｉｃｕｓ ＷＹＥＣ－１０８；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ；Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓ；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｕｌｉｓ；Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ＡＡＲＣ－０２５５；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株Ｋ６１；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ Ｊ１４４６；Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ株ＤＳＭ １４９４０；およびＡ． ｐｕｌｌｕｌａｎｓ株ＤＳＭ １４９４１。さらなる生物学的な病気の防除製品は、ｎｅｖｅｇｅｔａｂｌｅ．ｏｒｇ／ｔａｂｌｅ－２２－ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｄｉｓｅａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｓのワールドワイドウェブ上で見出され得る。
病気の原因となる病原体としては、真菌、細菌、ウイルスおよび線形動物が挙げられる。本発明の生物防除因子は、植物病原体のうちのいずれかを標的とするものである。標的病原体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ，
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、－Ｅｒｉｓｙｐｈａｅ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｓｐｐ．、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ、Ｔａｐｈｒｉｎａ、Ｅｌｓｉｎｏｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ、Ｇｎｏｍｏｎｉａ、Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ、Ｎｅｃｔｒｉａ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ、Ａｌｂｕｇｏ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｏｍｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ、Ｐｈｏｍａ、Ｃｒｉｓｔｕｌａｒｉｅｌｌａ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ、Ｔｈｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂｒｅｍｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ。
除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質への抵抗性は、ある生物が、その野生型生物に対して通常は致死的であるか、またはその野生型生物の増殖を実質的に低減する除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質のある用量への曝露後に生存しかつ生殖する能力である。抵抗性は、選択に起因して誘発もしくは同定されてもよいし、遺伝的操作を通じて誘発されてもよい。選択を通じて改変された生物防除因子の集団を同定および生産するために、上記生物防除因子は、選択圧としての除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質の存在下で増殖させられる。感受性の因子は死滅する一方で、抵抗性の因子は競合なしに生存して生殖する。上記生物防除因子は、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質の存在下で増殖させられるので、抵抗性の生物防除因子は、成功裡に生殖し、集団の中で優勢になり、生物防除因子の改変された集団になる。抵抗性株を選択するための方法は公知であり、米国特許第４，３０６，０２７号および同第４，０９４，０９７号（本明細書に参考として援用される）を含む。従って、本発明は、抵抗性の生物防除株の生物学的に純粋な培養物を含む。本発明の抵抗性株は、これらが特定の除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対して顕著により寛容性であることを除いて、その元の感受性株と同じ同定特徴を有する。従って、それらの同定は、公知の感受性株の特徴との比較によって容易に可能である。
除草剤としては、グリホサート、ＡＣＣａｓｅインヒビター（アリールオキシフェノキシ（Ａｒｌｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）プロピオネート（ＦＯＰＳ））；ＡＬＳインヒビター（スルホニルウレア（ＳＵ））、イミダゾリノン（Ｉｍｉｄａｚｏｎｌｉｎｏｎｅ）（ＩＭＩ）、ピリミジン（ＰＭ））；微小管タンパク質インヒビター（ジニトロアニリン（ＤＮＡ））；合成オーキシン（フェノキシ（Ｐ））、安息香酸（ＢＡ）、カルボン酸（ＣＡ））；光合成系ＩＩインヒビター（トリアジン（ＴＺ））、トリアジノン（ＴＮ）、ニトリル（ＮＴ）、ベンゾチアジアジノン（ＢＺ）、ウレア（ＵＳ））；ＥＰＳＰシンターゼインヒビター（グリシン（ＧＣ））；グルタミン合成インヒビター（ホスフィン酸（ＰＡ））；ＤＯＸＰシンターゼインヒビター（イソオキサゾリジノン（ＩＡ））；ＨＰＰＤインヒビター（ピラゾール（ＰＡ））、トリケトン（ＴＥ））；ＰＰＯインヒビター（ジフェニルエーテル（ＤＥ）、Ｎ－フェニルフタルイミド（ＮＰ）（アリールトリアジノン（Ａｒｙ ｔｒｉａｚｉｎｏｎｅ）（ＡＴ））；ＶＬＦＡインヒビター（クロロアセトアミド（ＣＡ））、オキシアセトアミド（ＯＡ））；光合成系Ｉインヒビター（ビピリジリウム（Ｂｉｐｙｒｉｄｙｌｉｕｍｓ）（ＢＰ））；などが挙げられる。
農薬としては、イミダクロプリドクロチアニジン、アリールピラゾール化合物（ＷＯ２００７１０３０７６）；有機リン、フェニルピラゾール、ピレスロイド（ｐｙｒｅｔｈｏｉｄｓ）カラモイルオキシム（ｃａｒａｍｏｙｌｏｘｉｍｅｓ）、ピラゾール、アミジン、ハロゲン化炭化水素、カルバメートおよびその誘導体、テルブホス、クロルピリホス（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｆｏｓ）、フィプロニル、クロルエトキシホス、テフルトリン（ｔｅｌｆｕｔｈｒｉｎ）、カルボフラン、イミダクロプリド、テブピリムホス（５，８４９，３２０）が挙げられる。
殺真菌剤としては、以下が挙げられる：脂肪族窒素殺真菌剤（ブチルアミン、シモキサニル、ドジシン、ドジン、グアザチン、イミノクタジン）；アミド殺真菌剤（ベンゾビンジフルピル、カルプロパミド、クロラニホルメタン、シフルフェナミド、ジクロシメット、ジクロシメット、ジモキシストロビン、フェナミンストロビン、フェノキサニル、フルメトベル、フラメトピル、イソフェタミド、イソピラザム、マンデストロビン、マンジプロパミド、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンチオピラド、プロクロラズ、キナザミド、シルチオファム、トリホリン）；アシルアミノ酸殺真菌剤（ベナラキシル、ベナラキシルＭ、フララキシル、メタラキシル、メタラキシルＭ、ペフラゾエート、バリフェナレート）；アニリド殺真菌剤（ベナラキシル、ベナラキシルＭ、ビキサフェン、ボスカリド、カルボキシンフェンヘキサミド、フルキサピロキサド、イソチアニル、メタラキシル、メタラキシルＭ、メトスルホバックス、オフレース、オキサジキシル、オキシカルボキシン、ペンフルフェン、ピラカルボリド、セダキサン、チフルザミド、チアジニル、バンガード（ｖａｎｇｕａｒｄ））；ベンズアニリド殺真菌剤（ベノダニル、フルトラニル、メベニル、メプロニル、サリチルアニリド、テクロフタラム）；フルアニリド（ｆｕｒａｎｉｌｉｄｅ）殺真菌剤（フェンフラム、フララキシル、フルカルバニル、メトフロキサム）；スルホンアニリド殺真菌剤（フルスルファミド）；ベンズアミド殺真菌剤（ベンゾヒドロキサム酸、フルオピコリド、フルオピラム、チオキシミド、トリクラミド、ザリラミド、ゾキサミド）；フラミド殺真菌剤（シクラフラミド、フルメシクロックス）；フェニルスルファミド殺真菌剤（ジクロフルアニド、トリルフルアニド）；スルホンアミド殺真菌剤（アミスルブロム、シアゾファミド）；バリンアミド殺真菌剤（ベンチアバリカルブ、イプロバリカルブ）；抗生物質殺真菌剤（オーレオファンギン（ａｕｒｅｏｆｕｎｇｉｎ）、ブラストサイジンＳ、シクロヘキシミド、グリセオフルビン、カスガマイシン、モロキシジン、ナタマイシン、ポリオキシン、ポリオキソリム（ｐｏｌｙｏｘｏｒｉｍ）、ストレプトマイシン、バリダマイシン）；ストロビルリン殺真菌剤（フルオキサストロビン、マンデストロビン）；メトキシアクリレートストロビルリン殺真菌剤（アゾキシストロビン、ビフジュンチ（ｂｉｆｕｊｕｎｚｈｉ）、クモキシストロビン、エノキサストロビン、フルフェノキシストロビン、ジアシアンジュンチ（ｊｉａｘｉａｎｇｊｕｎｚｈｉ）、ピコキシストロビン、ピラオキシストロビン）；メトキシカルバニレート（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂａｎｉｌａｔｅ）ストロビルリン殺真菌剤（ピラクロストロビン、ピラメトストロビン、トリクロピリカルブ）；メトキシイミノアセトアミドストロビルリン殺真菌剤（ジモキシストロビン、フェナミンストロビン、メトミノストロビン、オリサストロビン）；メトキシイミノアセテートストロビルリン殺真菌剤（クレソキシムメチル、トリフロキシストロビン）；芳香族殺真菌剤（ビフェニル、クロロジニトロナフタレン、クロロネブ、クロロタロニル、クレゾール、ジクロラン、フェンジュントン（ｆｅｎｊｕｎｔｏｎｇ）、ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロフェノール、キントゼン、ナトリウムペンタクロロフェノキシド、テクナゼン、トリクロロトリニトロベンゼン）；ヒ素を含む殺真菌剤（アソメート、ウルバシド（ｕｒｂａｃｉｄｅ））；アリールフェニルケトン殺真菌剤（メトラフェノン、ピリオフェノン）；ベンゾイミダゾール殺真菌剤（アルベンダゾール、ベノミル、カルベンダジム、クロルフェナゾール、シペンダゾール、デバカルブ、フベリダゾール、メカルビンジド、ラベンザゾール、チアベンダゾール）；ベンゾイミダゾール前駆体殺真菌剤（フロファネート、チオファネート、チオファネートメチル）；ベンゾチアゾール殺真菌剤（ベンタルロン、ベンチアバリカルブ、ベンチアゾール（ｂｅｎｔｈｉａｚｏｌｅ）、クロベンチアゾン、プロベナゾール）；植物性殺真菌剤（アリシン、ベルベリン、カルバクロール、カルボン、オストール、サンギナリン、サントニン）；架橋ジフェニル殺真菌剤（ビチオノール、ジクロロフェン、ジフェニルアミン、ヘキサクロロフェン、パリノール）；カルバメート殺真菌剤（ベンチアバリカルブ、フロファネート、ヨードカルブ（ｉｏｄｏｃａｒｂ）、イプロバリカルブ、ピカルブトラゾクス、プロパモカルブ、ピリベンカルブ、チオファネート、チオファネートメチル、トルプロカルブ）；ベンゾイミダゾリルカルバメート殺真菌剤（アルベンダゾール、ベノミル、カルベンダジム、シペンダゾール、デバカルブ、メカルビンジド）；カルバニレート殺真菌剤（ジエトフェンカルブ、ピラクロストロビン、ピラメトストロビン、トリクロピリカルブ）；コナゾール殺真菌剤、コナゾール殺真菌剤（イミダゾール）（クリンバゾール、クロトリマゾール、イマザリル、オキスポコナゾール、プロクロラズ、トリフルミゾール）；コナゾール殺真菌剤（トリアゾール）（アザコナゾール、ブロムコナゾール、シプロコナゾール、ジクロブトラゾール、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、ジニコナゾールＭ、エポキシコナゾール、エタコナゾール、フェンブコナゾール、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルトリアホール、フルコナゾール、フルコナゾール・シス、ヘキサコナゾール、イミベンコナゾール、イプコナゾール、メトコナゾール、ミクロブタニル、ペンコナゾール、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、キンコナゾール、シメコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール、トリアジメホン、トリアジメノール、トリチコナゾール、ウニコナゾール、ウニコナゾールＰ）；銅殺真菌剤（アシペタックス－銅、ボルドー液（Ｂｏｒｄｅａｕｘ ｍｉｘｔｕｒｅ）、バーガンディー液（Ｂｕｒｇｕｎｄｙ
ｍｉｘｔｕｒｅ）、チェスハント液（Ｃｈｅｓｈｕｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）、酢酸銅、炭酸銅、塩基性、水酸化銅、ナフテン酸銅、オレイン酸銅、オキシ塩化銅（ｃｏｐｐｅｒ
ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ケイ酸銅、硫酸銅、硫酸銅、塩基性、クロム酸銅亜鉛（ｃｏｐｐｅｒ ｚｉｎｃ ｃｈｒｏｍａｔｅ）、クフラネブ、クプロバム、酸化銅（Ｉ）、マンカッパー、オキシン銅、サイセントン（ｓａｉｓｅｎｔｏｎｇ）、チオジアゾール銅（ｔｈｉｏｄｉａｚｏｌｅ－ｃｏｐｐｅｒ））；シアノアクリレート殺真菌剤（ベンザマクリル、フェナマクリル（ｐｈｅｎａｍａｃｒｉｌ））；ジカルボキシイミド殺真菌剤（ファモキサドン、フルオロイミド）；ジクロロフェニルジカルボキシイミド殺真菌剤（クロゾリネート、ジクロゾリン、イプロジオン、イソバレジオン、ミクロゾリン、プロシミドン、ビンクロゾリン）；フタルイミド殺真菌剤（カプタホール、キャプタン、ジタリムホス、ホルペット、チオクロルフェンヒム）；ジニトロフェノール殺真菌剤（ビナパクリル、ジノブトン、ジノカップ、ジノカップ－４、ジノカップ－６、メプチルジノカップ、ジノクトン、ジノペントン、ジノスルホン、ジノテルボン、ＤＮＯＣ）；ジチオカルバメート殺真菌剤（アモバム、アソメート、アジチラム、カルバモルフ、クフラネブ、クプロバム、ジスルフィラム、フェルバム、メタム、ナバム、テコラム、チウラム、ウルバシド（ｕｒｂａｃｉｄｅ）、ジラム）；環式ジチオカルバメート殺真菌剤（ダゾメット、エテム、ミルネブ）；ポリマージチオカルバメート殺真菌剤（マンカッパー、マンコゼブ、マネブ、メチラム、ポリカルバメート、プロピネブ、ジネブ）；ジチオラン殺真菌剤（イソプロチオラン、サイジュンマオ（ｓａｉｊｕｎｍａｏ））；燻蒸用殺真菌剤（二硫化炭素、シアン、ジチオエーテル、臭化メチル、ヨウ化メチル、テトラチオ炭酸ナトリウム）；ヒドラジド殺真菌剤（ベンキノックス、サイジュンマオ（ｓａｉｊｕｎｍａｏ））；イミダゾール殺真菌剤（シアゾファミド、フェナミドン、フェナパニル、グリオジン、イプロジオン、イソバレジオン、ペフラゾエート、トリアゾキシド）；コナゾール殺真菌剤（イミダゾール）（クリンバゾール、クロトリマゾール、イマザリル、オキスポコナゾール、プロクロラズ、トリフルミゾール）；無機性殺真菌剤（アジ化カリウム、チオシアン酸カリウム、アジ化ナトリウム、硫黄、銅殺真菌剤もまた参照のこと、無機水銀殺真菌剤もまた参照のこと）；水銀殺真菌剤；無機水銀殺真菌剤（塩化水銀（ＩＩ）、酸化水銀（ＩＩ）、塩化水銀（Ｉ））；有機水銀殺真菌剤（臭化（３－エトキシプロピル）水銀（ＩＩ）、酢酸エチル水銀（ＩＩ）、臭化エチル水銀（ＩＩ）、塩化エチル水銀（ＩＩ）、エチル水銀２，３－ジヒドロキシプロピルメルカプチド（ｅｔｈｙｌｍｅｒｃｕｒｙ ２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｍｅｒｃａｐｔｉｄｅ）、エチル水銀ホスフェート、Ｎ－（エチル水銀）－ｐ－トルエンスルホンアニリド、ヒドラルガフェン、塩化２－メトキシエチル水銀、安息香酸メチル水銀、メチル水銀ジシアンジアミド、メチル水銀ペンタクロロフェノキシド、８－フェニル水銀オキシキノリン（８－ｐｈｅｎｙｌｍｅｒｃｕｒｉｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、フェニル水銀ウレア（ｐｈｅｎｙｌｍｅｒｃｕｒｉｕｒｅａ）、酢酸フェニル水銀、塩化フェニル水銀、ピロカテコールのフェニル水銀誘導体、硝酸フェニル水銀、サリチル酸フェニル水銀、チメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）、トリル水銀アセテート）；モルホリン殺真菌剤（アルジモルフ、ベンザモルフ、カルバモルフ、ジメトモルフ、ドデモルフ、フェンプロピモルフ、フルモルフ、トリデモルフ）；有機リン殺真菌剤（アンプロピルホス、ジタリムホス、ＥＢＰ、エジフェンホス、ホセチル、ヘキシルチオホス、イネジン、イプロベンホス、イゾパムホス（ｉｚｏｐａｍｆｏｓ）、ケジュンリン（ｋｅｊｕｎｌｉｎ）、ホスダイフェン、ピラゾホス、トルクロホスメチル、トリアミホス）；有機スズ殺真菌剤（デカフェンチン、フェンチン、酸化トリブチルスズ）；オキサチイン（ｏｘａｔｈｉｉｎ）殺真菌剤（カルボキシン、オキシカルボキシン）；オキサゾール殺真菌剤（クロゾリネート、ジクロゾリン、ドラゾキソロン、ファモキサドン、ヒメキサゾール、メタゾキソロン、ミクロゾリン、オキサジキシル、オキサチアピプロリン、ピリソキサゾール、ビンクロゾリン）；ポリスルフィド殺真菌剤（多硫化バリウム（ｂａｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅ）、多硫化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅ）、多硫化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅ）、多硫化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅ））；ピラゾール殺真菌剤（ベンゾビンジフルピル、ビキサフェン、フェンピラザミン、フルキサピロキサド、フラメトピル、イソピラザム、オキサチアピプロリン、ペンフルフェン、ペンチオピラド、ピラクロストロビン、ピラメトストロビン、ピラオキシストロビン、ラベンザゾール、セダキサン）；ピリジン殺真菌剤（ボスカリド、ブチオベート、ジピリチオン、フルアジナム、フルオピコリド、フルオピラム、パリノール、ピカルブトラゾクス、ピリベンカルブ、ピリジニトリル、ピリフェノックス、ピリソキサゾール、ピロキシクロル、ピロキシフル、トリクロピリカルブ）；ピリミジン殺真菌剤（ブピリメート、ジフルメトリム、ジメチリモール、エチリモール、フェナリモール、フェリムゾン、ヌアリモール、トリアリモール）；アニリノピリミジン殺真菌剤（シプロジニル、メパニピリム、ピリメタニル）；ピロール殺真菌剤（ジメタクロン（ｄｉｍｅｔａｃｈｌｏｎｅ）、フェンピクロニル、フルジオキソニル、フルオロイミド）；四級アンモニウム殺真菌剤（ベルベリン、サンギナリン）；キノリン殺真菌剤（エトキシキン、ハラクリネート、８－ヒドロキシキノリンスルフェート、キナセトール、キノキシフェン、テブフロキン）；キノン殺真菌剤（クロラニル、ジクロン、ジチアノン）；キノキサリン殺真菌剤（キノメチオネート、クロルキノックス、チオキノックス）；チアジアゾール殺真菌剤（エトリジアゾール、サイセントン（ｓａｉｓｅｎｔｏｎｇ）、チアジアゾール銅（ｔｈｉｏｄｉａｚｏｌｅ－ｃｏ


ｐｐｅｒ）、亜鉛チアゾール（ｚｉｎｃ ｔｈｉａｚｏｌｅ））；チアゾール殺真菌剤（エタボキサム、イソチアニル、メトスルホバックス、オクチリノン、オキサチアピプロリン、チアベンダゾール、チフルザミド）；チアゾリジン殺真菌剤（フルチアニル、チアジフルオール）；チオカルバメート殺真菌剤（メタスルホカルブ、プロチオカルブ）；チオフェン殺真菌剤（エタボキサム、イソフェタミド、シルチオファム）；トリアジン殺真菌剤（アニラジン）；トリアゾール殺真菌剤（アミスルブロム、ビテルタノール、フルオトリマゾール、トリアズブチル）；コナゾール殺真菌剤（トリアゾール）（アザコナゾール、ブロムコナゾール、シプロコナゾール、ジクロブトラゾール、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、ジニコナゾールＭ、エポキシコナゾール、エタコナゾール、フェンブコナゾール、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルトリアホール、フルコナゾール、フルコナゾール・シス、ヘキサコナゾール、フアンジュンズオ（ｈｕａｎｊｕｎｚｕｏ）、イミベンコナゾール、イプコナゾール、メトコナゾール、ミクロブタニル、ペンコナゾール、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、キンコナゾール、シメコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール、トリアジメホン、トリアジメノール、トリチコナゾール、ウニコナゾール、ウニコナゾールＰ）；トリアゾロピリミジン殺真菌剤（アメトクトラジン）；ウレア殺真菌剤（ベンタルロン、ペンシクロン、キナザミド）；亜鉛殺真菌剤（アシペタックス亜鉛、クロム酸銅亜鉛、クフラネブ、マンコゼブ、メチラム、ポリカルバメート、ポリオキソリム－亜鉛、プロピネブ、ナフテン酸亜鉛、亜鉛チアゾール（ｚｉｎｃ
