BR112015006119B1 - Método iterativo de triagem de traço fenotípico ou genotípico de planta para selecionar um ou mais microorganismos capazes de transmitir pelo menos um traço fenotípico ou genotípico benéfico à uma planta, método para a produção de uma composição, métodos para a seleção de composições e métodos para a seleção de um ou mais micro-organismos. - Google Patents

Método iterativo de triagem de traço fenotípico ou genotípico de planta para selecionar um ou mais microorganismos capazes de transmitir pelo menos um traço fenotípico ou genotípico benéfico à uma planta, método para a produção de uma composição, métodos para a seleção de composições e métodos para a seleção de um ou mais micro-organismos. Download PDF

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Abstract

MÉTODOS PARA SELEÇÃO DE UM OU MAIS MICRO-ORGANISMOS CAPAZES DE TRANSMITIR UMA OU MAIS PROPRIEDADES BENÉFICAS PARA UMA PLANTA, PARA A PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÃO PARA APOIAR O CRESCIMENTO, QUALIDADE E/OU SAÚDE DA PLANTA OU PARA SUPRIMIR OU INIBIR O CRESCIMENTO, QUALIDADE E/OU SAÚDE DA PLANTA, PARA A SELEÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO QUE É CAPAZ DE TRANSMITIR UMA OU MAIS PROPRIEDADES BENÉFICAS A UMA PLANTA E PARA SELEÇÃO DE UM OU MAIS MICRO-ORGANISMOS QUE SEJAM CAPAZES DE PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO CAPAZ DE TRANSMITIR UMA OU MAIS PROPRIEDADES BENÉFICAS A UMA PLANTA, BEM COMO MÉTODO PARA AUXILIAR NO MELHORAMENTO DE UMA OU MAIS PLANTAS, SISTEMA, COMPOSIÇÃO, USO DE UM OU MAIS MICRO-ORGANISMOS E PROGRAMA DE CRIAÇÃO DE PLANTAS. A presente invenção diz respeito aos métodos para triagem, identificação e/ou aplicação de micro-organismos e/ou composições para o uso na transmissão de propriedades benéficas para plantas, e micro-organismos e composições identificadas das mesmas.

Description

CAMPO
[0001] A presente invenção diz respeito aos métodos para triagem, identificação e/ou aplicação de micro-organismos de uso em transmissão de propriedades benéficas para plantas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] Processos conhecidos de transmissão de propriedades benéficas para plantas, tais como reprodução seletiva, podem ser extremamente onerosos, lentos, limitados no escopo e repleto de dificuldades reguladoras. Por duas décadas, poucos sucessos comerciais resultaram de investimentos em larga escala para esta tecnologia.
[0003] Apesar dos muitos anos de pesquisas científicas bem sucedidas em reprodução convencional de safras altamente produtivas e no desenvolvimento de safras transgênicas, relativamente poucos esforços de pesquisa foram direcionados no desenvolvimento de traços vegetais através de outros meios.
[0004] Detalhes bibliográficos de publicações mencionadas neste documento são coletados no final da descrição.
OBJETO
[0005] É objeto da presente invenção fornecer um método para a seleção de um ou mais micro-organismos e/ou composição que é de uso na transmissão de uma ou mais propriedades benéficas para uma planta que supera ou aperfeiçoa pelo menos uma das desvantagens dos métodos conhecidos.
[0006] Alternativamente, é um dos objetos da invenção fornecer um método e/ou sistema para auxiliar na melhoria de uma ou mais plantas.
[0007] Alternativamente, é um dos objetos em pelo menos fornecer uma escolha útil para o público.
DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO
[0008] Em um primeiro aspecto amplo da invenção, foi apresentado um método para a seleção de um ou mais micro-organismos capazes de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta, o método caracterizado pelo fato de compreender pelo menos as etapas de: a) sujeitar uma ou mais plantas (incluindo, por exemplo, sementes, plântulas, estacas, e/ou propágulos destas) para um crescimento médio na presença de um primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos; b) selecionar uma ou mais plantas após a etapa a); c) adquirir um segundo conjunto de um ou mais micro-organismos associados com a referida uma ou mais plantes selecionadas na etapa b); d) repetir as etapas a) a c) uma ou mais vezes, em que o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos adquiridos na etapa c) é usado como o primeiro conjunto de micro-organismos na etapa a) de quaisquer repetições bem sucedidas.
[0009] Em uma modalidade, o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos é isolado da referida uma ou mais plantas na etapa c).
[0010] Em uma modalidade, o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos e/ou o segundo conjunto de um ou mais microorganismos são selecionados dos micro-organismos detalhados neste documento.
[0011] Em uma modalidade, o crescimento médio é selecionado a partir da média de crescimento detalhada neste documento.
[0012] Em uma modalidade, a etapa de sujeitar uma ou mais plantas a um crescimento médio envolve crescer ou multiplicar a planta.
[0013] Em uma modalidade, duas ou mais plantas são sujeitas a um crescimento médio na presença de um ou mais micro-organismos. Em outras modalidades, 10 a 20 plantas são sujeitas a um crescimento médio na presença do primeiro conjunto de micro-organismos. Em outras modalidades, 20 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou 1000 ou mais plantas são sujeitas a um crescimento médio na presença do primeiro conjunto de micro-organismos.
[0014] Em uma modalidade, uma ou mais plantas são selecionadas com base em um ou mais critérios de seleção. Em uma modalidade, uma ou mais plantas são selecionadas com base em um ou mais traços fenotípicos. Em uma modalidade preferencial, uma ou mais plantas são selecionadas com base na presença de um traço fenotípico desejável. Em uma modalidade, o traço fenotípico é um daqueles detalhados neste documento. Em uma modalidade, uma ou mais plantas são selecionadas com base em um ou mais traços genotípicos. Em uma modalidade preferencial, uma ou mais plantas são selecionadas com base na presença de um traço genotípico desejável. Em uma modalidade, uma ou mais plantas são selecionadas com base na combinação de um ou mais traços genotípicos e um ou mais traços fenotípicos. Em uma modalidade, diferentes critérios de seleção podem ser usados em diferentes iterações de um método da invenção.
[0015] Em uma modalidade, o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos são isolados da raiz, caule e/ou tecido foliáceo (incluindo reprodutivo) de uma ou mais plantas selecionadas. De forma alternativa, o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos são isolados do tecido da planta inteiro de uma ou mais plantas selecionadas. Em outra modalidade, os tecidos vegetais podem ser esterilizados na superfície e, então, um ou mais micro-organismos podem ser isolados dos tecidos de uma ou mais plantas. Esta modalidade permite a seleção direcionada de micro-organismos endofíticos. Em outra modalidade, o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos podem ser isolados a partir do crescimento médio que circunda as plantas selecionadas.
[0016] Em outra modalidade, o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos são adquiridos na forma bruta.
[0017] Em uma modalidade, um ou mais micro-organismos são adquiridos na etapa c) a qualquer momento após a germinação.
[0018] Em uma modalidade, onde dois ou mais micro-organismos são adquiridos na etapa c), o método compreende adicionalmente as etapas de separação de dois ou mais micro-organismos em isolados individuais, seleção de dois ou mais isolados individuais e, então, combinação de dois ou mais isolados selecionados.
[0019] Em outra modalidade, o método compreende adicionalmente a repetição das etapas a) a c) uma ou mais vezes, em que dois ou mais micro-organismos são adquiridos na etapa c), dois ou mais microorganismos são separados em isolados individuais, dois ou mais isolados são selecionados e, então, combinados, e os isolados combinados são usados como o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos na etapa a) da repetição sucessiva. Consequentemente, onde for feita referência ao uso de um ou mais micro-organismos adquiridos na etapa c) e na etapa a) do método, deverá ser incluído o uso de isolados combinados desta modalidade de invenção.
[0020] Em outra modalidade, dois ou mais métodos da invenção podem ser realizados separadamente e o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos adquiridos na etapa c) de cada método separado em combinado. Em uma modalidade, os micro-organismos combinados são usados como o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos na etapa a) de repetições sucessivas do método da invenção.
[0021] Em uma modalidade, os métodos do primeiro aspecto da invenção podem também ser úteis na identificação e/ou seleção de um ou mais micro-organismos edofíticos capazes de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta.
[0022] Em uma modalidade, o material da planta (incluindo, por exemplo, sementes, plântulas, estacas e/ou propágulos deste) pode ser usado como a fonte de micro-organismos para a etapa a). Em uma modalidade preferencial, o material da planta usado como uma fonte para micro-organismos na etapa a) é uma material da planta. Preferencialmente, o material da planta é esterilizado na superfície.
[0023] Em outra modalidade, os métodos do primeiro aspecto da invenção podem também ser úteis na identificação e/ou seleção de um ou mais micro-organismos não cultiváveis capazes de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta. Em uma modalidade, o material da planta (incluindo, por exemplo, sementes, plântulas, estacas e/ou propágulos deste) pode ser usado como a fonte de micro-organismos para a etapa a).em uma modalidade preferencial, o material da planta usado como uma fonte para micro-organismos na etapa a) é material de explante (por exemplo, estacas vegetais). Preferencialmente, o material da planta é esterilizado na superfície.
[0024] Em um segundo aspecto amplo, é apresentado um método para auxiliar na melhoria de uma ou mais plantas de acordo com um método conforme descrito neste documento, compreendendo a disposição para a avaliação da(s) referida(s) planta(s) na presença de um ou mais micro-organismos e/ou composições. O método compreende preferencialmente, e pelo menos, as etapas de um método do primeiro, sétimo aspecto (e/ou relacionado), e/ou o oitavo aspecto (e/ou relacionado) da invenção.
[0025] De acordo com uma modalidade, a(s) planta(s) é(são) para o crescimento em uma primeira região. O(s) micro-organismo(s) pode(m) ou não pode(m) (ou pelo menos em uma medida significativa) estar presente(s) na primeira região.
[0026] "Região" e "primeira região" devem ser interpretadas amplamente como significando uma ou mais áreas da terra. As áreas da terra podem ser definidas por limites de terra geográficos / políticos / privados ou por áreas de terras que possuem propriedades semelhantes tais como clima, propriedades do solo, presença de uma peste específica, etc.
[0027] Preferencialmente, a avaliação é realizada em uma segunda região na qual o(s) micro-organismo(s) está(ão) presente(s), no entanto, esta não é uma forma essencial Os micro-organismos podem ser obtidos de outras fontes, incluindo depositários de micro-organismos e artificialmente associados com materiais vegetais e/ou solo. Além do mais, enquanto a(s) planta(s) pode(m) ser cultivada(s) essencialmente de uma maneira convencional, porém, em uma região contendo micro-organismos que não são normalmente associados com a(s) planta(s), pelo menos na primeira região, ambientes de crescimento artificial podem ser alternativamente usados, conforme seriam apreciados pelos versados na técnica. Sendo assim, possíveis relacionamentos benéficos entre micro- organismo/planta podem ser identificados os quais não seriam necessariamente usados de forma normal.
[0028] Preferencialmente, a etapa de arranjo compreende arranjar um ou mais de: - recebimento ou transmissão de uma identidade de uma ou mais plantas ou tipos de plantas para serem avaliados; - recebimento ou transmissão de uma identidade de uma ou mais plantas ou tipos de plantas para serem avaliadas; - identificação e/ou seleção de micro-organismo(s) e/ou composição(ões); - aquisição de micro-organismo(s) e/ou composição(ões); e - associação de micro-organismo(s) e/ou composição(ões) com o material da planta.
[0029] Preferencialmente, o método compreender a avaliação (ou arranjo para a referida avaliação de) referida planta(s) na presença do(s) referido(s) micro-organismo(s) e/ou composição(ões).
[0030] A etapa de avaliação preferencialmente compreende a realização de uma ou mais etapas de um método descrito neste documento, em modalidades especiais um método de um ou mais do primeiro aspecto, sétimo aspecto (e/ou aspecto relacionado) ou oitavo aspecto (e/ou aspecto relacionado) da invenção.
[0031] As várias etapas identificadas cima podem ser realizadas por uma entidade única, apenas de ser preferencial que, pelo menos, duas partes estejam envolvidas, uma primeira que realiza uma solicitação e uma segunda que aciona a solicitação. Observe que os vários agentes podem atuar para uma ou ambas as partes e que níveis variados de automação podem ser usados. Por exemplo, em resposta a uma solicitação especial, o(s) micro-organismo(s) pode(m) ser selecionado(s) por um processador solicitando uma base de dados com base em associações conhecidas de micro-organismos para aquele ou planta(s) semelhante(s) com pouca ou nenhuma entrada solicitada por um operador.
[0032] Além disso, a avaliação pode ser realizada por uma parte solicitante e/ou na primeira região. Realizar a avaliação na primeira região garante que a avaliação seja precisa e que nenhum fator ambiental não previsto que possa impactar sobre a(s) planta(s) ou micro-organismo(s) não seja considerado.
[0033] Após a avaliação ou durante o curso da mesma, o método compreende preferencialmente um ou mais de: − receber ou enviar um ou mais micro-organismos (ou pelo menos a identidade deste) e/ou composição(ões) da primeira região, incluindo em combinação com o material da planta; e − cultivar a(s) referida(s) planta(s) ou outras plantas (preferencialmente tendo propriedades semelhantes) na primeira região na presença do(s) referido(s) micro-organismo(s) e/ou composição(ões).
[0034] O método do segundo aspecto pode ser incorporado por uma primeira parte: − identificar uma necessidade para melhoria na(s) planta(s); − enviar a identidade deste e/ou material da planta relevante para uma segunda parte junto com informações relevantes, e − receber material da planta e/ou um ou mais micro-organismos e/ou as identidades deste e/ou composição(ões).
[0035] A etapa de recebimento é preferencialmente realizada após ou em resultado de uma avaliação da planta/micro-organismo e/ou associações da planta/composição. Preferencialmente, a avaliação é feita usando um método conforme descrito neste documento, em especial, incorporar um método do primeiro aspecto, o sétimo aspecto (e/ou aspecto relacionado) ou oitavo aspecto (e/ou aspecto relacionado).
[0036] O método do segundo aspecto pode ser adicionalmente ou alternativamente incorporado por uma segunda parte: − receber uma identidade de uma planta(s) e/ou material da planta relevante de uma primeira parte junto com informações relevantes, e − enviar material da planta e/ou um ou mais micro-organismos e/ou as identidades deste e/ou composição(ões) da primeira parte.
[0037] A etapa de envio é preferencialmente realizada após ou em resultado de uma avaliação da planta/micro-organismo e/ou associações da planta/composição. Preferencialmente, a avaliação é feita usando um método descrito neste documento, em especial, incorporar um método do primeiro aspecto, o sétimo aspecto (e/ou aspecto relacionado) ou oitavo aspecto (e/ou aspecto relacionado).
[0038] De acordo com um terceiro aspecto, é fornecido um sistema para implementar o método do segundo aspecto.
[0039] O sistema do terceiro aspecto inclui preferencialmente um ou mais de: − meios para receber ou transmitir uma identidade de uma ou mais plantas ou tipos de planta a serem avaliadas; − meios para recebimento ou transmissão de material da planta por uma ou mais plantas ou tipos de plantas a serem avaliadas; − meios para identificação e/ou seleção de micro-organismo(s) e/ou composição(ões); − meios para aquisição de micro-organismo(s) e/ou composição(ões); − meios para associação de micro-organismo(s) e/ou composição(ões) com o material da planta. − meios para avaliação da(s) referida(s) planta(s) na presença do(s) referido(s) micro-organismo(s) e/ou composição(ões); − meios para receber ou enviar um ou mais micro-organismos (ou pelo menos a identidade destes) e/ou composição(ões) para a primeira região, incluindo em combinação com material da planta; e − meios para cultivo da(s) referida(s) planta(s) ou outras plantas (preferencialmente tendo propriedades semelhantes) na primeira região na presença do(s) referido(s) micro-organismo(s) e/ou composição(ões).
[0040] Meios conhecidos para os versados na técnica podem ser usados para fornecer a funcionalidade requerida no sistema do terceiro aspecto. Por exemplo, meio convencionais de comunicação, incluindo a internet, podem ser usados para transmitir as identidades das plantas, micro-organismos; meios do transportador convencional pode ser usado para transmitir o material da planta/micro-organismos/composição(ões); meios e processos convencionais podem ser usados para associar um micro-organismo e/ou composição com material da planta e meios convencionais para avaliar a referida planta(s) e/ou a planta/micro- organismos e/ou associações de planta/composição podem ser usadas.
[0041] De acordo com uma modalidade preferencial, o sistema da invenção é incorporado por uma facilidade configurada para transmitir solicitação(ões) para uma melhoria na(s) planta(s) e, subsequentemente, para receber material da planta e/ou um ou mais micro-organismos e/ou as identidades destes, preferencialmente, após ou em resultado de uma avaliação das associações de planta/micro-organismo. Preferencialmente, a avaliação é feita usando um método descrito neste documento, em especial, incorporar um método do primeiro aspecto, o sétimo aspecto (e/ou aspecto relacionado) ou oitavo aspecto (e/ou aspecto relacionado).
[0042] O sistema do segundo aspecto pode adicionalmente ou alternativamente ser incorporado por uma facilidade configurada para receber uma identidade de uma planta(s) e/ou material da planta relevante, juntamente com quaisquer informações relevantes; e enviar material da planta e/ou um ou mais micro-organismos e/ou identidades deste e/ou composição(ões), preferencialmente após ou em resultado de uma avaliação de planta/micro-organismo ou associações de planta/composição. Preferencialmente, a avaliação é feita usando um método descrito neste documento, em especial, incorporar um método do primeiro aspecto, o sétimo aspecto (e/ou aspecto relacionado) ou oitavo aspecto (e/ou aspecto relacionado).
[0043] Consequentemente, para um quarto aspecto amplo da invenção, é apresentado um micro-organismo adquirido, selecionado ou isolado por um método conforme descrito antes neste documento. Em uma modalidade, o micro-organismo é uma endófita. Em uma modalidade, o micro-organismo é não cultivável.
[0044] Em um quinto aspecto amplo da invenção, é apresentado um método para a produção de uma composição para suportar o crescimento da planta, qualidade e/ou saúde ou uma composição para suprimir ou inibir o crescimento, qualidade e/ou saúde da planta, o método compreendendo as etapas de um método descrito anteriormente neste documento e a etapa adicional de combinar um ou mais micro-organismos selecionados pelo método com um ou mais ingredientes adicionais.
[0045] Em um sexto aspecto amplo da invenção, é apresentado uma composição compreendendo um ou mais micro-organismos do quarto aspecto amplo ou conforme preparado por um método do quinto aspecto amplo.
[0046] Em um sétimo aspecto amplo da invenção, é apresentado um método para a seleção de uma composição que é capaz de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta, o método compreendendo pelo menos as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos selecionados por um método do primeiro aspecto da invenção em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separação de um ou mais micro-organismo de um ou mais meios em uma ou mais culturas após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente sem micro-organismos; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de uma ou mais composições da etapa c) se for observada conferência de uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas.
[0047] Em um aspecto amplo da invenção relacionado (porém distinto) ao sétimo aspecto amplo da invenção, é apresentado um método para a seleção de uma composição que é capaz de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta, o método compreendendo pelo menos as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos selecionados por um método do primeiro aspecto da invenção em um ou mais meios para formar uma ou mais culturas; b) inativação de uma ou mais culturas da etapa a) para fornecer uma ou mais composições contendo um ou micro-organismos inativos; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de uma ou mais composições da etapa c) se for observada conferência de uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas.
[0048] Em um oitavo aspecto amplo da invenção, foi apresentado um método para a seleção de um ou mais micro-organismos que são capazes produzir a composição que pode transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta, o método compreendendo pelo menos as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos selecionados por um método do primeiro aspecto da invenção em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separação de um ou mais micro-organismo de um ou mais meios em uma ou mais culturas da etapa a) após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente sem microorganismos; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de um ou mais micro-organismos associados (ou, em outras palavras, usados para produzir) uma ou mais composições observadas para conferir uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas.
[0049] Em um aspecto relativo ao (porém distinto do) oitavo aspecto amplo da invenção, foi apresentado um método para a seleção de um ou mais micro-organismos que são capazes produzir a composição que pode transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta, o método compreendendo pelo menos as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separação de um ou mais micro-organismo de um ou mais meios em uma ou mais culturas após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente livre de micro-organismos; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de um ou mais micro-organismos associados (ou, em outras palavras, usados para produzir) uma ou mais composições observadas para conferir uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas; e e) uso de um ou mais micro-organismos selecionados na etapa d) na etapa a) de um método do primeiro, oitavo ou nono aspectos da invenção.
[0050] Em um aspecto relacionado, a etapa b) do método do oitavo aspecto (e/ou relacionado) poderia ser substituída pela etapa b) inativando uma ou mais culturas da etapa a) para fornecer uma ou mais composições contendo um ou mais micro-organismos inativados e, usando então, esta composição na etapa c) do processo.
[0051] Deveria ser apreciado que os métodos do primeiro, sétimo (e/ou aspecto relacionado) aspecto e oitavo aspecto (e/ou aspecto relacionado) podem ser combinados em qualquer combinação, incluindo os métodos sendo simultaneamente ou sequencialmente executados em qualquer número de iterações, com composições e/ou micro-organismos selecionados ou isolados a partir de métodos sendo usados individualmente ou combinados e usados em rodadas iterativas de um ou mais métodos. A título de exemplo, um método do sétimo aspecto (e/ou relativo) pode ser realizado ou uma composição selecionada. A seleção de uma composição indica que um ou mais micro-organismos separados do meio na etapa b) são desejáveis para transmitir propriedades benéficas para uma ou mais plantas (conforme um ou mais micro-organismos são capazes de produzir a composição selecionada). Um ou mais microorganismos podem então ser usados em outra rodada de um método do primeiro aspecto, sétimo aspecto (e/ou relativo) ou oitavo aspecto (e/ou relativo). Alternativamente, a combinação dos métodos poderia ser executada em inverso. Isto poderia ser repetido inúmeras vezes em qualquer ordem e combinação. Consequentemente, a invenção fornecer para uso de um ou mais micro-organismos, composição ou planta adquirida, selecionada ou isolada pelo método da invenção em qualquer outro método da invenção.
[0052] Em um nono aspecto amplo da invenção, foi apresentada uma composição obtida em resultado dos métodos do sétimo aspecto (e/ou aspecto relacionado) ou oitavo aspecto (e/ou aspecto relacionado) amplo da invenção.
[0053] Em um décimo aspecto amplo da invenção, foi apresentada uma combinação de dois ou mais micro-organismo adquiridos, selecionados ou isolados por um método conforme descrito antes neste documento.
[0054] Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de uma ou mais composições e/ou micro-organismos adquiridos, selecionados ou isolados por um método da invenção para transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma ou mais plantas.
[0055] Deveria ser apreciado que métodos da invenção também podem envolver aplicar as etapas a) a d) do método do primeiro aspecto em duas ou mais espécies diferentes da planta de forma a identificar combinações de micro-organismos que podem transmitir um benefício positivo para uma espécie e um benefício negativo para outras espécies, simultaneamente. Por exemplo, alguém pode desejar identificar um grupo de micro-organismos que podem melhorar simultaneamente o crescimento ou sobrevivência de uma safra alimentar e suprimir ou inibir o crescimento de uma safra ou planta daninha competidora. Isto pode ser realizado por usar uma ou duas espécies diferentes de plantas na etapa a) ou executar métodos separados em espécies diferentes e em pontos adequados, combinando os micro-organismos adquiridos naqueles métodos e conduzindo iterações adicionais.
[0056] A invenção também fornece plantas selecionados em um método da invenção.
[0057] A invenção também fornece o uso de um método da invenção em um programa de reprodução de plantas e um programa de reprodução que compreende conduzir um método da invenção.
[0058] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende um ou mais micro-organismos listados na tabela 4. Em uma modalidade, um ou mais micro-organismos são endófitas.
[0059] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende um ou mais micro-organismos listados na tabela 3.
[0060] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende um ou mais micro-organismos listados na tabela 2.
[0061] Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de um ou mais micro-organismos listados na tabela 4 ou uma composição compreendendo a mesma para aumentar a biomassa da planta. Em uma modalidade, a planta é milho. Em uma modalidade, um ou mais micro-organismos são endofíticos.
[0062] Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de um ou mais micro-organismos listados na tabela 3 ou uma composição compreendendo a mesma para aumentar as concentrações de carboidratos em uma ou mais plantas. Em uma modalidade, uma ou mais plantas são manjericão.
[0063] Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de um ou mais micro-organismos listados na tabela 2 ou uma composição compreendendo a mesma para aumentar a biomassa da planta. Em uma modalidade, uma ou mais plantas são azevém.
[0064] A invenção pode consistir amplamente de partes, elementos e características mencionadas ou indicadas na especificação da aplicação, individualmente ou coletivamente, em qualquer ou em todas as combinações de duas ou mais das referidas partes, elementos ou características, e onde números inteiros específicos são mencionados neste documento que possuem equivalentes conhecidos são considerados como sendo incorporados no presente documento, como se fossem individualmente apresentados.
FIGURAS
[0065] Estes e outros aspectos da presente invenção, que deveriam ser considerados em todos os seus aspectos originais, se tornarão evidentes pela seguinte descrição que é fornecida apenas à título de exemplo, com referência às figuras acompanhantes, nas quais: Figura 1: mostra um sistema de acordo com uma modalidade da invenção; Figura 2: mostra o fluxo de processos de um método de uma modalidade da invenção.
MODALIDADE(S) PREFERENCIAL(IS)
[0066] A seguir é apresentada uma descrição das formas preferenciais da presente invenção dada em termos gerais. A invenção será posteriormente elucidada a partir dos exemplos fornecidos mais à frente.
[0067] O(s) inventor(s) concluiu(ram) que alguém pode identificar prontamente os micro-organismos capazes de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma ou mais plantas através do uso de um método da invenção. O método é baseado amplamente na presença da variabilidade (tal como variabilidade genéticas, ou variabilidade no fenótipo, por exemplo) nas plantas e populações microbianas usadas. Os inventores identificaram que esta variabilidade pode ser usada para apoiar um processo direto de seleção de um ou mais micro-organismos de uso para uma planta e para identificar combinações especiais de plantas/micróbios que são de benefício para um fim específico que pode nunca ter sido reconhecido usando técnicas convencionais.
[0068] Os métodos da invenção podem ser usados como uma parte de um programa de reprodução de plantas. Os métodos podem permitir, ou pelo menos auxiliar, a seleção de plantas que possuem um genótipo/fenótipo especial que é influenciado por uma flora microbiana, além de identificar micro-organismos e/ou composições que são capazes de transmitir uma ou mais propriedades para uma ou mais plantas.
[0069] Em um aspecto, a invenção se relaciona com um método para a seleção de um ou mais micro-organismos que são capazes de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta. Deveria ser apreciado que, conforme mencionado neste documento uma "propriedade benéfica para uma planta" deveria ser interpretada amplamente para significar quaisquer propriedades que são benéficas para fins especiais, incluindo propriedades que podem ser benéficas para seres humanos, outros animais, o meio ambiente, um hábitat, um ecossistema, a economia, de benefício comercial ou de qualquer outro benefício para uma entidade ou sistema. Consequentemente, o termo deveria ser considerado para incluir propriedades que podem suprimir, diminuir ou bloquear uma ou mais características para uma planta, incluindo suprimir, diminuir ou inibir o crescimento ou taxa de crescimento de uma planta. A invenção pode ser descrita neste documento, a título de exemplo, em termos de identificar benefícios positivos para uma ou mais plantas ou melhorar as plantas. Contudo, deveria ser apreciado que a invenção é igualmente aplicável para identificar benefícios negativos que podem ser conferidos às plantas.