ｔｈｉａｚｏｌｅ）、亜鉛トリクロロフェノキシド（ｚｉｎｃ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｉｄｅ）、ジネブ、ジラム）；未分類殺真菌剤（アシベンゾラル、アシペタックス、アリルアルコール、塩化ベンザルコニウム、ベトキサジン、ブロモタロニル（ｂｒｏｍｏｔｈａｌｏｎｉｌ）、キトサン、クロロピクリン、ＤＢＣＰ、デヒドロ酢酸、ジクロメジン、ジエチルピロカーボネート、エチリシン（ｅｔｈｙｌｉｃｉｎ）、フェナミノスルフ、フェニトロパン、フェンプロピジン、ホルムアルデヒド、フルフラール、ヘキサクロロブタジエン、メチルイソチオシアネート、ニトロスチレン、ニトロタル－イソプロピル、ＯＣＨ、ペンタクロロフェニルラウレート、２－フェニルフェノール、フタリド、ピペラリン、プロパミジン、プロキナジド、ピロキロン、ナトリウムオルトフェニルフェノキシド、スピロキサミン、スルトロペン、チシオフェン、トリシクラゾール）またはメフェノキサム。
示されるように、除草剤、殺真菌剤、農薬、もしくは他の農作物保護化学物質に対する抵抗性を有する組換え生物防除因子は、遺伝子操作技術を通じて作製され得、このように操作されたかもしくは組換えの生物防除因子は、生物防除因子の改変された集団を生産するために増殖させられ得る。組換え生物防除因子は、ポリヌクレオチドを、形質転換によって生物防除宿主細胞の中に導入することによって、生産される。微生物を形質転換するための方法は公知であり、当該分野で利用可能である。一般には、Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ． （１９８３） Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄｓ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６， ５５７－７７； Ｓｅｉｄｍａｎ， Ｃ．Ｅ． （１９９４） Ｉｎ：
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１－３９７； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１０． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８５：７７５－７７８を参照のこと。形質転換は、実験室において、コンピテント細胞によるそれらの環境からの裸のＤＮＡの天然の取り込みによって起こり得る。あるいは、細胞は、冷たい条件下での二価カチオンへの曝露によって、エレクトロポレーションによって、ポリエチレングリコールへの曝露によって、線維性ナノ粒子での処理、または当該分野で周知の他の方法によって、コンピテントにされ得る。
組換え生物防除因子を形質転換するにあたって使用するための除草剤抵抗性遺伝子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フモニシン解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号）；除草剤抵抗性（特に、スルホニルウレアタイプの除草剤）をもたらすアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）変異体（例えば、Ｓ４および／もしくはＨｒａ変異）；グルタミンシンターゼのインヒビター（例えば、ホスフィノスリシンもしくはバスタ（例えば、ｂａｒ遺伝子））；ならびにグリホサート抵抗性（ＥＰＳＰＳ遺伝子））；ならびにＨＰＰＤ抵抗性（ＷＯ９６／３８５７６、米国特許第６，７５８，０４４号；同第７，２５０，５６１号；同第７，９３５，８６９号；および同第８，１２４，８４６号）、または当該分野で公知の他のこのような遺伝子。それらの開示は、本明細書で参考として援用される。ｂａｒ遺伝子は、除草剤バスタに対する抵抗性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は、抗生物質カナマイシンおよびジェネティシンに対する抵抗性をコードし、ＡＬＳ遺伝子変異体は、スルホニルウレア除草剤（クロルスルフロン、メトスルフロン、スルホメツロン、ニコスルフロン、リムスルフロン、フラザスルフロン、スルホスルフロン、およびトリアスルフロンが挙げられる）ならびにイミダゾリノン（ｉｍａｄｉｚｏｌｉｎｏｎｅ）除草剤（イマゼタピル、イマザキン、イマザピル、およびイマザメタベンズが挙げられる）に対する抵抗性をコードする。
本発明の生物学的防除因子の改変された集団は、水和剤、粉末（ｄｕｓｔ）、顆粒、水性もしくは油ベースの液体製品などとして製剤化され得る。このような製剤は、キャリアおよび他の因子に加えて、改変された生物学的防除因子を含む。上記製剤は、生物防除、種子コーティングなどのための圃場接種物として使用され得る。すなわち、上記改変された生物防除集団は、当該分野で公知の任意の様式で、改変された因子の有効量で種子をコーティングすること、土壌への直接的な改変された生物防除集団の畝間適用において、葉面適用において、鉢上げ用混合物への混合、および収穫後の病気防除においてを含めて、使用され得る。このような方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，３４８，７４２号において、および欧州出願公開ＥＰ０４７２４９４ Ａ２において（これらはともに、本明細書に参考として援用される）記載されている。生物防除としては、定住性の生物集団の管理および病気を低減するための特定の生物の導入が挙げられる。
本明細書で提供される生物防除因子は、その活性もしくは上記生物防除因子が添加された化合物の活性を増強するために、殺真菌剤、殺虫剤、もしくは除草剤と混合され得る。いくつかの場合には、生物防除因子および化学物質の組み合わせは、相乗作用的活性を示し得、ここで、上記２種の混合物はそれらの単純な相加効果から予測されるものを超える。
本発明の改変された生物学的防除因子は、病気を顕著に低減し、植物生長および収量を増進し、そして旧来の農薬に頼ることを低減するために使用され得る。本発明の改変された因子は、有効な統合された有害生物管理プログラムのために他の農薬とともに使用され得る。一実施形態において、上記改変された生物防除集団は、ＷＯ９４／１０８４５（本明細書に参考として援用される）に記載される様式において、公知の農薬とともに製剤中に混合され得る。
改変された生物防除集団は、有効量で適用される。改変された生物防除集団の有効量は、病原体を防除もしくは阻害するために十分な量である。他の実施形態において、改変された生物防除因子の有効量は、ある圃場適用割合の殺生物剤の存在下で、植物の健康状態、生長もしくは収量を増進するもしくは増大させるために十分な量である。改変された生物防除因子および／もしくは殺生物剤の適用割合は、標的となっている病原体、保護されるべき農作物、改変された生物防除集団の効力、病気の重篤度、気候条件などに従って変動し得る。圃場接種に関しては一般に、改変された生物防除因子適用の割合は、１０１２～１０１６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタールである。（これは、ａ．ｉ．が１０００億ＣＦＵ／ｇである場合に、約１０ｇ～１０ｋｇの活性成分／ヘクタールに相当する。）。他の実施形態において、圃場接種に関して、改変された生物防除因子適用の割合は、３×１０１５～１×１０１７コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタールである。（これは、ａ．ｉ．が１０００億ＣＦＵ／ｇである場合に、約３０ｋｇ～１０００ｋｇの活性成分／ヘクタールに相当する。）。他の実施形態において、圃場接種に関して、改変された生物防除因子適用の割合は、３×１０１５～１×１０１７コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタール；約１×１０１２～約１×１０１３コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタール、約１×１０１３～約１×１０１４コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタール、約１×１０１４～約１×１０１５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタール、約１×１０１５～約１×１０１６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタールもしくは約１×１０１６～約１×１０１７コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタールである。他の実施形態において、圃場接種に関して、改変された生物防除因子適用の割合は、少なくとも約１×１０１３、約１×１０１４、１×１０１５、約１×１０１６もしくは約１×１０１７のコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタールである。さらに他の実施形態において、改変された生物防除因子適用の割合は、ａ．ｉ．が１０００億ＣＦＵ／ｇである場合、１０ｇ～５０ｋｇ、５０ｋｇ～１００ｋｇ、１００ｋｇ～２００ｋｇ、２００ｋｇ～３００ｋｇ、３００ｋｇ～４００ｋｇ、４００ｋｇ～５００ｋｇ、５００ｋｇ～６００ｋｇ、６００ｋｇ～７００ｋｇ、７００ｋｇ～８００ｋｇ、８００ｋｇ～９００ｋｇ、９００ｋｇ～１０００ｋｇの活性成分／ヘクタールである。さらに他の実施形態において、改変された生物防除因子適用の割合は、ａ．ｉ．が１０００億ＣＦＵ／ｇである場合、少なくとも１０ｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、２００ｋｇ、３００ｋｇ、４００ｋｇ、５００ｋｇ、６００ｋｇ、７００ｋｇ、８００ｋｇ、９００ｋｇ、１０００ｋｇの活性成分／ヘクタールである。具体的実施形態において、適用される改変された生物防除因子は、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株および／もしくはＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０９９９として受託された株ＡＩＰ０５０９９９を含む。