[0070] Tais propriedades benéficas incluem, porém não se limitam a, por exemplo: características de crescimento, saúde e/ou sobrevivência melhoradas, adequabilidade ou qualidade da planta para um fim especial, estrutura, cor, composição química ou perfil, sabor, odor, qualidade melhorada. Em outras modalidades, as propriedades benéficas incluem, porém não se limitam a, por exemplo: diminuição, supressão ou inibição do crescimento de uma planta identificada como uma planta daninha; restringir a altura e largura de uma planta para um tamanho ornamental desejável; limitar a altura de plantas usadas em aplicações de cobertura do solo tais como autoestradas e bancos de margem de estrada e projetos de controle de erosão; diminuir o crescimento de plantas usadas em aplicações de turfas tais como gramados, gramados de boliche e campos de golfe para reduzir a necessidade de corte; reduzir a razão de folhagem/flores em arbustos ornamentais de flores; regular a produção de e/ou resposta dos feromônios das plantas (resultando em produção aumentada de tanino em comunidades vegetais circundantes e atração diminuída para espécies forrageiras).
[0071] Conforme usado neste documento, "melhorado" deveria ser amplamente considerado para incluir melhoria de uma característica de uma planta que pode já existir em uma planta ou plantes antes da aplicação da invenção, ou a presença de uma característica que não existia em uma planta ou plantas antes da aplicação da invenção. A título de exemplo, crescimento "melhorado" deveria ser considerado para incluir crescimento de uma planta onde a planta não foi anteriormente conhecida como crescendo sob condições relevantes.
[0072] Conforme usado neste documento, "inibir e suprimir" e termos semelhantes deveriam ser amplamente considerados e não deveriam ser interpretados como exigindo inibição ou supressão completas, apesar de isto ser desejado em algumas modalidades.
[0073] Para auxiliar na descrição da invenção, os termos um "primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos" e um "segundo conjunto de um ou mais micro-organismos" podem ser usados aqui neste documento para distinguir o conjunto ou grupo de micro-organismo(s) aplicado na etapa a) e o conjunto ou grupo de micro-organismo(s) adquirido na etapa c) de um método da invenção. Em determinadas modalidades, os conjuntos de micro-organismos serão distintos; por exemplo, o segundo conjunto pode ser um subconjunto do primeiro conjunto em resultado da combinação do primeiro conjunto com a planta e, então, selecionar uma ou mais plantas com base em um ou mais critérios de seleção. Contudo, deveria ser apreciado que este nem sempre é o caso e, consequentemente, o uso desta terminologia não deveria ser construída de tal forma limitada.
[0074] Em determinadas modalidades, os métodos da invenção se relacionam a seleção de um ou mais micro-organismos que são capazes de transmitir uma ou mais propriedades benéficas para uma planta. Conforme é descrito posteriormente neste documento, tais micro-organismos podem estar contidos dentro de uma planta, sobre uma planta, e/ou dentro da rizosfera da planta. Consequentemente, onde houver referência a aquisição de um segundo conjunto de um ou mais micro-organismos "de" uma planta, a menos que o contexto exija de outra forma, deveria ser considerado como incluindo referência a aquisição de um segundo conjunto de microorganismos contidos dentro de uma planta, sobre uma planta e/ou dentro da rizosfera da planta. Para facilitar a referência, a menção "associada com" pode ser usada de forma sinônima para mencionar micro-organismos contidos dentro de uma planta, sobre uma planta e/ou dentro do rizosfera da planta.
[0075] De maneira ampla, o método compreende pelo menos as etapas de a) crescimento de uma ou mais plantas em um meio de crescimento na presença de um primeiro conjunto de um ou mais microorganismos; b) seleção de uma ou mais plantas após a etapa a); e, c) aquisição de um segundo conjunto de um ou mais micro-organismos associados com a referida uma ou mais plantas selecionadas na etapa b). Uma ou mais plantas, meio de crescimento e um ou mais micro-organismos podem ser fornecidos separadamente ou combinados em qualquer ordem adequada antes da etapa a).. Em especial, a invenção fornece um método iterativo nos quais as etapas a) a c) podem ser repetidas em uma ou mais vezes, em que um ou mais micro-organismos adquiridos na etapa c) são usados na etapa (a) do próximo ciclo do método. Em uma modalidade, as etapas a) a c) são repetidas uma vez. Em outra modalidade, as etapas a) a c) são repetidas duas vezes. Em outra modalidade, as etapas a) a c) são repetidas três vezes. Em outra modalidade, as etapas a) a c) são repetidas pelo menos até que uma propriedade benéfica desejada seja observada.
[0076] Será apreciado que, após um número desejado de repetições da etapa a) a c), o método possa ser concluído com a aquisição de um conjunto de um ou mais micro-organismos da etapa c).
[0077] Deveria ser apreciado que os métodos não exigem a identificação de micro-organismos na população adquirida na etapa c) tampouco requerem uma determinação das propriedades de microorganismos individuais ou combinações de micro-organismos adquiridos. Contudo, a avaliação, identificação e/ou a determinação das propriedades benéficas poderiam ser conduzidas, se desejadas. Por exemplo, em alguns casos, pode ser preferencial isolar e identificar os micróbios na etapa final de um método da invenção para determinar sua segurança para uso comercial e para satisfazer exigências reguladoras. Em alguns casos, análises genéticas e/ou fenotípicas podem ser conduzidas.
[0078] Em uma modalidade, a etapa a) é conduzida usando pelo menos duas plantas. Em outras modalidades, 10 a 20 plantas são usadas. Em ainda outras modalidades 20 ou mais. 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais ou 1000 ou mais plantas são usadas. Conforme mencionado previamente neste documento, onde duas ou mais plantas são usadas em um método particular da invenção, elas não precisam ser da mesma variedade ou espécie. Por exemplo, em uma modalidade, pode ser desejável selecionar micro-organismos que possam transmitir um benefício positivo para uma variedade de plantas ou espécies e benefícios negativos para outra variedade de plantas ou espécies.
[0079] Em uma modalidade, onde dois ou mais micro-organismos são adquiridos na etapa c), o método compreende adicionalmente as etapas de separação de dois ou mais micro-organismos em isolados individuais, seleção de dois ou mais isolados individuais e, então, combinação de dois ou mais isolados selecionados. Isto pode resultar no conjunto de microorganismos adquiridos na conclusão de um método de uma invenção. Contudo, em uma modalidade, os isolados combinados podem então ser usados na etapa a) de rodadas sucessivas do método. A título de exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez isolados individuais podem ser combinados. Os inventores contemplam um método iterativo no qual as etapas a) a c) são repetidas uma ou mais vezes, utilizando estas etapas adicionais de separação, seleção e combinação com cada repetição do método, ou intercalado ou combinado de outra forma com um método no qual os isolados individuais não são selecionados e combinados.
[0080] Espera-se que estas combinações venham a detectar propriedades anteriormente conhecidas e desejáveis promovendo (tal como crescimento da planta), interações sinérgicas entre os micróbios. Usando as etapas iterativas a) a c) ativará a população inicial de dois ou mais micro-organismos para micróbios que interagem com a planta para transmitir uma propriedade desejada ou característica. Em outras palavras, o processo permitirá o enriquecimento de micro-organismos adequados dentro do microbioma da planta.
[0081] A seleção de isolados individuais pode ocorrer com base em critérios de seleção adequados. Por exemplo, pode ser randômico, com base na propriedade ou propriedades benéficas observadas por realizar um método da invenção ou, onde a informações sobre a identidade do microorganismo é conhecida, com base no que o micro-organismo tenha sido anteriormente reconhecido como possuindo uma propriedade benéfica em especial.
[0082] Além disso, dois ou mais métodos da invenção podem ser realizados separadamente ou em paralelo, e os micro-organismos que resultam de cada método combinados em uma única composição. Por exemplo, dois métodos separados podem ser realizados, um para identificar micro-organismos capazes de transmitir uma, ou mais, primeira propriedade benéfica, e um segundo para identificar micro-organismos capazes de transmitir uma ou mais da segunda propriedade benéfica. Os métodos separados podem ser direcionados para identificar microorganismos possuindo a mesma propriedade benéfica ou tendo propriedades benéficas distintas. Os micro-organismos e plantas usadas nos métodos separados podem ser os mesmos ou diferentes. Se a otimização posterior dos micro-organismos for desejada, a composição única dos micro-organismos pode ser aplicada a uma ou mais rodadas adicionais de um método da invenção. Alternativamente, a composição única de micro-organismos pode ser usada, conforme desejada, para conferir as propriedades relevantes para safras de plantas, sem a otimização posterior. Combinar dois ou mais métodos da invenção desta forma permitir a seleção e combinação de micro-organismos que podem comumente serem separados pelo tempo e/ou espaço em um ambiente em especial.
[0083] Em determinadas modalidades da invenção, os métodos podem compreender crescimento e propagação de uma ou mais plantas selecionadas na etapa c) do método, para crescer a população do segundo conjunto de um ou mais micro-organismos associados com uma ou mais plantas selecionadas, mesmo na conclusão de um método da invenção, ou antes do uso do segundo conjunto de um ou mais micro-organismos na etapa a) de repetições sucessivas do método. Se uma ou mais plantas (com micro-organismos associados) são cultivadas ou propagadas na conclusão de um método da invenção, então, elas podem ser usadas ou vendidas nesta forma. Alternativamente, um ou mais micro-organismos podem ser isolados de uma ou mais plantas, ou um ou mais tecidos da planta e/ou uma ou mais partes da planta com micro-organismos associados podem ser usadas como uma fonte bruta de um ou mais micro- organismos em repetições sucessivas da invenção, ou para qualquer outra finalidade na conclusão do método. Em uma modalidade, as sementes (com micro-organismos associados) de uma ou mais plantas que tenham sido cultivadas ou propagadas podem ser obtidas e usadas como uma fonte de um ou mais micro-organismos em repetições sucessivas do método. Alternativamente, se obtidas na conclusão de um método da invenção, as sementes e micro-organismos associados podem ser vendidos ou usados para qualquer outra finalidade.
[0084] Métodos e aspectos adicionais da invenção são descritos daqui em diante neste documento.
Micro-organismos
[0085] Conforme usado neste documento, o termo "micro-organismo" deveria ser usado de forma ampla. Inclui, porém não se limita, a dois domínios procariontes, Bacteria e Archaea, bem como fungos e protistas encariontes. A título de exemplo, os micro-organismos podem incluir Proteobacterias (tais como Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium e Halomonas), Firmicutes (tais como Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma e Acetobacterium), Actinobactérias (tais como Streptomyces, Rhodococcus, Microbacterium e Curtobacterium), e os fungos do filo Ascomycota (tais como Trichoderma, Ampelomyces, Coniothyrium, Paecoelomyces, Penicillium, Cladosporium, Hypocrea, Beauveria, Metarhizium, Verticullium, Cordyceps, Pichea, e Candida, Basidiomycota (tais como Coprinus, Corticium e Agaricus) e Oomycota (tais como Pythium, Mucor e Mortierella).
[0086] Em uma modalidade especialmente preferencial, o microorganismo é uma endófita ou uma epífita ou um micro-organismo habitando a rizosfera da planta. Em uma modalidade, o micro-organismo é uma endófita originada de semente.
[0087] Em determinadas modalidades, o micro-organismo é não cultivável. Isto deveria ser considerado para significar que o microorganismo não é conhecido como cultivável ou é de cultivo difícil usando os métodos conhecidos para alguém versado na técnica.
[0088] Os micro-organismos de uso em métodos da presente invenção (por exemplo, o primeiro conjunto de um ou mais microorganismos) podem ser coletados ou obtidos de quaisquer fontes ou contidos dentro e/ou associados com material coletado de quaisquer fontes.
[0089] Em uma modalidade, o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos são obtidos de ambientes terrestres gerais, incluindo seu solo, plantas, fungos, animais (incluindo invertebrados) e outras biotas, incluindo os sedimentos, água e biota de lagos e rios; de ambientes marinhos, sua biota e sedimentos (por exemplo, água marinha, lodo marinho, plantas marinhas, invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixes); a geosfera terrestre e marinha (regolitos e rochas, por exemplo, rochas subterrâneas britadas, areia e argilas); a criosfera e suas águas de degelo; a atmosfera (por exemplo, poeira aérea filtrada, gotas de nuvens e chuva); ambientes urbanos, industriais e outros ambientes feitos pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumulada sobre concreto, goteiras de margem de rodovias, superfícies do solo, superfícies de rodovias).
[0090] Em outra modalidade, o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos são obtidos de uma fonte provável de favorecer a seleção de micro-organismos adequados. A título de exemplo, a fonte pode ser um ambiente especial no qual é desejável para outras plantas para cultivar ou que é provável de ser associado com o solo. Em outro exemplo, a fonte pode ser uma planta possuindo um ou mais traços desejáveis, por exemplo, uma planta que naturalmente cresce em um ambiente especial ou sob determinadas condições de interesse. A título de exemplo, uma determinada planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou areia de alta salinidade, ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou pode ser resistente a determinadas pestes ou doenças presentes no ambiente, e pode ser desejável para uma safra comercial a ser cultivada em tais condições, especialmente, se elas são, por exemplo, as únicas condições disponíveis em uma localização geográfica específica. A título de exemplo adicional, os micro-organismos podem ser coletados de safras comerciais cultivadas em tais ambientes, ou mais especialmente de plantas de safras individuais que melhor exibem um traço de interesse entre uma safra cultivada em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas que crescem mais rápido dentre uma safra cultivada em solos que limitam os sais, ou pelo menos plantas danificadas em safras expostas a danos graves por insetos ou doenças epidêmicas, ou plantas possuindo quantidades desejáveis de determinados metabólitos e outros compostos, incluindo teor de fibras, teor de óleos, e semelhantes, e plantas exibindo cores, gosto ou odor desejáveis. Os micro-organismos podem ser coletados de uma planta de interesse ou de qualquer material que ocorre no ambiente de interesse, incluindo fungos e outros animais ou biota de plantas, solo, água, sedimentos e outros elementos do ambiente, conforme mencionados anteriormente.