任意の適切な農業適用割合の殺生物剤が、農作物に適用され得、例えば、所定の生物（すなわち、目的の有害生物（例えば、真菌、昆虫、雑草、病気など）を防除する殺生物剤の有効量が適用され得る。改変された生物防除因子の有効量についてアッセイするための方法は、例えば、同じ濃度の改変されていない生物防除因子が殺生物剤の有効量と組み合わせて適用される場合に起こる植物の健康状態、収量および／もしくは生長と比較したときに、生物防除因子の有効量および圃場適用割合の殺生物剤の適用の際に起こる植物の健康状態、収量および／もしくは生長における任意の統計的に有意な増大を含む。
従って、本発明のさらなる実施形態は、本発明の改変された生物学的防除因子の集団を、植物病原体が増殖し得る環境へと適用することによって、植物病原体の増殖を防除もしくは阻害するための方法を提供する。上記適用は、植物に対するもの、植物の一部に対するものへ、保護されるべき植物の種子に対するもの、または保護されるべき植物が生長しつつあるかもしくは将来的に生長する土壌に対するものであり得る。植物もしくは植物の部分への適用は、収穫前もしくは収穫後であり得る。種子への適用は、種子を種蒔きする前である。
他の実施形態において、農作物、栽培地、種子および／もしくは雑草は、改変された防除因子の有効量および殺生物剤の有効量の組み合わせで処理され得る。農作物、栽培地もしくは圃場に対して改変された生物防除因子および殺生物剤「の組み合わせで処理される」、または「の組み合わせを適用する」とは、特定の圃場、植物農作物、種子および／もしくは雑草のうちの１またはより多くが、望ましい効果が達成されるように改変された生物防除因子のうちの１またはより多く、および１またはより多くの殺生物剤で処理されることを意図する。さらに、改変された生物防除因子および殺生物剤のうちの一方もしくは両方の適用は、農作物を植える前に（例えば、土壌、記種子、もしくは植物に対して）起こり得る。さらに、改変された生物防除因子および殺生物剤の適用は同時であってもよいし、上記適用は、望ましい効果が達成される限りにおいて、異なる時間（逐次的）であってもよい。
１つの非限定的実施形態において、改変された生物防除因子は、グリホサートに対して抵抗性であり、有効量で適用される場合に、植物の健康状態、収量もしくは生長をさらに増大させ、かつ殺生物剤は、グリホサートもしくはその活性誘導体を含む。このような方法において、種子、植物もしくは栽培地は、グリホサートに抵抗性である改変された生物防除因子の有効量およびグリホサートの有効量の組み合わせで処理され、ここでグリホサートの有効量は、雑草を選択的に防除する一方で、農作物が顕著に損傷を受けないようなものである。このような実施形態において、改変された生物防除因子の有効量は、同じ濃度の改変されていない生物防除因子がグリホサートもしくはその活性誘導体の有効量と組み合わせて適用される場合に起こる植物の健康状態、収量および／もしくは生長と比較したときに、上記植物の健康状態、収量および／もしくは生長において統計的に有意な増大を生じるために十分である。さらなる実施形態において、生物防除因子は、ＡＩＰ１６２０の有効量を含む。
もう一つの非限定的実施形態において、改変された生物防除因子は、グルホシネートに対して抵抗性であり、有効量で適用される場合に植物の健康状態、収量もしくは生長をさらに増大させ、そして殺生物剤は、グルホシネートもしくはその活性誘導体を含む。このような方法において、種子、植物もしくは栽培地は、グルホシネートに対して抵抗性である改変された生物防除因子の有効量およびグルホシネートの有効量の組み合わせで処理され、ここでグルホシネートの有効量は、雑草を選択的に防除する一方で、農作物が顕著に損害を受けないようなものである。このような実施形態において、改変された生物防除因子の有効量は、同じ濃度の改変されていない生物防除因子が上記グルホシネートもしくはその活性誘導体の有効量と組み合わせて適用される場合に起こる植物の健康状態、収量および／もしくは生長と比較したときに、上記植物の健康状態、収量および／もしくは生長において統計的に有意な増大を生じるために十分である。さらなる実施形態において、生物防除因子は、ＡＩＰ０５０９９９の有効量を含む。
本明細書で使用される場合、用語である植物は、植物細胞、植物プロトプラスト、その植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊（ｐｌａｎｔ ｃｌｕｍｐｓ）、および植物もしくは植物の一部において無傷である植物細胞（例えば、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯など）を含む。穎果（ｇｒａｉｎ）は、種を生長させるもしくは生殖させる以外の目的で、商業栽培者によって生産される成熟種子を意味することが意図される。再生された植物の子孫、改変体、および変異体はまた、本発明の範囲内に含まれるが、ただしこれらの部分、導入されたポリヌクレオチドを含む。
改変された生物防除因子は、任意の植物種（単子葉植物および双子葉植物が挙げられるが、これらに限定されない）とともに使用され得る。目的の植物種の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に、種子油の供給源として有用なそれらＢｒａｓｓｉｃａ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、雑穀（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類の木（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、エンバク、オオムギ、野菜、観賞植物、および球果植物。
野菜としては、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓｐｐ．）、およびＣｕｃｕｍｉｓ属のメンバー、例えば、キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）が挙げられる。観賞植物としては、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（ｈｉｂｉｓｃｕｓ）（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキクが挙げられる。
本発明を実施するにあたって使用され得る球果植物としては、以下が挙げられる：例えば、マツ（例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールパイン（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ））；ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；シトカスプルース（Ｐｉｃｅａ
ｇｌａｕｃａ）；セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；モミ（ｔｒｕｅ ｆｉｒｓ）（例えば、ヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））；ならびにシダー（例えば、ベイスギ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカイエローシダー（Ａｌａｓｋａ ｙｅｌｌｏｗ－ｃｅｄａｒ）（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）。具体的実施形態において、本発明の植物は、農作物植物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、ソルガム、コムギ、雑穀、タバコなど）である。他の実施形態において、トウモロコシもしくはダイズ植物が使用される。
以下の実施例は、例証のために提供されるのであって、限定のために提供されるのではない。
（実験）
実施例１：ＡＩＰ００６９のグリホサート抵抗性変異体の生産。
導入
生物学的因子は、リスクを軽減しかつ収量を改善するために農業において現在使用されつつある。これら生物学的因子の１つの重要な属性は、上記生物学的因子が、商業的農業実務においてまた適用され得る化学物質と適合性でなければならないことである。グリホサートは、全世界の除草剤市場のうちの約２５％を占め、かつ１年あたり約２億ポンドの割合で適用される化学的除草剤である。この除草剤は、植物および多くの細菌において芳香族アミノ酸生合成の中の１工程を触媒する酵素である５－エノールピルビルシキメート－３－ホスフェート（ＥＰＳＰ）シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。従って、グリホサートは、ＥＰＳＰＳに依存する任意の生物防除因子を含む生物の生存性を低減し、植物微生物群衆を変化させることが報告されている。この報告は、グリホサート寛容性を、いくつかの重量な真菌植物病原体（農業上重要な「苗立ち枯れ」病複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の原因因子であるＰｙｔｈｉｕｍおよびＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａを含む）の生物学的防除において使用されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株に成功裡に導入したことを記載する。この生物防除因子の化学的適合性を改善することに加えて、グリホサート抵抗性の導入は、商業生産においてさらなる利点を提供する。
ここで提供されるグリホサートの例に加えて、他の農業用化学物質が、望ましい生物学的防除もしくは植物生長を増進する細菌の増殖を阻害し得る。例としては、除草剤グルホシネート（グルタミンシンターゼインヒビター）、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン除草剤（分枝鎖アミノ酸合成インヒビター）ならびに抗生物質ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリンおよびカスガマイシンが挙げられる。
材料および方法および結果