[0091] Em certas modalidades, os micro-organismos são originados de métodos da invenção executados anteriormente (por exemplo, os micro-organismos adquiridos na etapa c) do método), incluindo combinações de isolados individuais do segundo conjunto de micro-organismos isolados na etapa c) ou combinações de micro-organismos resultantes de dois ou mais métodos executados separadamente da invenção.
[0092] Embora a invenção evite a necessidade de conhecimento prévio sobre as propriedades desejáveis de um micro-organismo a respeito de uma espécie particular de planta, em uma modalidade um microorganismo ou combinação de micro-organismos de uso nos métodos da invenção pode ser selecionado de uma coleção preexistente de espécies microbianas individuais ou cepas baseadas em algum conhecimento acerca de sua semelhança ou benefício previsto para uma planta. Por exemplo, pode-se prever que o micro-organismo: otimiza a fixação de nitrogênio; libera fosfato da matéria orgânica do solo; libera fosfato de formas inorgânicas do fosfato (por exemplo, fosfato de pedra); "fixa o carbono" na microesfera de raiz; vive na rizosfera da planta, ajudando a planta na absorção dos nutrientes do solo circundante e tornando-os assim mais acessíveis para a planta; aumento no número de nódulos nas raízes da planta e aumentando assim o número de nitrogênios simbióticos fixando a bactéria (por exemplo, da espécie Rhizobium) por planta e a quantidade de nitrogênio fixado pela planta; elicita as respostas defensivas da planta, como a resistência sistêmica induzida (ISR) ou a resistência adquirida sistêmica (SAR), que ajuda a planta a resistir a invasões e à difusão de micro-organismos patogênicos; compete com os micro-organismos deletérios ao crescimento ou à saúde da planta através de antagonistas, ou a utilização competitiva de recursos como nutrientes e espaço; alteração na cor de uma ou mais partes da planta, ou alteração no perfil químico da planta: seu cheiro, seu gosto ou uma ou outra qualidade.
[0093] Em uma modalidade, um micro-organismo ou uma combinação de micro-organismos (o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos) é selecionado de uma coleção pré-existente de espécies microbianas individuais ou cepas que não oferece conhecimento algum sobre sua semelhança ou benefício previsto para a planta. Por exemplo, uma coleção dos micro-organismos não identificados isolados dos tecidos de planta sem nenhum conhecimento de sua habilidade de melhorar o crescimento ou a saúde de planta, ou uma coleção dos micro-organismos coletou para explorar seu potencial para produzir os compostos que poderiam conduzir ao desenvolvimento de drogas farmacêuticas.
[0094] Em uma modalidade, os micro-organismos são isolados do material de fonte (por exemplo, solo, rocha, água, ar, poeira, planta ou o outro organismo) em que residem naturalmente. Os micro-organismos podem ser fornecidos em qualquer forma apropriada, tendo preocupação com o seu uso pretendido nos métodos da invenção. Entretanto, apenas a título de exemplo, os micro-organismos podem ser fornecidos como suspensão aquosa, gel, homogenado, grânulo, pó, pasta, organismo vivo ou material seco. Os micro-organismos podem ser isolados em cultivos substancialmente puros ou misturados. Podem ser concentrados, diluídos ou fornecidos em concentrações naturais em que eles são encontrados no material de base. Por exemplo, micro-organismos de sedimentos salinos podem ser isolados para uso nesta invenção pela suspensão do sedimento em água fresca e deixando o sedimento cair até o fundo. A água que contém o volume dos micro-organismos pode ser removida por decantação após um período apropriado de estabelecimento e aplicação direta ao meio de crescimento da planta, ou concentrado por filtragem ou centrifugação, diluída a uma concentração apropriada e aplicada ao meio de crescimento da planta com o volume de sal removido. A título de mais um exemplo, micro-organismos de fontes mineralizadas ou tóxicas podem ser tratadas de maneira semelhante para recuperar os micróbios para aplicação ao material de crescimento da planta para minimizar o potencial de dano à planta.
[0095] Em outra modalidade, os micro-organismos (incluindo o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos e/ou o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos) são usados em forma bruta, em que eles não são isolados do material de base no qual eles residem naturalmente. Por exemplo, os micro-organismos são fornecidos em combinação com o material de base em que eles residem; por exemplo, como solo, raízes, semente e folhagem da planta.
[0096] Nessa modalidade, o material de base pode incluir uma ou mais espécies de micro-organismos.
[0097] É preferível que uma população mista de micro-organismos seja utilizada nos métodos da invenção.
[0098] Nas modalidades da invenção em que os micro-organismos estão isolados de um material de base (por exemplo, o material no qual eles residem naturalmente), pode ser usada qualquer técnica ou uma combinação com um número de técnicas padrão que serão imediatamente identificadas por aqueles versados na técnica. No entanto, a título de exemplo, em geral essas empregam processos em que um cultivo sólido ou líquido de um micro-organismo individual pode ser obtido em uma forma substancialmente pura, geralmente por separação física na superfície de um meio de crescimento microbiano sólido ou por isolamento diluidor volumétrico em um meio de crescimento microbiano líquido. Esses processos podem incluir o isolamento do material seco, suspensão líquida, pastas ou homogenados em que o material é espalhado em uma camada fina sobre um meio de crescimento em gel sólido ou diluições seriais do material feito em um meio estéril e inoculado em meios de crescimento líquidos ou sólidos.
[0099] Embora não seja essencial, em uma modalidade o material contendo os micro-organismos pode ser pré-tratado antes do processo de isolamento para multiplicar todos os micro-organismos no material ou selecionar parcelas da população microbiana, tanto para enriquecer o material com nutrientes microbianos (por exemplo, nitratos, açúcares ou vegetais, extratos microbianos ou animais) quanto pela aplicação de um meio para garantir a sobrevivência seletiva de apenas uma parcela da diversidade microbiana dentro do material (por exemplo, pela pasteurização da amostra a 60 °C-80 °C por 10-20 minutos para selecionar microorganismos resistentes à exposição ao calor (por exemplo, bacilos), ou pela exposição da amostra a baixas concentrações de um solvente orgânico ou expondo a amostra às concentrações baixas de um orgânico solvente ou esterilizante (por exemplo, etanol de 25% por 10 minutos) para potencializar a sobrevivência de actinomicetos e formadores de esporos ou micro-organismos resistentes a solventes). Os micro-organismos podem então ser isolados dos materiais enriquecidos ou dos materiais tratados para a sobrevivência seletiva, conforme acima.
[0100] Em uma modalidade preferencial da invenção, microorganismos endofíticos ou epifíticos são isolados do material da planta. Qualquer número de técnicas padrão conhecidas na técnica pode ser usado e os micro-organismos podem ser isolados de qualquer tecido apropriado na planta, incluindo, por exemplo, a raiz, o caule e as folhas e tecidos reprodutivos da planta. A título de exemplo, os métodos convencionais de isolamento de plantas incluem tipicamente a os métodos convencionais para o isolamento das plantas incluem tipicamente a excisão esterilizada do material da planta de interesse (por exemplo, a raiz ou a extensão do caule, as folhas), a esterilização da superfície com uma solução apropriada (por exemplo, hipoclorito de sódio de 2%), depois do qual o material da planta é colocado no meio de nutrientes para o crescimento microbiano (ver, por exemplo, Strobel G and Daisy B (2003) Bioprospecting para endófitos microbianos e seus produtos naturais. Microbiology e Molecular Biology Reviews 67 (4): 491-502; Zinniel DK et al (2002) Isolation and characterisation of endophytic colonising bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology 68 (5): 2198-2208). Em uma modalidade preferível da invenção, os microorganismos são isolados do tecido da raiz. Outras metodologias para o isolamento de micro-organismos do material da planta são detalhadas aqui posteriormente.
[0101] Conforme utilizado aqui, "isolar", "isolado" e termos afins devem ser considerados de maneira ampla. Pretende-se que esses termos signifiquem que um ou mais micro-organismo(s) foram separados ao menos parcialmente de pelo menos um dos materiais com os quais eles estão associados em um ambiente específico (por exemplo, solo, água, tecido da planta). "Isolar", "isolado" e termos afins não devem ser entendidos como indicadores do quanto o(s) micro-organismo(s) foi/foram purificado(s).
[0102] Como usado aqui, "isolados individuais" devem ser entendidos como significando uma composição ou cultivo compreendendo a predominância de um único gênero, espécie ou variamente de microorganismo, seguindo-se a separação de um ou mais de outros microorganismos. A frase não deve ser entendida como um indicativo do quanto o micro-organismo foi isolado ou purificado. No entanto, "isolados individuais" preferencialmente compreende substancialmente apenas um gênero, espécie ou variamente do micro-organismo.
[0103] Em uma modalidade, a população microbiana é exposta (antes do método ou em alguma fase do método) a uma pressão seletiva para potencializar a probabilidade de que as plantas eventualmente selecionadas terão montagens microbianas propensas a ter as propriedades desejadas. Por exemplo, a exposição dos micro-organismos à pasteurização antes de sua adição ao meio de crescimento da planta (preferencialmente estéril) está propensa a potencializar a probabilidade de que as plantas selecionadas para um tratamento desejado serão associadas com micróbios formadores de esporos que possam sobreviver com mais facilidade sob condições adversas, sob armazenamento comercial, ou se aplicada em uma semente como um revestimento em um ambiente adverso.
[0104] Deve-se levar em conta que um segundo conjunto de micro-organismos adquiridos na etapa c) do método da invenção pode ser isolado de uma planta ou material de planta, superfície ou meios de crescimento associados com uma planta selecionada utilizando quaisquer técnicas apropriadas conhecidas na técnica, incluindo mas não se limitando àquelas técnicas descritas aqui. No entanto, em certas modalidades, conforme mencionado anteriormente, o(s) micro-organismo(s) pode(m) ser usado(s) em uma forma bruta e não precisa(m) ser isolado(s) da planta ou dos meios. Por exemplo, o material da planta ou os meios de crescimento que incluem os micro-organismos identificados para serem benéficos para uma planta selecionada podem ser obtidos e usados como uma fonte bruta de micro-organismos para a próxima rodada do método ou como uma fonte bruta de micro-organismos na conclusão do método. Por exemplo, todo o material da planta inteiro poderia ser obtido e opcionalmente processado, como por palhagem ou esmagamento. Alternativamente, os tecidos individuais ou as partes das plantas selecionadas (como folhas, caules, raízes e sementes) podem ser separadas da planta e opcionalmente processadas, como por palhagem ou esmagamento. Em certas modalidades, uma ou mais partes da planta que estão associadas com o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos podem ser removidas de uma ou mais plantas selecionadas e, onde for conduzida qualquer repetição sucessiva do método, enxertadas em uma ou mais plantas usadas na etapa a).
[0105] Os métodos da invenção podem ser descritos aqui em termos de um segundo conjunto de um ou mais micro-organismos sendo isolados de seu material de base. No entanto, a não ser que o contexto exija o contrário, deve-se entender que eles incluem referência ao uso de microorganismos em forma bruta em que eles não tenham sido isolados do material de base.
Plantas
[0106] Qualquer quantidade de uma variedade de diferentes plantas, incluindo musgos, líquens e algas, pode ser utilizada nos métodos da invenção. Em modalidades preferíveis, as plantas têm valor econômico, social e/ou ambiental. Por exemplo, as plantas podem incluir aquelas de uso: na produção de alimentos; nas culturas de fibras; como oleaginosas; na indústria florestal; na indústria de papel e de pasta de papel; como matéria-prima para a produção de biocombustível; e/ou como plantas ornamentais. Em outras modalidades, as plantas podem ser economicamente, socialmente e/ou ambientalmente indesejáveis, como as ervas daninhas. A seguir, uma lista de exemplos não restritivos de tipos de plantas a que os métodos da invenção podem ser aplicados a: Produção de alimentos: - Cereais (milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, aveia, centeio, triticale, trigo mourisco); - vegetais frondosos (plantas brassicáceas, como repolho, brócolis, couve chinesa, rúcula; salas verdes, como espinafre, agrião, alface); - vegetais frutíferos e com flores (por exemplo, abacate, milho doce, alcachofra, cucurbitáceas, por exemplo: abóboras, pepino, melão, abobrinha, moranga; vegetais/frutas solononáceos, por exemplo: tomates, berinjela, pimentão); - leguminosas (amendoins, ervilhas, soja, feijão, lentilha, grão de bico, quiabo); - vegetais de bulbo e caule (aspargo, aipo, vegetais do gênero Allium, por exemplo: alho, cebola, alho-poró); - raízes e vegetais tuberosos (cenouras, beterrabas, rebentos de bambu, mandioca, inhame, gengibre, alcachofra de Jerusalém, pastinaca, rabanete, batata, batata doce, taro, nabo, wasabi); - plantação de açúcar, incluindo beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum); - plantações cultivadas para a produção de bebidas não- alcoólicas e estimulantes (café, chá preto, verde e de ervas, cacau, tabaco); - plantações de frutas, como frutas de bagas verdadeiras (por exemplo, kiwi, uva, passa de Corinto, groselha, goiaba, feijoa, romã), frutas cítricas (por exemplo, laranja, limão, lima, toranja), frutas epígenas (por exemplo, banana, oxicoco, mirtilo), frutas agregadas (amora, framboesa, boysenberry), frutas múltiplas (por exemplo, abacaxi, figo), plantações de frutas de caroço (por exemplo, damasco, pêssego, cereja, ameixa), frutas de semente (por exemplo, maçã, pera) e outros como morango, sementes de girassol; - ervas culinárias e medicinais, por exemplo: alecrim, manjericão, louro, coentro, menta, endro, Hypericum, dedaleira, aloe vera, roseira selvagem); - plantas de plantação que produzem tempero, por exemplo: pimenta preta, cominho, canela, noz-moscada, gengibre, cravo, açafrão, cardamomo, macis, páprica, masala, anis estrelado; - plantações cultivadas para a produção de nozes, por exemplo: amêndoa e noz, castanha do Pará, castanha de caju, coco, castanha, noz de macadâmia, noz de pistache; amendoim, noz pecã; - plantações cultivadas para a produção de cerveja, vinho e outras bebidas alcoólicas, por exemplo: uvas, lúpulo; - plantações de oleaginosos, por exemplo: soja, amendoim, algodão, azeitona, girassol, gergelim, espécies de tremoço e plantações de brassicáceas (por exemplo, canola/colza oleaginosa); e - fungos comestíveis, por exemplo: cogumelos brancos, Shiitake e cogumelo ostra; Plantas usadas em agricultura pastoral: - legumes: Espécie Trifolium, espécie Medicago e espécie Lotus; Trevo branco (T. repens); Trevo vermelho (. pratense); Trevo caucasiano (T. ambigum); trevo subterrâneo (T. subterraneum); Alfalfa/Luzerna (Medicago sativum); medicinais anuais; luzerna cortada; alfafa lupulina; Sanfeno (Onobrychis viciifolia); cornichão (Lotus corniculatus); cornichão gigante (Lotus pedunculatus); - legumes de semente, incluindo ervilha (Pisum sativum), feijão comum (vulgaris de Phaseolus), feijões largos (Viciafaba), feijão de Mung (Vigna radiata), feijão-frade (Vigna unguiculata), grão-de-bico (Cicer arietum), tremoço (espécie Lupinus); - Cereais, incluindo milho (Zea mays), sorgo (espécie Sroghum), painço (Panicum miliaceum, P. sumatrense), arroz (Oryza sativa indica, Oryza sativa japonica), trigo (Triticum sativa), cevada (Hordeum vulgare), centeio (Secale cereale), triticale (Triticum X Secale), aveia (Avena fatua); - Forragens e gramas paisagísticas: Gramas temperadas como as da espécie Lolium; espécie Festuca; espécie Agrostis, azevém perene (Lolium perenne); azevém híbrido (Lolium hybridum); azevém anual (Lolium multiflorum), festuca alta (Festuca arundinacea); festuca de prado (Festuca pratensis); festuca vermelha (Festuca rubra); Festuca ovina; Festuloliums (cruzamentos de Lolium X Festuca); dactilo (Dactylis glomerata); grama- azul (Poa pratensis); Poa palustris; Poa nemoralis; Poa trivialis; Poa compresa; espécie Bromus; Phalaris (espécie Phleum); Arrhenatherum elatius; espécie Agropyron; Avena strigosa; Setaria italic; - Gramas tropicais como: Espécie Phalaris; espécie Brachiaria; espécie Eragrostis; espécie Panicum; grama de Bahai (Paspalum notatum); espécie Brachypodium; e, - Gramas usadas para a produção do biocombustível, como a grama selvagem (Panicum virgatum) e a espécie Miscanthus; Plantações de fibra: - algodão, cânhamo, juta, coco, sisal, linho (espécie Linum), linho da Nova Zelândia (espécie Phormium); a plantação e espécies de floresta natural colhidas para papel e produtos projetados de fibra de madeira, como coníferas e espécies florestais de folhas largas; Árvores e espécies de arbusto usadas em plantações florestais e plantações de biocombustível: - Pinho (espécie Pinus); pinheiro (espécie Pseudotsuga); Abeto (espécie Picea); Cipreste (espécie Cupressus); barbilhão (espécie Acacia); amieiro (espécie Alnus); espécies de carvalho (espécie Quercus); pau-brasil (espécie Sequoiadendron); salgueiro (espécie Salix); bétula (espécie Betula); cedro (espécie Cedurus); freixo (espécie Fraxinus); lariço (Larix species); espécies de eucalipto; bambu (espécie Bambuseae) e choupos (espécie Populus). Plantas cultivadas para a conversão de energia, biocombustíveis ou produtos industriais por tratamento de extração, biológico ou bioquímico: - - Plantas produtoras de óleo, como óleo de palma, purgueira, soja, algodão, linhaça; - Plantas produtoras de látex, como a seringueira, a Hevea brasiliensis e a árvore de borracha do Panamá; - plantas usadas como matérias-primas diretas ou indiretas para a produção de biocombustíveis, isto é: após a transformação química, física (por exemplo, térmica ou catalítica) ou bioquímica (por exemplo, pré- tratamento enzimático) ou transformação biológica (por exemplo, fermentação bicrobiana) durante a produção de biocombustíveis, solventes industriais ou produtos químicos, por exemplo: etanol ou botanol, propano- dióis ou outro combustível ou material industrial incluindo plantações de açúcar (por exemplo, beterraba, cana-de-açúcar), plantações para produção de amido (por exemplo, plantações de cereais C3 e C4 e plantações tuberosas), plantações celulósicas, como árvores florestais (por exemplo, pinheiros, eucaliptos) e gramináceas e poáceas, como o bambu, a grama selvagem e o miscanto; - plantações usadas para energia, biocombustível ou produção química industrial através da gasificação e/ou conversão microbiana ou catalítica do gás para biocombustíveis ou outros materiais industriais brutos, como solventes ou plásticos, com ou sem a produção de biochar (por exemplo, plantações de biomassa, como coníferas, eucalipto, árvores de florestas tropicais ou de folhas largas, plantações de gramináceas e poáceas, como bambu - grama selvagem, miscanto, cana-de-açúcar ou cânhamo ou madeiras leves, como choupos e salgueiros; e - plantações de biomassa usadas na produção de biochar; Plantações para cultivo de produtos naturais úteis para as indústrias farmacêutica, neutracêutica agrícula e de cosméticos: - plantações para a produção de precursores ou composto farmacêuticos ou compostos e materiais de cosméticos e nutracêuticos, por exemplo: anis estrelado (ácido chiquímico), poligonácea japonesa (resveratol), kiwi (fibra solúvel, enzimas proteolíticas); Plantas floriculturais, ornamentais e paisagísticas cultivadas pelas suas propriedades estéticas e ambientais: - Flores, como rosas, tulipas e crisântemos; - Arbustos ornamentais, tais como Buxus, Hebe, Rosa, Rhododendron, Hedera - plantas paisagísticas como Platanus, Choisya, Escallonia, Euphorbia, Carex - Musgos como o musgo sphagnum Plantas cultivadas para biorremedicação: - Helianthus, Brassica, Salix, Populus, Eucalipto
[0107] Deve-se levar em consideração que uma planta pode se apresentar na forma de semente, corte, muda, propágulo ou qualquer outro material ou tecido de planta apto ao cultivo. Em uma modalidade, a semente pode ter a sua superfície esterilizada com um material como hipoclorito de sódio ou cloreto de mercúrio para remover micro-organismos contaminadores da superfície. Em uma modalidade, o propágulo é cultivado em um cultivo axênico antes de ser colocado em um meio de crescimento de planta, por exemplo: como plântulas estéreis no cultivo do tecido.
Meio de crescimento
[0108] O termo "meio de crescimento" conforme utilizado aqui deve ser considerado amplamente como significando qualquer meio que esteja apto a sustentar o cultivo de uma planta. A título de exemplo, os meios podem ser naturais ou artificiais, incluindo, mas não limitado a, solo, misturas por envasamento, cascas, vermiculita, soluções hidropônicas isoladas ou aplicadas a sistemas sólidos de sustentação de planta e géis de cultivo de tecido. Deve-se levar em consideração que os meios podem ser usados isoladamente ou em combinação com um ou mais outros meios.
Eles também podem ser usados com ou sem a adição de nutrientes exógenos e sistemas de sustentação física para as raízes e para a folhagem.
[0109] Em uma modalidade, o meio de crescimento é um meio encontrado na natureza, como solo, areia, lama, argila, húmus, regolito, pedra ou água. Em outra modalidade, o meio de crescimento é artificial. Tal meio de crescimento artificial pode ser construído para imitar as condições do meio encontrado na natureza, mas isso não é necessário. Os meios artificiais de cultivo podem ser feitos de uma ou mais quantidades e combinações de materiais, incluindo areia, minerais, vidro, pedra, água, metais, sais, nutrientes e água. Em uma modalidade, o meio de crescimento é estéril. Em outra modalidade, o meio de crescimento não é estéril.
[0110] O meio pode ser emendado ou enriquecido com compostos ou componentes adicionais, por exemplo, um componente que possa ajudar na interação e/ou na seleção de grupos específicos de micro-organismos com a planta e entre si.
[0111] Em certas modalidades da invenção, o meio de crescimento pode ser pré-tratado para ajudar na sobrevivência e/ou seleção de certos micro-organismos. Por exemplo, o meio pode ser pré-tratado pela incubação em meios de enriquecimento para estimular a multiplicação de micróbios endógenos que possam estar presentes ali. A título de exemplo, o meio pode ser pré-tratado pela incubação em um meio seletivo para estimular a multiplicação de um grupo específico de micro-organismos. Um exemplo adicional inclui o pré-tratamento do meio de crescimento para excluir dele um elemento específico do conjunto microbiano; por exemplo, pasteurização (para remover um fungo ou uma bactéria formadora de esporos) ou tratamento com solventes orgânicos, como diversos álcoois, para remover micro-organismos sensíveis a esses materiais, mas permite a sobrevivência dos actinomicetos e das bactérias formadoras de esporos, por exemplo.
[0112] Os métodos de pré-tratamento ou enriquecimento podem ser informados técnicas de caracterização de comunidades microbiana independentes de cultura que fornecem informações sobre a identidade dos micróbios ou grupos de micróbios presentes. Esses métodos podem incluir, mas não se limitam a, técnicas de sequenciamento, incluindo sequenciamento de alto rendimento e análise filogenética, ou triagem à base de microarranjos de codificação de ácidos nucleicos para componentes de operons de rRNA ou outros locais taxonomicamente informativos.
Condições de cultivo
[0113] De acordo com os métodos da invenção, um ou mais plantas são sujeitadas a um ou mais micro-organismos e a um meio de crescimento. A planta é preferencialmente cultivada ou permitida que se multiplique na presença de um ou mais micro-organismos e meio de crescimento. O(s) micro-organismo(s) pode(m) estar presente(s) no meio de crescimento naturalmente sem a adição de outros micro-organismos, por exemplo: em um solo natural. O meio de crescimento, a planta e os microorganismos podem ser combinados ou expostos um ao outro em qualquer ordem apropriada. Em uma modalidade, a planta, a semente, a muda, o corte, a propágula, ou semelhante, é plantada ou semeada no meio de crescimento que foi previamente inoculado com um ou mais micro-organismos. Alternativamente, um ou mais micro-organismos podem ser aplicados à planta, à semente, à muda, ao corte, ao propágulo ou semelhante, que então é plantado(a) ou semeado(a) no meio de crescimento (que pode ou não conter outros micro-organismos). Em outra modalidade, a planta, a semente, a muda, o corte, a propágula ou semelhante é primeiramente plantado ou semeado no meio de crescimento e posteriormente o micro-organismo ou os micro-organismos são aplicados à planta, à semente, à muda, ao corte, à propágula ou semelhante e/ou o próprio meio de crescimento é inoculado com um ou mais microorganismos.
[0114] Os micro-organismos podem ser aplicados à planta, à muda, ao corte, à propágula ou semelhante e/ou o meio de crescimento utilizando qualquer uma das técnicas conhecidas na técnica. No entanto, a título de exemplo, em uma modalidade, o micro-organismo ou os micro-organismos são aplicados à planta, à muda, ao corte, à propágula e semelhantes através de borrifação ou varredura. Em outra modalidade, os microorganismos são aplicados diretamente às sementes (por exemplo, como revestimento) antes da semeadura. Em outra modalidade, os microorganismos ou esporos dos micro-organismos são colocados em grânulos e aplicados ao longo das sementes durante a semeadura. Em outra modalidade, os micro-organismos podem ser inoculados em uma planta pelo corte da raiz ou dos caules e pela exposição da superfície da planta aos micro-organismos através de borrifação, imersão ou aplicação de outra maneira de uma suspensão líquida microbiana, gel ou pó. Em outra modalidade, o(s) micro-organismo(s) pode(m) ser injetado(s) diretamente no tecido foliar ou da raiz, ou inoculado de outra maneira diretamente sobre ou dentro do corte foliar ou da raiz ou ainda imposto dentro de um embrião, uma radícula ou coleóptilo. Essas plantas inoculadas podem então ser expostas a um meio de crescimento contendo micro-organismos adicionais, mas isso não é necessário. Em certas modalidades, os micro-organismos são aplicados à planta, à muda, ao corte, à propágula ou semelhante e/ou o meio de crescimento associado ao material da planta (por exemplo, material da planta com o qual os organismos encontram-se associados).
[0115] Em outras modalidades, particularmente onde os microorganismos são incultiváveis, os micro-organismos podem ser transferidos para uma planta por qualquer um destes ou uma combinação de enxerto, inserções de explantes, aspiração, eletroporação, ferimento, poda da raiz, indução de abertura estomatal ou qualquer tratamento físico, químico ou biológico que ofereça a oportunidade para os micróbios entrarem nas células da planta ou no espaço intercelular. Pessoas versadas na técnica poderão imediatamente apreciar um número de técnicas alternativas que podem ser usadas.