生物学的防除株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＡＩＰ００６９を、０ｍＭもしくは５ｍＭ グリホサートを含む寒天プレート上に画線培養した。基礎培地は、脱イオン水１Ｌあたり、１１．３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、３ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ グルタミン酸一ナトリウム、３１ｇ 糖蜜、４９３ｍｇ
ＭｇＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ ＺｎＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、および０．３ｇ チアミンからなった。グリホサートの非存在下では、２５℃で一晩インキュベートした後に多くの細菌コロニーが見えた。５ｍＭ グリホサートの存在下では、同様のインキュベーション後にコロニーは全く見えなかったが、数日間の延長したインキュベーション後には、少数のコロニーが見えた。これらコロニーを単離し、複数のグリホサート濃度の液体培地中で増殖させた。１つの単離物（ＧｌｙｐｈＲ１と名付けた）は、親のＡＩＰ００６９株より１０倍高くグリホサートに対して抵抗性であった（図１）。この改善された株は、グリホサートが土壌および農作物に存在する農業システムにおいて、ＡＩＰ００６９もしくは類似のグリホサート感受性株より競合的であり、従って生物防除としてより有効であると予測される。また、グリホサートは、他の細菌による汚染を防止するために、この株の生産、製剤化および／もしくは貯蔵の間に選択的因子として使用され得る。
実施例２： グリホサート抵抗性変異体の生物学的防除活性
細菌を、脱イオン水１Ｌあたり、１１．３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、３ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ グルタミン酸一ナトリウム、３０ｇ 糖蜜、４９３ｍｇ ＭｇＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ ＺｎＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、および５ｍｇ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏからなるブロス培地のうちの５０ｍｌへと接種した。培養物を、２８℃、２５０ｒｐｍで２日間、振盪インキュベーターにおいて２５０ｍｌ 三角フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ）の中で増殖させた。細胞を、３５００×ｇで１０分間の遠心分離によって集めた。培養上清を廃棄し、細胞を、元の培養物の体積になるように滅菌脱イオン水に再懸濁した。ＡＩＰ０３２３（抗真菌活性を有しないＡＩＰ００６９の変異体）を、陰性対照として含めた。
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ感染したコメ穎果を、以前に記載されるように生産した（Ｋ．Ａ． Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｂｅｎｓｏｎ， １９９４．
Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ａｓ ａ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｏｎ Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ７８：１９３－１９９）。感染したコメを、ブレンダー中で砕き、＃１０シーブ（２ｍｍ開口）を通してふるいにかけた。砕いた穎果を、２ｇ／Ｌの割合で発芽培地と混合した。
ホウセンカの種子を、サイズ４０２プラグトレイにおいて感染発芽培地へと蒔き、１プラグあたり０．３ｍｌの再懸濁細菌で処理し、標準的温室生産条件下で生長させた。１反復（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）あたり２０プラグを用いて、各実験処理につき２回反復を行った。健康な実生の数を、２週間後に評価した。以下の表１中のデータは、グリホサート抵抗性改変体ＡＩＰ０４０４およびＡＩＰ１６２０が、先祖株ＡＩＰ００６９と比較して完全な抗真菌活性を保持することを示す。
Figure 0007299204000001
生物防除株は、赤カビ病（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅａｄ ｂｌｉｇｈｔ）、アジアダイズサビ病（Ａｓｉａｎ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｒｕｓｔ）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、芝生の病気などを防除するために使用され得る。
実施例３：
グリホサート寛容性ＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子は、種々の細菌から得られ得る（Ａ． Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ， １９８５． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２８：２９７－３０１）。特に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＣＰ４由来のＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｇ．Ｆ． Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ， １９９２． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｐａｒｔｉｎｇ ｇｌｕｐｈｏｓａｔｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ． ｐ． １３９－１４５． Ｉｎ Ｂ．Ｋ． Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ． （ｅ．） Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｃ．Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ， ２０１０， ＧＲＧ２３
ａｎｄ ＧＲＧ５１ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．米国特許第７，６７４，９５８号）は、非常に抵抗性である。
適切な遺伝子を、ＰＣＲによって増幅するか、または当該分野で周知の技術を使用して人工的に作製する。そのオープンリーディングフレームを、プラスミドベクターｐＫＫ２２３－３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へとｔａｃＩプロモーターとｒｒｎＢ転写ターミネーターとの間にクローニングする。ｔａｃＩプロモーターは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓにおいて遺伝子の強力な恒常的な発現を提供する。株ＡＩＰ００６９由来のゲノムＤＮＡ配列をプロモーター－遺伝子－ターミネーターカセットの各側に組み込んで、ＡＩＰ００６９染色体への相同組換えを指向する。
得られるプラスミドを、Ｅ． ｃｏｌｉからＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＡＩＰ００６９へと、当該分野で周知の技術であるコンジュゲーションおよび１００ｍＭ グリホサートを含む規定された培地上での選択によって移動させる。上記プラスミドは、狭い宿主範囲のｃｏｌＥ１複製起点を含み、従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓでは複製できない。グリホサート抵抗性コロニーは、プロモーター－遺伝子－ターミネーターカセットが相同組換えによってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ染色体の中に組み込まれる場合に得られる。単一の交差事象（ここではプラスミド全体が染色体に組み込まれる）は、二重交差事象（ここでは所望のプロモーター－遺伝子－ターミネーターカセットのみが組み込まれる）から、ＰＣＲ、サザンブロッティング、もしくは当該分野で周知の他の技術によって区別される。二重交差事象が、使用のために選択される。
実施例４．
ＡＩＰ１６２０スターター培養物を、Ｌｕｒｉａ寒天プレートからのコロニーを使用して接種し、０．１×ＮＢＹブロス（脱イオン水１Ｌあたり、０．８ｇのＤｉｆｃｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ粉末および０．５ｇの酵母抽出物粉末）中で増殖させ、２８℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。生産培養物を、脱イオン水１Ｌあたり：１１．３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、３．０ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ グルタミン酸一ナトリウム、３．０ｇ 糖蜜、０．４９ｇ ＭｇＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ
ＺｎＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２ＯおよびｐＨを約６．２に調節するために十分な塩酸を含むブロス中で増殖させた。５０ｍｌの生産ブロスを、２５０ｍｌ
三角培養フラスコ中に入れ、０．５ｍｌのスターター培養物を接種し、２８℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。生産培養物は、種々の時点で接種し、次いで、同時に採取して、インキュベーション時間１５時間、２４時間、３３時間、および４３時間での培養物を得た。各培養物のうちの４０ｍｌを、遠心分離によって採取した。使用済の培養ブロスを廃棄し、細胞を、４０ｍｌの最終体積になるようにオートクレーブにかけた脱イオン水中に再懸濁した。
真菌接種物を、Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｂｅｎｓｏｎ（Ｋ．Ａ． Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｂｅｎｓｏｎ， １９９４． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｏｎ
Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ， ７８：１９３－１９９．）によって記載されるコメ穎果法を使用して調製した。感染したコメ穎果を、ブレンダー中で砕き、＃１０シーブを通してふるいにかけた。この接種物を、Ｆａｆａｒｄスーパーファイン発芽ミックスに、１．０ｇ／Ｌの割合で混合した。
上記接種した発芽ミックスを、３９２温室プラグトレイ（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｋｒｏｎ， ＯＨ）の中に入れ、１個のホウセンカ種子を各セルに蒔いた。ＡＩＰ１６２０細胞懸濁物を、０．３ｍｌ／セルの割合で適用した。上記種子を、標準的温室条件下で発芽させた。１反復あたり２０セルを用いて各処理につき３回反復で行った。１０～１４日後、各処理における健康な実生の数を計数することによって、上記アッセイをスコア付けした。結果を、以下の表２にまとめる。
Figure 0007299204000002
実施例５．
１０ヶ月の期間にわたって、ＡＩＰ１６２０細胞の複数の温室試験を行った。各試験に関して、ＡＩＰ１６２０培養物を、培養時間約２４時間を使用して、本質的に実施例４に記載されているとおり、増殖させ、採取し、オートクレーブにかけた脱イオン水中に再懸濁した。上記温室発芽試験もまた、実施例４に記載されるとおりに行ったが、Ｒ．ｓｏｌａｎｉ接種物割合を、試験に依存して、発芽ミックス１Ｌあたり、０．２５ｇ～１．０ｇの砕いたコメ穎果で変化させた。１７試験から編集した結果を、以下の表３に示し、これは苗立ち枯れ病を防除するにあたってのＡＩＰ１６２０の一貫した性能を示している。
Figure 0007299204000003
実施例６．
５０ｇのＡＩＰ１６２０細胞ペーストを、水分活性０．３未満へと乾燥させた５０ｇのＭｉｎ－Ｕ－Ｇｅｌ ４００もしくはＭｉｎ－Ｕ－Ｇｅｌ ２００アタパルジャイトクレイ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＬＬＣ， Ｓｐａｒｋｓ， ＭＤ）と混合した。各製剤の一部を４℃で貯蔵し、別の一部を２２℃で貯蔵した。これら製剤の生存性を、希釈プレート法（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｐｌａｔｉｎｇ）によって種々の時点で試験し、その結果を、以下の表４に示す。貯蔵して２１日後に、４℃で貯蔵していたサンプルを温室種子発芽アッセイで試験したところ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉに対する抗真菌活性を保持していたことが見出された。
Figure 0007299204000004
実施例７．
１００ｇのＡＩＰ１６２０細胞ペーストを、フードプロセッサーを使用して２０ｇの合成ケイ酸カルシウム（ＭｉｃｒｏＣｅｌ Ｅ， Ｉｍｅｒｙｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｉｎｅｒａｌｓ， Ｌｏｍｐｏｃ， ＣＡ）と混合した。得られた材料は、希釈プレート法によって決定した場合、２．７×１０１０コロニー形成単位／ｇ（ＣＦＵ／ｇ）のＡＩＰ１６２０を含んだ。この材料を０．３０未満の水分活性になるように４０℃で乾燥させた。その時点では、上記材料は、１．４×１０９ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。乾燥させた粉末製剤を、真空密封マイラーパウチ（ｍｙｌａｒ ｐｏｕｃｈ）の中で２２℃で貯蔵した。８５日後、上記粉末は、１．１×１０６ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含み、温室種子発芽アッセイによって決定した場合、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉに対する抗真菌活性を保持していた。
実施例８．
１００ｇのＡＩＰ１６２０細胞ペーストを、フードプロセッサーを使用して５ｇのグリセロールおよび２０ｇの合成ケイ酸カルシウムと混合した。得られた材料は、希釈プレート法によって決定した場合、５．７×１０１１ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。この材料を、水分活性０．３０未満になるように４０℃で乾燥させた。その時点では、上記材料は、３．１×１０９ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。乾燥させた粉末製剤を、真空密封マイラーパウチの中で２２℃で貯蔵した。６１日後、上記粉末は、６．２×１０８ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含み、温室種子発芽アッセイによって決定した場合、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉに対する抗真菌活性を保持していた。
実施例９．
１００ｇのＡＩＰ１６２０細胞ペーストを、フードプロセッサーを使用して５ｇのトレハロースおよび２０ｇの合成ケイ酸カルシウムと混合した。得られた材料は、希釈プレート法によって決定した場合、５．７×１０１１ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。この材料を、水分活性０．３０未満になるように４０℃で乾燥させた。この時点では、上記材料は、４．０×１０８ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。乾燥させた粉末製剤を、真空密封マイラーパウチの中で２２℃で貯蔵した。５４日後、上記粉末は、２．７×１０７ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。
実施例１０．
４ｇのキサンタンガムを、４ｇのダイズ油の中に分散させた。得られた混合物を、１００ｇのＡＩＰ１６２０細胞ペーストと合わせ、約５分間、室温で濃縮した。濃縮混合物を、フードプロセッサーを使用して２０ｇの合成ケイ酸カルシウムの中にブレンドした。得られた材料は、９．４×１０１１ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでおり、これを２つの５０ｇ部分へと分けた。一方の部分を、水分活性＜０．３０となるように４０℃で乾燥させた。この時点で、上記部分は、７．０×１０８ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。
他方の部分を、水分活性＜０．１０になるようにシリカゲルで室温において乾燥させた。この時点で、上記部分は、１．１８×１０１０ ＣＦＵ／ｇのＡＩＰ１６２０を含んでいた。
実施例１１．
５種の異なる製剤を、以下の表５に示される賦形剤および割合を使用して、本質的に上記実施例４に記載されるとおりに調製した。これら製剤を、水分活性０．３０未満になるように４０℃で乾燥させ、４℃で貯蔵した。
真菌接種物を、Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｂｅｎｓｏｎ （Ｋ．Ａ． Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｂｅｎｓｏｎ， １９９４． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｆｏｒ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｏｎ Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ， ７８：１９３－１９９．）によって記載されるコメ穎果法を使用して調製した。感染させたコメ穎果を、ブレンダーの中で砕き、＃１０シーブを通してふるいにかけた。この接種物を、Ｆａｆａｒｄスーパーファイン発芽ミックスに０．２５ｇ／Ｌの割合で混合した。
上記接種したミックスを分け、製剤化したＡＩＰ１６２０を、５ｇ／Ｌの割合で添加した。ホウセンカ種子を、接種しかつ処理したミックスの中に蒔いた。上記種子を、標準的温室条件下で発芽させた。１０日後に、各処理における健康な実生の数を計数することによって、上記アッセイをスコア付けした。結果を、以下の表６にまとめる。
Figure 0007299204000005
Figure 0007299204000006
実施例１２．
数種の製剤を、種々の時点で、上記実施例４～８に記載されるとおりに調製した。異なる製剤の組成を、以下の表７に示す。水分活性０．３０またはそれ未満になるまで乾燥させた後、製剤化した材料を、マイラーパウチの中へ入れて真空密封し、２２℃で貯蔵した。
真菌接種物を、Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｂｅｎｓｏｎ（Ｋ．Ａ． Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｂｅｎｓｏｎ， １９９４． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｏｎ
Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ， ７８：１９３－１９９．）によって記載される上記コメ穎果法を使用して調製した。感染させたコメ穎果を、ブレンダーの中で砕き、＃１０シーブを通してふるいにかけた。この接種物を、Ｆａｆａｒｄスーパーファイン発芽ミックスの中に０．２５ｇ／Ｌの割合で混合した。
上記接種したミックスを分け、製剤化したＡＩＰ１６２０を、５ｇ／Ｌの割合で添加した。同日に、各製剤の部分サンプルを希釈プレートして、ＡＩＰ１６２０のＣＦＵ／ｇを決定した。ホウセンカ種子を、接種しかつ処理したミックスに蒔いた。上記種子を、標準的温室条件下で発芽させた。１０～１４日後に、各処理における健康な実生の数を計数することによって、上記アッセイをスコア付けした。結果を、以下の表８にまとめる。
Figure 0007299204000007
Figure 0007299204000008
これらの結果は、製剤化ＡＩＰ１６２０が、生存性および活性、すなわち、苗立ち枯れ病から実生を保護する能力を保持することを示す。
実施例１３