[0116] Deve-se apreciar que tais técnicas são igualmente aplicáveis à aplicação do primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos e o segundo conjunto de micro-organismos quando usadas na etapa a) de uma repetição sucessiva do método.
[0117] Em uma modalidade, os micro-organismos infiltram-se em partes da planta, como as raízes, os caules, as folhas e/ou partes de plantas reprodutivas (tornam-se endofíticas) e/ou crescem na superfície das raízes, dos caules, das folhas e/ou de partes de plantas reprodutivas (tornam-se epifíticas) e/ou crescem na rizosfera da planta. Em uma modalidade preferível, o(s) micro-organismo(s) forma(m) uma relação simbólica com a planta.
[0118] As condições de cultivo utilizadas podem variar dependendo da espécie da planta, conforme será apreciado por aqueles versados na técnica. No entanto, a título de exemplo, para um trevo, em um recinto de cultivo, pode-se tipicamente cultivar plantas em um solo contendo aproximadamente 1/3 de matéria orgânica em forma de turfa, 1/3 de adubo e 1/3de pedra-pomes selecionada, suplementadas por fertilizantes tipicamente contendo nitratos, fosfatos, potássio e sais de magnésio e micronutrientes, em um pH entre 6 e 7. As plantas podem ser cultivadas a uma temperatura entre 22 e 24 °C, em um período de 16:8 de luz do dia:escuridão, e automaticamente regadas.
[0119] Por exemplo, no caso das variedades de trigos do inverno, semeados principalmente no hemisfério Norte, pode ser importante selecionar as plantas que apresentam perfilhamento precoce após a exposição da semente a um meio de cultivo contendo micro-organismos sob condições de iluminação e temperatura semelhante àquelas experimentadas pelas sementes de trigo de inverno no hemisfério Norte, já que o perfilhamento precoce é uma característica relacionada à sobrevivência no inverno, ao crescimento e à eventual produção de grãos no verão. Ou uma espécie da árvore pode ser selecionada para crescimento e saúde melhorados em 4-6 meses, já que essas peculiaridades são relacionadas à taxa de saúde e de crescimento e tamanho de árvores 10 anos mais velhas, um desenvolvimento de produto por um período impraticável utilizando-se esta invenção.
Seleção
[0120] Tipicamente, após o cultivo de uma ou mais plantas na presença de um ou mais micro-organismos, uma ou mais plantas são selecionadas com base em um ou mais critérios de seleção. Em uma modalidade, as plantas são selecionadas com base em uma ou mais peculiaridades fenotípicas. Pessoas versadas na técnica apreciarão prontamente que tais traços incluem toda a característica observável da planta, incluindo, por exemplo, taxa de crescimento, comprimento, peso, cor, gosto, cheiro, alterações na produção de um ou mais compostos pela planta (incluindo, por exemplo, metabólitos, proteínas, drogas, carboidratos, óleos ou qualquer outro composto). A seleção das plantas com base em informações genotípicas também é previsto (por exemplo, incluindo o padrão da expressão do gene da planta em resposta a micro-organismos, genótipo, presença de marcadores genéticos). Deve-se apreciar que em certas modalidades as plantas podem ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de uma determinada característica ou peculiaridade (como uma característica ou peculiaridade indesejável) como oposta à presença de uma determinada característica ou peculiaridade (como uma característica ou traço desejável).
[0121] Onde a presença de um ou mais marcadores genéticos for analisada, o marcador ou os marcadores podem já ser conhecidos e/ou associados com uma característica particular da planta; por exemplo, um marcador ou marcadores estarem associados com uma crescente taxa de crescimento ou perfil metabólico. Essa informação poderia ser usada combinação com uma análise baseada em outras características em um método da invenção para selecionar uma combinação de diferentes características da planta que possam ser desejáveis. Tais técnicas podem ser usadas para identificar novos QTLs que ligam peculiaridades desejáveis da planta com uma flora microbiana específica - por exemplo, combinando o genótipo da planta com um tipo de microbioma.
[0122] A título de exemplo, as plantas podem ser selecionadas com base na taxa de crescimento, no tamanho (incluindo, mas não limitado a, peso, comprimento, tamanho da folha, tamanho do caule, padrão de ramificação ou o tamanho de qualquer parte da planta), saúde geral, assim como outras características conforme descrito anteriormente aqui. Exemplos adicionais e não limitadores incluem a seleção das plantas com base em: velocidade da germinação da semente; quantidade de biomassa produzida; raiz aumentada e/ou crescimento da folha/do rebento que leva a um rendimento aumentado (pastagem, grão, fibra ou óleo) ou à produção de biomassa; efeitos no crescimento da planta que resultam em um rendimento aumentando de semente em uma plantação, o que pode ser particularmente relevante em plantações de cereais, como trigo, cevada, aveia, centeio, milho, arroz, sorgo, plantações de sementes de óleo, como soja, canola, algodão, girassol e legumes de semente, como ervilha, feijão; efeitos no crescimento da planta que resultam em um rendimento aumentado de óleo, o que pode ser particularmente relevante em plantações de sementes de óleo, como soja, canola, algodão, pinhão e girassol; efeitos no crescimento da planta que resultam em um rendimento aumentando de fibra (por exemplo, em algodão, linho e linhaça) ou para efeitos que resultam em um rendimento aumentado do tubérculo em plantações como as de batata e de beterraba sacarina; efeitos no crescimento da planta que resultam em uma digestibilidade aumentada da biomassa, o que pode ser particularmente relevante em plantações de forragem, como legumes de forragem (alfalfa, trevos, medicinais), gramas de forragem (espécie Lolium; espécie Festuca; espécie Paspalum; espécie Brachiaria; espécie Eragrostis), plantações de forragem cultivadas para silagem, como milho e cereais de forragem (trigo, cevada, aveia); efeitos no crescimento de planta que resultam em um rendimento de fruta aumentado, o que pode ser particularmente relevante para árvores de frutas com semente (como maçã, pera, etc.), frutas de baga (como morango, framboesa, oxicoco), frutas com caroço (como nectarina, damasco) e frutas cítricas, uvas, figos e nogueiras; efeitos no crescimento da planta que levam a uma resistência ou tolerância aumentada a doenças, incluindo doenças fúngicas, virais ou bacterianas, ou a pestes, como insetos, ácaros e nemátodos, em que o dano é medido pelos sintomas foliares diminuídos, como a incidência de lesões fúngicas ou bacterianas, ou pela área da folhagem danificada ou pela redução no número dos cistos de nemátodos ou irritações nas raízes, ou melhorias no rendimento da planta na presença dessas pestes e doenças; efeitos no crescimento da planta que levam a um rendimento aumentado de metabólitos, por exemplo: no cultivo de plantas para fins farmacêuticos, nutracêuticos ou comésticos, o que pode ser particularmente relevante para plantas como o anis estralo cultivado para a produção de ácido shímico, crítico para a produção da droga anti-influenza, oseltamivir, ou para a produção de poligonácea japonesa para a extração de resveratrol, ou para a produção de fibra solúvel e produtos de enzimas dietéticas do kiwi, ou, por exemplo, rendimentos aumentados de "taninos condensados" ou outros metabólitos úteis para a inibição da produção de gases do efeito estufa, como o metano, em animais de pastagem; efeitos no crescimento da planta que levam a uma melhoria nos atributos estéticos, o que pode ser particularmente importante em plantas cultivadas pela sua forma, cor ou sabor, por exemplo: a intensidade da cor e a forma em flores ornamentais, o gosto de frutas ou vegetais, ou o gosto do vinho de parreiras tratadas com os micro-organismos; e efeitos no crescimento de plantas que levam a uma melhoria nas concentrações dos compostos tóxicos realizados ou desintoxicados pelo cultivo de plantas para fins de biorreabilitação.
[0123] A seleção das plantas baseadas em informações fenotípicas ou genotípicas utilizando técnicas como, mas não limitadas a: seleção de alta produtividade de componentes químicos originados de plantas, técnicas de sequenciamento que incluem o sequenciamento de alta produtividade de material genético, técnicas diferenciais de exposição (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjo de ácido nucleico, sequenciamento de RNA (Sequenciamento Shotgun Completo do Transcriptoma), qRT-PCR (PCT quantitativo em tempo real).
[0124] Em certas modalidades da invenção, pode ser desejável a seleção de uma combinação de peculiaridades da planta. Isso pode ser obtido de inúmeras maneiras. Em uma modalidade, múltiplas rodadas de aprimoramento iterativo para uma peculiaridade, por exemplo: crescimento superior, são mantidas até que um nível aceitável de crescimento seja alcançado. Rodadas semelhantes de seleção, mas completamente separadas, são realizadas para identificar micro-organismos que possam ao menos conferir diferentes peculiaridades desejáveis, por exemplo: uma cor aprimorada de flor. Tais rodadas separadas de seleção podem ser executadas utilizando-se uma abordagem iterativa ou de empilhamento ou uma combinação de métodos separados poderiam ser usados, com os organismos resultantes dessas rodadas separadas ou métodos combinados em uma única composição. A essa altura o(s) micro- organismo(s) poderia(m) ser elaborado(s) como um produto contendo combinações de micro-organismos fermentados separadamente, cada qual apresentado para aprimorar um atributo diferente da planta. Em outra modalidade, os conjuntos de micro-organismos separadamente selecionados podem ser combinados em conjuntos de dois ou mais e usados em outros métodos da invenção. Em outra modalidade, os conjuntos de micro-organismos separadamente selecionados podem ser separados em isolados individuais e então os isolados individuais são combinados em conjuntos de dois ou mais e usados em outros métodos da invenção. Em uma modalidade, os micro-organismos combinados são aplicados ao meio da planta e/ou de crescimento ciclo iterativo. Por exemplo, em uma combinação, micro-organismos aptos a aprimorar o crescimento da planta são combinados com micro-organismos aptos a potencializar a cor da flor. Os micro-organismos combinados são então adicionados a um meio de crescimento de planta em que as plantas são cultivadas por um período adequado, sob condições adequadas. O grau de crescimento e a cor da flor são analisados e os micróbios são isolados das plantas de melhor performance para uso em uma iteração seguinte. Rodadas iterativas semelhantes podem ser continuadas até que um nível aceitável de crescimento de planta e de cor de flor sejam alcançados. Essa aproximação ajudará a seleção dos micróbios que aprimoram sinergisticamente o desempenho da planta; a título de exemplo não limitador, aprimorar o crescimento da planta e a cor da flor a um grau melhor do que aquele alcançado se os micro-organismos forem aplicados como uma combinação de dois conjuntos selecionados separadamente.
Colheita
[0125] Depois da seleção, uma ou mais plantas são colhidas e os tecidos da planta podem ser examinados para detectar micro-organismos formando associações com a planta (por exemplo, associações endofítica, epifítica ou rizosférica).
[0126] As técnicas descritas aqui podem ser usadas na aquisição de um segundo conjunto de micro-organismos na conclusão de um método da invenção ou para uso em qualquer repetição sucessiva dos métodos da invenção.
[0127] O micro-organismo ou os micro-organismos podem ser isolados de qualquer tecido apropriado das plantas selecionadas; por exemplo, a planta inteira, o tecido foliar, o tecido do caule, o tecido da raiz e/ou das sementes. Em uma modalidade preferível, os micro-organismos são isolados do tecido foliar, da raiz ou do caule e/ou das sementes de uma ou mais plantas selecionadas.
[0128] Em determinadas modalidades da invenção, os microorganismos podem ser adquiridos em forma bruta, em que eles não estão isolados do material de base em que eles residem (como o tecido da planta ou os meios de crescimento).
[0129] Onde ocorre o isolamento dos micro-organismos, eles podem estar isolados das plantas utilizando quaisquer métodos apropriados conhecidos na técnica. No entanto, a título de exemplo, os métodos de isolamento de micróbios endofíticos podem incluir a excisão estéril do material da planta de interesse (por exemplo, raiz, extensão do caule, semente), a esterilização da superfície com uma solução apropriada (por exemplo, 2% de hipoclorito de sódio), depois da qual o material da planta é colocado em um meio de nutrientes para o desenvolvimento microbiano, especialmente fungos filamentosos. Alternativamente, o material de planta com a superfície esterilizada pode ser esmagado para formar um líquido estéril (geralmente água) e uma suspensão líquida, incluindo pequenos pedaços de material de planta esmagada espalhado sobre a superfície de um meio, ou meios, apropriado de ágar sólido, que pode ou não ser seletivo (por exemplo, conter apenas ácido fítico como fonte de fósforo). Essa abordagem é especialmente útil para bactérias e fermentos que formam colônias isoladas e podem ser selecionados individualmente em placas de meio de nutriente separadas e então purificadas em uma espécie única por métodos bem conhecidos. Alternativamente, a raiz da planta ou as amostras de folhagem não podem ter a sua superfície esterilizada, apenas cuidadosamente regada, incluindo no processo de isolamento, assim, os micro-organismos epifíticos residentes na superfície ou os micróbios epifíticos podem ser isolados separadamente através da marcação e da remoção de partes das raízes da planta, as hastes das folhas, na superfície de um meio de ágar e então isolar colônias individuais como feito acima. Essa abordagem é especialmente útil para bactérias e fermentos, por exemplo. Alternativamente, as raízes podem ser processadas sem que sejam lavadas as pequenas quantidades do solo presas nas raízes, incluindo assim os micróbios que colonizam a rizosfera da planta. Caso contrário, o solo aderente às raízes pode ser removido, diluído e espalhado no ágar de meios seletivos e não seletivos para isolar colônias individuais de micróbios rizosféricos. Uma metodologia exemplificativa adicional pode ser encontrada em: Strobel G and Daisy B (2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67 (4): 491-502; Zinniel DK et al. (2002) Isolation and characterisation of endophytic colonising bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology 68 (5): 2198-2208; Manual of Environmental Microbiology, Hurst et al., ASM Press, Washington DC.
[0130] Os métodos para isolamento podem ser informados por técnicas de caracterização de comunidade independentes de cultivo que fornecem informações sobre a identidade e a atividade de micróbios presentes em uma amostra dada. Esses métodos podem incluir, mas não se limitam a, técnicas de sequenciamento, incluindo sequenciamento de alto rendimento e análise filogenética, ou triagem à base de microarranjos de codificação de ácidos nucleicos para componentes de óperons de rRNA ou outros locais taxonomicamente informativos.
[0131] Nas modalidades da invenção em que dois ou mais micro-organismos são isolados do material de planta árido então separado em isolados individuais, qualquer metodologia apropriada para separar um ou mais micro-organismos uns dos outros pode ser usada. No entanto, a título de exemplo, extratos microbianos preparados a partir do material de planta poderiam ser espalhados sobre placas de ágar, cultivados a uma temperatura apropriada por um período de tempo adequado e então resultar em colônias microbianas subsequentemente selecionadas e cultivadas em meios apropriados (por exemplo, matizados em placas frescas ou cultivados em meio líquido). As colônias podem ser selecionadas com base na morfologia ou qualquer outro critério de seleção apropriado, conforme será compreendido na técnica. A título de um exemplo adicional, meios seletivos podem ser usados.
[0132] O micro-organismo ou os micro-organismos podem ser colhidos (incluindo em sua forma isolada ou bruta) a partir das plantas (incluindo a rizosfera, conforme anteriormente descrito aqui) a qualquer momento apropriado. Em uma modalidade, eles são colhidos a qualquer momento após a germinação da planta. Por exemplo, eles podem ser isolados do período logo após a germinação (onde a sobrevivência nos primeiros dias após a germinação é uma questão, por exemplo: com raiz bacteriana e fúngica e apodrecimentos no colar), e em qualquer fase depois disso, dependendo do tempo necessário para que a planta cresça para evidenciar um benefício diferenciador que possibilite a sua seleção a partir de uma população de plantas (por exemplo, para diferenciar as 10 melhores entre 200 plantas).
[0133] O(s) inventor(es) observou(aram) que diferentes microorganismos podem associar-se a uma planta a diferentes fases da vida da planta. Assim, colher uma planta em diferentes períodos pode resultar em uma seleção de uma população de diferentes micro-organismos. Tais micro-organismos podem trazer um benefício específico ao aprimoramento da condição da planta, à sua sobrevivência e ao seu crescimento a momentos críticos ao longo de sua vida.
[0134] Em outra modalidade da invenção, no caso de os microorganismos que formam uma associação com a planta que permita uma transmissão vertical de uma geração ou propágulo para o próximo (por exemplo, associações endofíticas ou epifíticas de sementes ou associações endofíticas e epifíticas com plantas/propágulos multiplicados vegetativamente), os micro-organismos não podem ser isolados da(s) planta(s). Na conclusão de um método da invenção, um alvo ou uma planta selecionada pode ser multiplicada por semente ou vegetativamente (junto com os micro-organismos associados) para conferir o(s) benefício(s) às plantas "filhas" da próxima geração ou fase multiplicativa. De maneira semelhante, onde se deseja uma repetição sucessiva do método, o material da planta (a planta inteira, o tecido da planta, parte da planta) compreendendo um ou mais micro-organismos podem ser usado na etapa a) de qualquer repetição sucessiva.
Empilhamento
[0135] O(s) inventor(es) contempla(m) a obtenção de vantagens pelo empilhamento dos meios de seleção (os critérios da seleção) das plantas em rodadas repetidas do método da invenção. Isso pode permitir a aquisição de uma população de micro-organismos que pode ajudar a planta a ter um número de diferentes características desejáveis, por exemplo.
[0136] Nesta modalidade da invenção, o micro-organismo ou os micro-organismos adquiridos a partir de uma ou mais plantas selecionadas, conforme descrito anteriormente, são usados em uma segunda rodada ou ciclo do método. Na primeira rodada, uma ou mais plantas podem ter sido selecionadas com base na biomassa. Na segunda rodada, uma ou mais plantas podem ser selecionadas com base na produção de um composto específico. Os micro-organismos isolados da segunda rodada do método podem então ser usados em uma rodada subsequente, e assim por diante. Qualquer quantidade de critérios de seleção diferentes pode ser empregada em sucessivas rodadas do método, conforme desejado ou apropriado.
[0137] Em uma modalidade, o critério de seleção aplicado em cada repetição do método é diferente. No entanto, em outras modalidades da invenção o critério de seleção aplicado em cada rodada pode ser o mesmo. Poderia também ser o mesmo, mas aplicado a intensidades diferentes em cada rodada. Por exemplo, os critérios de seleção podem ser níveis de fibra e o nível de fibra necessário para que uma seja selecionada pode aumentar com as rodadas sucessivas do método. Os critérios seletivos podem aumentar ou diminuir em rodadas sucessivas em um padrão que pode ser linear, por etapas ou curvilíneo.
[0138] Deve-se também apreciar que em certas modalidades da invenção, em que um ou mais micro-organismo(s) forma(m) uma relação endofítica ou epifítica com a planta que permite uma transmissão vertical de uma geração ou propágulo para o próximo, os micro-organismos não precisam estar isolados da(s) planta(s). Na conclusão de um método da invenção, um alvo ou uma planta selecionada pode ser multiplicada por semente ou vegetativamente (junto com os micro-organismos associados) para conferir o(s) benefício(s) às plantas "filhas" da próxima geração ou fase multiplicativa. De maneira semelhante, onde se deseja uma repetição sucessiva do método, o material da planta (a planta inteira, o tecido da planta, parte da planta) compreendendo um ou mais micro-organismos podem ser usado na etapa a) de qualquer repetição sucessiva.
[0139] Deve-se apreciar ainda que dois ou mais critérios de seleção podem ser aplicados com cada iteração do método. Micro-organismos e composições contendo os mesmos
[0140] Além dos métodos descritos antes, a invenção refere-se aos micro-organismos selecionados, adquiridos ou isolados por meio desses métodos e composições compreendendo esses micro-organismos. Em sua forma mais simples, uma composição que compreende um ou mais microorganismos inclui uma cultura de micro-organismos vivos, ou de microorganismos em um estado vivo, mas inativo, incluindo culturas congeladas, liofilizadas ou secas. No entanto, as composições podem compreender outros ingredientes, como discutido abaixo.
[0141] A invenção também deve ser entendida com devendo compreender métodos para a produção de uma composição para dar meio ao crescimento, qualidade e/ou saúde da planta ou uma composição para suprimir ou inibir o crescimento, qualidade e/ou saúde da planta, sendo que o método compreende as etapas de um método contido neste documento antes da etapa descrita anteriormente e da etapa adicional de combinação de um ou mais micro-organismos com um ou mais ingredientes adicionais.
[0142] A "composição para dar meio ao crescimento, saúde, e/ou qualidade da planta" deve ser amplamente adotado para incluir composições que possam auxiliar no crescimento, saúde geral e/ou sobrevivência de uma planta, na condição de uma planta, ou auxiliar na manutenção ou promoção de alguma característica, qualidade ou traço desejado. É necessário incluir a manutenção ou alteração da produção de um ou mais metabólitos ou outro composto por uma planta bem como a alteração da expressão gênica e similares. A frase não deve ser considerada como a implicação de que a composição é capaz de dar meio ao crescimento, qualidade e/ou de saúde da planta por conta própria. No entanto, em uma modalidade, as composições são adequadas para esta finalidade. Composições exemplares deste aspecto da invenção incluem, entre outros, meio de crescimento da planta, suplementos minerais e micronutrientes da planta, adubos, fertilizantes, misturas de envasamento, inseticidas, fungicidas, meios para proteção contra a infecção ou infestação de pragas e doenças, meios de cultura de tecidos, revestimentos de sementes, meio hidropônico, composições que lhes conferem tolerância à seca ou estresse abiótico como toxicidade do metal, composições que modificam o pH do solo.
[0143] A "composição para inibir ou suprimir o crescimento, saúde e/ou qualidade da planta" deve ser considerada como incluindo amplamente composições que podem ser úteis na supressão ou inibição de uma ou mais características, qualidade e/ou característica de uma planta incluindo seu crescimento, saúde geral e/ou sobrevivência. É necessário incluir a manutenção ou alteração da produção de um ou mais metabólitos ou de outros compostos por uma planta bem como a alteração da expressão gênica e similares. A frase não deve ser considerada como a implicação de que a composição é capaz de suprimir ou inibir o crescimento, qualidade e/ou de saúde da planta por conta própria. No entanto, em uma modalidade, as composições são adequadas para esta finalidade. Composições exemplares deste aspecto da invenção incluem, entre outros, meio de supressão de crescimento da planta, herbicida, fertilizantes, misturas de envasamento, suplementos minerais e micronutrientes da planta, compostos, misturas, inseticidas, fungicidas, meios para proteção contra a infecção ou infestação de pragas e doenças, meios de cultura de tecidos, revestimentos de sementes, meio hidropônico, composições que lhes conferem tolerância à seca ou estresse abiótico como toxicidade do metal, composições que modificam o pH do solo.
[0144] Aqueles versados na técnica apreciarão com facilidade os tipos de ingredientes adicionais que podem ser combinados com um ou mais micro-organismos, tendo em conta a natureza da composição que deve ser feita, os micro-organismos que devem ser usados, e/ou o método de distribuição da composição a uma planta ou seu ambiente. No entanto, a título de exemplo, os ingredientes podem incluir transportadores de líquidos e/ou sólidos, conservantes microbianos, ativadores microbianos que induzem atividades metabólicas específicas, aditivos para prolongar a vida microbiana (como géis e argilas), pós-umectantes transportadores granulados, solo, areia, agentes conhecidos como sendo benéficos à sobrevivência microbiana e ao crescimento e à saúde geral de uma planta, turfa, matéria orgânica, materiais de enchimento orgânicos e inorgânicos, outros micro-organismos, agentes umectantes, nutrientes orgânicos e inorgânicos e minerais.
[0145] Essas composições podem ser feitas usando a metodologia padrão, levando em consideração a natureza dos ingredientes a serem usados.
[0146] As composições desenvolvidas a partir de métodos da invenção podem ser aplicadas a uma planta por qualquer número de métodos conhecidos pelos versados na técnica. Elas incluem, por exemplo: sprays; pós; grânulos; revestimento de sementes; pulverização de semente ou pó após aplicação; a germinação de sementes em um leito contendo concentrações adequadas da composição antes da germinação e plantio de mudas; perolados ou grânulos aplicados próximos às sementes ou à planta durante a sementeira ou plantação, aplicados a uma cultura existente através de um processo como perfuração direta; aplicação às estacas vegetais ou outros propágulos vegetativos, mergulhando a superfície de corte ou o propágulo em um substrato microbiano líquido ou em pó antes da plantação; aplicação ao solo como um "tratamento do solo" na forma de um spray, pó, grânulos ou composição de compostagem que pode ou não pode ser aplicada com fertilizantes vegetais antes ou após a sementeira ou plantação da lavoura; aplicação a um meio de cultura hidropônico; inoculação nos tecidos vegetais em condições axênicas através da injeção de composições ou inoculados através de um corte nesses tecidos, para o estabelecimento subsequente de uma relação endofítica com a planta que se estende até as sementes, ou tecidos propagativos, de modo que a planta pode ser multiplicada através de práticas agronômicas convencionais, juntamente com o micróbio endofítico beneficiando a planta.
[0147] Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende um ou mais micro-organismos listados na tabela 4. Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende um ou mais micro-organismos listados na tabela 3. Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende um ou mais microorganismos listados na tabela 2.
Métodos de produção de composições alternativas
[0148] Quando os micro-organismos são cultivados, eles podem produzir um ou mais metabólitos e que são passados para o meio no qual residem. Esses metabólitos podem conferir propriedades benéficas para as plantas.
[0149] Nesse sentido, a invenção também fornece um método para selecionar ou produzir uma composição capaz de conferir uma ou mais propriedade benéfica a uma planta, por exemplo, para dar meio ao crescimento, qualidade e/ou saúde da planta ou, por exemplo, suprimir ou inibir o crescimento, a qualidade e/ou a saúde de uma planta, ou identificar micro-organismos que são capazes de produzir essa composição. Em uma modalidade, a composição está substancialmente livre de microorganismos.
[0150] Em uma modalidade, o método é para a seleção de uma composição capaz de conferir uma ou mais propriedade benéfica para uma planta e compreender, pelo menos, as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos selecionados por um método descrito anteriormente neste documento em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separação de um ou mais micro-organismo de um ou mais meios após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente sem micro-organismos; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de uma ou mais composições da etapa c) se for observada conferência de uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas.
[0151] Em outra modalidade, o método é para a seleção de uma composição capaz que é capaz de conferir uma ou mais propriedades benéficas a uma planta e compreender as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos selecionados por um método do primeiro aspecto da invenção em um ou mais meios para formar uma ou mais culturas; b) inativação de uma ou mais culturas da etapa a) para fornecer uma ou mais composições contendo um ou mais micro-organismos inativados; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de uma ou mais composições da etapa c) se for observada conferência de uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas.
[0152] Em uma modalidade, o método é para a seleção de um ou mais micro-organismos que sejam capazes de produzir uma composição de que seja capaz de conferir uma ou mais propriedades benéficas a uma planta e compreender, pelo menos, as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos selecionados por um método do primeiro aspecto da invenção em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separação de um ou mais micro-organismo de um ou mais meios em uma ou mais culturas da etapa a) após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente sem microorganismos; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de um ou mais micro-organismos associados (ou, em outras palavras, usados para produzir) uma ou mais composições observadas para conferir uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas.