５０ｇのＡＩＰ１６２０細胞ペーストを、水分活性０．２未満へと乾燥させた５０ｇのＭｉｎ－Ｕ－Ｇｅｌ ４００もしくはＭｉｎ－Ｕ－Ｇｅｌ ２００アタパルジャイトクレイ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＬＬＣ， Ｓｐａｒｋｓ， ＭＤ）と混合し、２２℃で貯蔵した。これら製剤の生存性を、希釈プレート法によって種々の時点で試験した。その結果を、以下の表９に示す。２１日後に、両方の製剤を温室種子発芽アッセイにおいて試験したところ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉに対する抗真菌活性を保持していたことが見出された。
Figure 0007299204000009
実施例１４．
温室実験を行って、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａの防除におけるＡＩＰ１６２０の効力を実証した。
ＡＩＰ１６２０スターター培養物を、Ｌｕｒｉａ寒天プレートからのコロニーを使用して接種し、０．１×ＮＢＹブロス（脱イオン水１Ｌあたり、０．８ｇのＤｉｆｃｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ粉末および０．５ｇの酵母抽出物粉末）中で増殖させ、２８℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。生産培養物を、脱イオン水１Ｌあたり：１１．３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、３．０ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ グルタミン酸一ナトリウム、３．０ｇ 糖蜜、０．４９ｇ ＭｇＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ
ＺｎＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２ＯおよびｐＨを約６．２へと調節するために十分な塩酸を含むブロス中で増殖させた。５０ｍｌの生産ブロスを、２５０ｍｌ 三角培養フラスコ中に入れ、０．５ｍｌのスターター培養物を接種し、２８℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。生産培養物は、種々の時点で接種し、次いで、同時に採取して、インキュベーション時間１５時間、２４時間、３３時間および４３時間での培養物を得た。各培養物のうちの４０ｍｌを、遠心分離によって採取した。使用済培養ブロスを廃棄し、細胞を、オートクレーブにかけた脱イオン水中に４０ｍｌ最終体積になるように再懸濁した。
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａを、ポテトデキストロースブロスで、１～２週間にわたって振盪なしで増殖させた。得られた菌糸の集まり（ｍｙｃｅｌｉａｌ ｍａｔ）を、ブロスから取り出し、オートクレーブにかけた脱イオン水中でホモジナイズして、液体接種物を生産した。
有機栽培したイチゴを、地元のマーケットから購入した。傷のない果実を選択し、上記Ｂ． ｃｉｎｅｒｅａ接種物の中に２～３秒間浸し、次いで、処理前に６０秒間乾燥させた。ＡＩＰ１６２０処理を、上記接種した果実を上記細胞懸濁物の中に２～３秒間浸すことによって適用した。次いで、果実を、密封プラスチック容器の中に湿らせたペーパータオルとともに入れて、高湿度を維持し、室温で７２～８４時間貯蔵した。各処理において１４反復（ベリー）を行った。各ベリーを、０＝損傷なし、１＝２５％、２＝５０％損傷、３＝７５％損傷、および４＝１００％（すなわち、真菌がベリーを完全に覆っている）という視覚的腐敗重篤度スケールで評価した。結果を、以下の表１０にまとめる。
Figure 0007299204000010
実施例１５．
温室実験を行って、卵菌植物病原体Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎａｄｅｒｍａｔｕｍによって引き起こされる苗立ち枯れ病の防除におけるＡＩＰ１６２０の効力を実証した。
ＡＩＰ１６２０スターター培養物を、Ｌｕｒｉａ寒天プレートからのコロニーを使用して接種し、０．１×ＮＢＹブロス（脱イオン水１Ｌあたり、０．８ｇのＤｉｆｃｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ粉末および０．５ｇの酵母抽出物粉末）中で増殖させ、２８℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。生産培養物を、脱イオン水１Ｌあたり：１１．３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、３．０ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ グルタミン酸一ナトリウム、３．０ｇ 糖蜜、０．４９ｇ ＭｇＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ
ＺｎＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２ＯおよびｐＨを約６．２へと調節するために十分な塩酸を含むブロス中で増殖させた。５０ｍｌの生産ブロスを、２５０ｍｌ三角培養フラスコ中に入れ、０．５ｍｌのスターター培養物を接種し、２８℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。生産培養物は、種々の時点で接種し、次いで、同時に採取して、インキュベーション時間１５時間、２４時間、３３時間、および４３時間での培養物を得た。各培養物のうちの４０ｍｌを遠心分離によって採取した。使用済培養ブロスを廃棄し、上記細胞を、オートクレーブにかけた脱イオン水中で４０ｍｌ最終体積になるように再懸濁した。
Ｐ． ａｐｈａｎａｄｅｒｍａｔｕｍの接種物を、Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｂｅｎｓｏｎ（Ｋ．Ａ． Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｂｅｎｓｏｎ， １９９４． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ．
ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｏｎ Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ， ７８：１９３－１９９．）によって記載されるコメ穎果法を使用して調製した。感染させたコメ穎果を、ブレンダーの中で砕き、＃１０シーブを通してふるいにかけた。この接種物を、Ｆａｆａｒｄスーパーファイン発芽ミックスに６．０ｇ／Ｌの割合（試験１～４）もしくは７．０ｇ／Ｌの割合（試験５）で混合した。
接種した発芽ミックスを、３９２温室プラグトレイ（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｋｒｏｎ， ＯＨ）の中に入れ、各セルに１個のホウセンカ種子を蒔いた。ＡＩＰ１６２０細胞懸濁物を、０．３ｍｌ／セルの割合で適用した。上記種子を、標準的温室条件下で発芽させた。１反復あたり２０セルを用いて、各処理につき２もしくは３回の反復を行った。７～１７日後に、各処理における健康な実生の数を計数することによって、上記アッセイをスコア付けした。結果を、以下の表１１にまとめる。
Figure 0007299204000011
実施例１６． ＡＩＰ１６２０でのアジアダイズサビ病の防除
ＡＩＰ１６２０細胞を、以前の実施例に記載されるとおりに生産した。Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉを、感受性のダイズ植物上で増殖させ、夏胞子（ｕｒｅｉｄｉｎｏｓｐｏｒｅ）を、隆起した葉焼け（ｅｒｕｐｔｅｄ ｐｕｓｔｕｌｅ）を現した感染葉から真空吸引することによって採取した（Ｔｗｉｚｅｙｉｍａｎａ， Ｍ．， ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎ， Ｇ． Ｌ． ２０１０． Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ ｏｎ ｄｅｔａｃｈｅｄ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｕｒｅｄｉｎｉｏｓｐｏｒｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｕｍｉｄｉｔｉｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ９４：１４５３－１４６０）。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２ダイズ植物を、当該分野で周知の技術を使用して、植物生長チャンバの中で生長させた。植物がＶ３ステージにあるときに、最初の完全に展開した三小葉の葉に、再懸濁したＡＩＰ１６２０細胞、化学殺真菌剤標準物、もしくは脱イオン水（接種対照）をスプレーした。１日後、上記葉に、Ｐ．ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ夏胞子（１×１０５／ｍｌ）の懸濁物を接種した。接種および株／殺真菌剤の両方を、空気コンプレッサーに取り付けた噴霧器を使用して適用した。上記植物を、９５％ ＲＨで、それぞれ、２１℃および２３℃における１２時間の明および１２時間の暗の一日サイクルを用いて、生長チャンバの中で維持した。２週間後、上記接種した葉上の無作為に選択した１ｃｍ直径の円の中にある胞子形成している夏胞子堆の数を計数することによって、病気の重篤度をスコア付けした。各処理について３つの反復（植物）および各反復について３回の夏胞子堆計数を行った。結果を、以下の表１２に示し、これは、ＡＩＰ１６２０の適用が、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉによって引き起こされるアジアダイズサビ病を効率的に防除することを実証している。
Figure 0007299204000012
実施例１７． 市販の殺真菌剤とのＡＩＰ１６２０の適合性
ＡＩＰ１６２０の生存性を、この株を３つの市販の殺真菌剤（各々、異なる活性成分を含む（表１３））と混合した後に測定した。殺真菌剤濃度は、圃場適用のための典型的なタンク混合における濃度を摸倣するように選択した。
ＡＩＰ１６２０を、１０ｍＬチューブにおける３ｍＬのＬＢ培地中で、２４時間、２８ｏＣ、２５０ｒｐｍで増殖させた。細胞ペレットを、遠心分離によって採取し、３ｍＬのｄＨ２Ｏ中に懸濁した。細胞懸濁物のうちの９００マイクロリットルを、１００マイクロリットルの１０×殺真菌剤ストックと混合し、２８℃で５分間もしくは１２０分間インキュベートした。
Figure 0007299204000013
殺真菌剤とのインキュベーション後に、細胞を、上記のように遠心分離によって採取し、脱イオン水中に再懸濁した。アリコートを、脱イオン水中で連続希釈し、ＬＢ寒天にプレートし、当該分野で周知の技術を使用して２８℃で２日間インキュベートした。細菌コロニーを計数し、元の溶液におけるコロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）の数を計算した。そのデータを、以下の表１４に示し、これは、ＡＩＰ １６２０の生存性が、これら製剤化した殺真菌剤との混合によって有害に影響を受けないことを実証している。
Figure 0007299204000014
実施例１８． Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉによって引き起こされるアジアダイズサビ病に対するＡＩＰ１６２０および殺真菌剤の混合物の保護活性の評価
細菌を、脱イオン水１Ｌあたり、１１．３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、３ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ グルタミン酸一ナトリウム、３０ｇ 糖蜜、４９３ｍｇ ＭｇＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ ＺｎＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、および５ｍｇ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏからなるブロス培地５０ｍｌへと接種する。培養物を、２８℃、２５０ｒｐｍにおいて２日間、振盪インキュベーターの中で、２５０ｍｌ三角フラスコ中で増殖させる。細胞を、３５００×ｇで１０分間の遠心分離によって集める。培養上清を廃棄し、細胞を、滅菌脱イオン水中に元の培養物の体積になるように再懸濁する。ＡＩＰ０３２３（抗真菌活性を有しないＡＩＰ００６９の変異体）を、陰性対照として含める。
Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉの夏胞子を、隆起した葉焼けを現す真菌に感染した葉から真空吸引することによって採取する。上記胞子を、１０５／ｍＬで水の中に再懸濁し、当該分野で公知の技術を使用してエアブラシを使用して、エアロゾルとして、外したダイズの葉に接種する（Ｔｗｉｚｅｙｉｍａｎａ， Ｍ．， ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎ， Ｇ． Ｌ． ２０１０． Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ ｏｎ ｄｅｔａｃｈｅｄ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｕｒｅｄｉｎｉｏｓｐｏｒｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｕｍｉｄｉｔｉｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ
９４：１４５３－１４６０）。
水に再懸濁したＡＩＰ１６２０細胞および殺菌性活性成分の混合物を、１０６、１０７、１０８、１０９もしくは１０１０のＡＩＰ１６２０細胞／ｍＬを含む種々の割合で調製し、１／１０×、１／３×、１／２×、もしくは１×の通常圃場使用割合の殺菌性活性成分と混合した（スプレー体積／ヘクタールもしくはエーカーについての想定に基づいて、圃場割合を公開されたラベルからｇ／ｍＬに変換することによって計算した）。
接種したダイズ葉に、上記の力価の上記生物防除因子で、および上記の割合の殺真菌剤で、ならびに上記で特定される力価および割合の種々の組み合わせにおける生物防除因子および殺真菌剤の混合物で処理する。さらに、いくつかの接種した外した葉を、未処理のままにするか、または対照としてＡＩＰ０３２３で処理する。少なくとも３枚の葉（もしくは葉の部分）を、生物防除因子、化学物質、もしくは混合物の各処理について使用する。外した葉を、高湿度で、生長チャンバの中、１２時間明、２１℃／１２時間暗、２３℃でインキュベートする。１０～１４日後、上記葉を観察し、ｃｍ２あたりの見える夏胞子堆の数に従ってスコア付けする。
Ｃｏｌｂｙの式を使用して、上記混合物から予測される殺菌効果を決定する。（Ｃｏｌｂｙ， Ｓ． Ｒ．， Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｗｅｅｄｓ １９６７， １５， ２０－２２（その全体が本明細書に参考として援用される）を参照のこと。）
以下の式を使用して、２種の活性成分、ＡおよびＢを含む混合物の予測活性を計算する：
予測＝Ａ＋Ｂ－（Ａ×Ｂ／１００）
Ａ＝混合物中で使用されるものと同じ濃度での活性成分Ａの観察される効力；
Ｂ＝混合物中で使用されるものと同じ濃度での活性成分Ｂの観察される効力。
使用される適用割合および得られる病気防除を含め、代表的な相乗作用を観察し、以下のように記録する：
％ ＤＣ＝パーセント病気防除
％ ＤＣ Ｏｂｓ＝％観察される病気防除
％ ＤＣ Ｅｘｐ＝％予測される病気防除
相乗作用係数＝％ ＤＣ Ｏｂｓ／％ ＤＣ Ｅｘｐ。
実施例１９． 除草剤グルホシネートに対する抵抗性を獲得した生物学的防除株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＡＩＰ００００６９の集団の選択
ＡＩＰ００００６９培養物（０．５×ＬＢ中で２４時間、２８℃で増殖させた）５０マイクロリットルを、０ｍＭもしくは１００ｍＭ グルホシネートを含むＭ６３プラス培地を含むプレートに拡げた。Ｍ６３プラス培地は、脱イオン水１Ｌあたり、１３．６ｇ ＫＨ２ＰＯ４、９．９２ｇ Ｃ６Ｈ１２Ｏ６、２ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５．５ｍｇ ＣａＣｌ２、０．２７８ｍｇ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、および１０．１６ｍｇ ＭｇＣｌ２ ．６Ｈ２Ｏからなった。グルホシネートの非存在下では、多くの細菌コロニー（菌叢）が、プレートを２８℃で２日間インキュベートした後に見えた。１００ｍＭ グルホシネートの存在下では、コロニーは同様のインキュベーション後に全く見えなかったが、数日間の延長したインキュベーションの後には、単一のコロニーが成長した。このコロニーを、１００ｍＭ グルホシネートを含むＭ６３寒天プレート上で単離まで画線培養した。得られた単離物を、ＡＩＰ０５０９９９と名付けた。ＡＩＰ０５０９９９の増殖を、親株ＡＩＰ００００６９、およびこの株のグリホサート抵抗性バージョンＡＩＰ００１６２０と比較した。結果を、以下の表１５にまとめる。
Figure 0007299204000015
明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物もしくは特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることを示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。
前述の発明は、理解を明瞭にする目的で例証および例示によっていくらか詳細に記載されてきたが、ある種の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかである。

Claims (11)

  1. 植物病原体の防除方法であって、前記方法は、収穫後に植物または植物部分へ、有効量の、ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された株を含む生物防除因子を適用する工程を包含し、前記有効量が前記植物病原体を防除する、方法。
  2. ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ－５０８９７として受託された前記株は生存している、請求項１に記載の方法。
  3. 前記植物は単子葉植物である、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記植物は双子葉植物である、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記植物は、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、コメ、サトウキビ、オオムギ、エンバク、ライ、雑穀、ココヤシ、パイナップルまたはバナナである、請求項３に記載の方法。
  6. 前記植物は、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、ワタ、コムギ、テンサイ、タバコ、サツマイモ、アルファルファ、ヒマワリ、ラッカセイ、キャッサバ、コーヒー、カカオ、キュウリ、レタス、オリーブ、エンドウ、アボカド、マンゴー、パパイヤ、イチゴ、カンタロープ、マスクメロン、アーモンド、またはチャである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記病原体は真菌を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記病原体は、アジアダイズサビ病（Ａｓｉａｎ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｒｕｓｔ）を生じるものである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記病原体は、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ、Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、ＶｅｎｔｕｒｉａまたはＧｕｉｇｎａｒｄｉａを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記植物病原体は細菌を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記細菌は、Ｅｒｗｉｎｉａを含む、請求項１０に記載の方法。
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