[0153] Outro método da invenção compreende pelo menos as etapas de: a) cultivo de um ou mais micro-organismos em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separação de um ou mais micro-organismo de um ou mais meios em uma ou mais culturas após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente sem micro-organismos; c) submissão de uma ou mais planta (incluindo, por exemplo, sementes, mudas, estacas e/ou respectivos propágulos) a uma ou mais composição da etapa b); d) seleção de um ou mais micro-organismos associados (ou, em outras palavras, usados para produzir) uma ou mais composições observadas para conferir uma ou mais propriedades benéficas a uma ou mais plantas; e e) uso de um ou mais micro-organismos selecionados na etapa d) na etapa um) de um método do primeiro ou do oitavo aspecto (e/ou relacionados) da invenção.
[0154] Em uma modalidade dos métodos dos dois parágrafos anteriores, a etapa b) dos métodos poderia ser substituída pela etapa b) inativando uma ou mais culturas da etapa a) para fornecer uma ou mais composição contendo um ou mais micro-organismos inativados e, usando então, esta composição na etapa c) do processo.
[0155] Como usado neste documento "inativar" uma ou mais culturas e "micro-organismos inativados" e termos similares devem ser considerados de maneira ampla para se referir a micro-organismos que são substancialmente inativados, fixos, mortos ou destruídos. O termo não deve ser considerando como uma referência a todos os micro-organismos que são inativados, mortos ou destruídos, no entanto, isto pode ser preferencial. Em uma modalidade, os micro-organismos são inativados, fixos, mortos ou destruídos na medida em que a replicação autossustentada não é mais mensurável usando técnicas conhecidas pelos versados na técnica.
[0156] Os micro-organismos podem ser inativados, fixos, mortos ou destruídos usando quaisquer técnicas apropriadas na técnica. No entanto, a título de exemplo, é possível utilizar agentes químicos e/ou meios físicos para fazer isso. Em uma modalidade, as células são lisadas. Em outra modalidade, as células são fixadas por meios químicos, a fim de processar os organismos não viáveis, mas manter a sua integridade estrutural.
[0157] Como usado neste documento, uma "composição substancialmente sem micro-organismos" deve ser considerada ampla e não deve ser interpretada como referindo que nenhum micro-organismo está presente, embora possa ser preferencial.
[0158] Em determinadas modalidades desses métodos, os micro-organismos são cultivados em duas ou mais (preferencialmente um grande número, por exemplo, de pelo menos cerca de 10 a até aproximadamente 1000) culturas mistas usando meios que pode dar meio ao crescimento de uma grande variedade de micro-organismos. Quaisquer meios apropriados conhecidos na técnica podem ser usados.
[0159] No entanto, a título de exemplo, os meios de crescimento podem incluir TSB (caldo de soja tríptica), caldo Luria-Bertani (LB) ou caldo R2A. Em outra modalidade, os meios seletivos ou de enriquecimento que são capazes de dar meio ao crescimento dos micro-organismos com uma matriz de propriedades separadas, mas desejáveis, podem ser usados. A título de exemplo, os meios de enriquecimento referidos neste documento podem ser usados.
[0160] Os micro-organismos podem ser cultivados nos meios em qualquer período desejado. Após a cultura, os micro-organismos são separados dos meios e são armazenados para uso posterior. Uma composição separada também é resultante. Uma ou mais plantas em um meio de crescimento adequado estão sujeitas à composição (usando qualquer metodologia conhecida, ou metodologia descrita anteriormente neste documento). Após um período de tempo, o crescimento das plantas é avaliado e as plantas selecionadas (conforme descrito anteriormente neste documento, por exemplo). As plantas são preferencialmente selecionadas com base no tamanho. No entanto, outros critérios de seleção referidos neste documento podem ser utilizados.
[0161] Em uma modalidade, os micro-organismos que produzem o subconjunto de composições associado às plantas selecionadas são recuperados do armazenamento. Duas ou mais culturas separadas dos micro-organismos podem, então, ser misturadas entre si e separadas em duas ou mais subculturas cultivadas em dois ou mais meios diferentes.
[0162] Este processo pode ser repetido iterativamente quantas vezes forem consideradas eficazes, com etapas progressivas que fazem o refino para menos meios e uma menor diversidade de micro-organismos até que um efeito desejável sobre as plantas de crescimento seja conseguido com uma mistura de micróbios que possam ser identificados, cultivados e armazenados indefinidamente como um inóculo inicial padrão para a produção da composição.
[0163] As composições deste aspecto da invenção podem ser usadas ou formuladas por conta própria ou em combinação com um ou mais ingredientes adicionais.
[0164] Deve ser apreciado que a metodologia geral anteriormente descrita neste instrumento pode ser aplicável a este aspecto da invenção, incluindo, entre outros, meios de crescimento, plantas, micro-organismos, temporização, processamento iterativo e suas combinações.
Metodologia Adicional
[0165] A metodologia a seguir pode ser aplicada a um método da invenção para a identificação de um ou mais micro-organismos como anteriormente descrito neste instrumento.
[0166] A Figura 1 mostra um sistema 10 de acordo com uma modalidade da invenção. O sistema 10 inclui solicitantes 11, processador de solicitação 12, instalação de crescimento 13, banco de dados ou biblioteca 14 e depositário 15.
[0167] A Figura 2 apresenta um fluxograma que ilustra um método 20 de acordo com uma modalidade da invenção. As etapas apresentadas na Figura 2 serão descritas com referência ao sistema 10 mostrado na Figura 1.
[0168] Este aspecto da invenção é descrito em termos de identificação de um ou mais micro-organismos que podem conferir uma ou mais propriedades desejadas a uma ou mais plantas, com referência específica ao primeiro e ao oitavo aspectos (e/ou similares) da invenção.
[0169] No entanto, deve ser apreciado que são igualmente aplicáveis à identificação de uma ou mais composições que podem conferir uma ou mais propriedades desejadas a uma ou mais plantas, ou a um ou mais micro-organismos que produzem uma composição que pode conferir uma ou mais propriedades desejadas a uma ou mais planta, como anteriormente descrito neste documento, e são resumidos no sétimo e no oitavo aspectos (e/ou similares) da invenção. Por conseguinte, salvo indicação em contrário, ao descrever as modalidades da invenção nesta seção de especificação, a referência ao primeiro aspecto da invenção deve ser considerada para incluir também a referência ao sétimo e ao oitavo aspectos (e/ou similares) da invenção e referência a um ou mais micro-organismos devem ser considerada para incluir referência a uma ou mais composições.
[0170] O método começa na etapa 21 com um solicitador 11 identificando uma planta (ou uma classe ou grupo de plantas). As razões pelas quais as plantas específicas ou tipos de plantas podem ser identificados serão evidentes para aqueles versados na técnica. No entanto, a título de exemplo, pode ser constatado que uma planta indicada em geral por ter uma alta taxa de crescimento esteja crescendo a taxas mais baixas ou que não esteja crescendo, podendo ser simplesmente um desejo de melhorar as taxas de crescimento existentes ou um desejo de introduzir uma planta a um clima / ambiente / região geográfica diferente. A invenção não está limitada a conferir melhorias para plantas específicas e pode ser usada para inibir o crescimento ou afetar adversamente as plantas.
[0171] Na etapa 22, o solicitante 11 envia a planta e/ou a identidade da mesma a um processador de solicitação 12. O solicitante 11 pode fornecer ainda informações relevantes, como por que ou quais propriedades que eles estão tentando melhorar. Enquanto apenas o processador de solicitação 12 é mostrado, será apreciado que mais de um pode ser fornecido no sistema 10.
[0172] Se um solicitante 11 identificar uma classe ou grupo de plantas, mais de uma variedade de planta pode ser avaliada. Alternativa ou adicionalmente, a seleção de uma ou mais variedades de plantas pode ser feita em outro lugar dentro do sistema de 10 com base no grupo ou classe identificada, incluindo avaliação posterior de variedades diferentes, incluindo o uso de micro-organismos diferentes em conformidade com os métodos da invenção.
[0173] As solicitações podem ser convenientemente recebidas pela internet através de um navegador da web, embora a invenção não esteja limitada aos mesmos. O uso de um navegador da web pode, adicional ou alternativamente, ser usado para permitir que um solicitante 11 veja os relatórios sobre os progressos que estão sendo feitos em resposta a sua solicitação. Por exemplo, medidas de crescimento podem ser fornecidas.
[0174] Na etapa 23, o processador de solicitação 12 recebe e processa a solicitação iniciando, essencialmente, a realização do método para a seleção de um ou mais micro-organismos de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Observe que o processador de solicitação 12 pode ou não pode realizar ativamente o método do primeiro aspecto ou pode apenas realizar partes do mesmo. De acordo com as modalidades específicas, o processador de solicitação 12 pode agir como um intermediário ou agente entre o solicitante 11 e as partes capazes de realizar o método do primeiro aspecto. Além disso, arranjos diferentes podem ser feitos em resposta às diferentes solicitações. Por exemplo, para uma solicitação, o ambiente em torno do processador de solicitação 12 pode ser adequado para avaliar uma planta específica, mas inadequado para outra, necessitando de assistência de uma instalação de terceiros. Isto pode ser devido a um desejo de testar um tipo específico de solo, altitude ou clima. Outros fatores também serão aparentes, embora seja apreciado que ambientes "artificiais" possam ser usados. Além disso, vários graus de interação com o usuário podem ocorrer no processador de solicitação 12. De acordo com uma modalidade, um processador de computador seleciona parâmetros ou condições para um estudo com base na entrada de dados por um solicitador 11. Como será apreciado, o fornecimento de uma solicitação de informações estruturadas pode contribuir para efetuar isso e, se necessário, pode ser feita referência aos bancos de dados, incluindo o banco de dados 14.
[0175] Na etapa 24, os parâmetros do processo de avaliação são selecionados. Por exemplo, pode ser feita referência ao banco de dados 14 para micro-organismos que podem fornecer a melhoria desejada para as plantas. Enquanto foram apresentados poucos dados até o momento na técnica sobre micro-organismos com associações benéficas a variedades de planta específicas, isso será aperfeiçoado através de uma operação contínua dos métodos da invenção e armazenados no banco de dados 14. Outros parâmetros como tipo(s) de plantas e condições ambientais também podem ser selecionados.
[0176] Na etapa 25, a solicitação (ou partes dela) e parâmetros de avaliação são enviados à instalação em crescimento 13 que pode obter micro-organismos apropriados do depósito 15. Eles podem ou não ter sido anteriormente identificados. Enquanto apenas uma instalação em crescimento 13 e um depósito 15 são mostrados, será apreciado que a invenção não é tão limitada.
[0177] Além disso, quaisquer dois ou mais processadores de solicitação 12, instalação em crescimento 13, banco de dados 14 e depósito 15 podem ser co-localizados e/ou estarem sob o mesmo controle.
[0178] Na etapa 26, um processo de seleção é realizado, preferencialmente de acordo com o método de seleção do primeiro aspecto.
[0179] Na etapa 27, uma resposta é enviada para a solicitação. Uma resposta pode ser enviada ao solicitante 11 e/ou a terceiros e incluir, preferencialmente, pelo menos um subconjunto dos resultados gerados na etapa 26, identificação de planta(s), planta(s), identificação de micro- organismo(s), micro-organismo(s) ou planta(s) fornecida(s) em associação com micro-organismos, nomeadamente aqueles que foram mostrados como oferecendo benefícios na etapa 26.
[0180] Na etapa 28, o banco de dados 14 pode ser atualizado com os resultados do processo seletivo da etapa 26. Esta etapa pode ser realizada antes da etapa 27, incluindo, periodicamente, ou em vários outros estágios que o processo de seleção é conduzido. Preferencialmente, pelo menos detalhes de novas associações benéficas entre planta(s) e microorganismos são registrados. Será apreciado que associações incompatíveis ou menos benéficas também serão preferencialmente registradas, ao longo do tempo, construindo uma estrutura de conhecimento de plantas e microorganismos.
[0181] Será apreciado que uma ou mais etapas da Figura 2 podem ser omitidas ou repetidas. Por exemplo, a instalação em crescimento 13 pode gerar resultados na etapa 26 e, em resposta aos mesmos, uma ou mais etapas 21 a 26 podem ser repetidas.
[0182] Assim, a invenção fornece meios e métodos para melhorar a(s) planta(s) (ou crescimento ou outras características). Isto é alcançado, permitindo que um solicitante 11 em uma primeira região geográfica (por exemplo, país) ou outro ambiente definido (por exemplo, parâmetros ou características que afetam as condições de crescimento como solo, salinidade ou acidez) para acessar a biodiversidade microbiológica não presente ou de presença limitada na primeira região para efeitos de melhoria de planta da primeira ou de outra região. A outra região pode ser um país estrangeiro, mas pode definida, de outro modo, pelas características daquele ambiente que afetam uma planta, ao invés de serem definidas pelas fronteiras políticas. Consequentemente, a invenção pode permitir que um solicitante obtenha os efeitos benéficos de micro- organismo(s) específico(s) em determinada(s) planta(s) em uma primeira região, apesar de os micro-organismos não poderem estar presentes ou terem presença limitada na primeira região.
[0183] Uma implementação exemplar da invenção é apresentada abaixo. 1. Uma empresa, como por exemplo, na Nova Zelândia (empresa nacional), celebra uma relação contratual com uma segunda empresa, por exemplo, estrangeira (empresa estrangeira). 2. A empresa no exterior concorda em enviar sementes, estaquias ou outros propágulos vegetais (cultivo estrangeiro) para a empresa nacional dos cultivos da planta adaptados aos seus próprios ambientes, ou aos outros países estrangeiros, com o intuito de obter acesso a elementos da biodiversidade microbiana terrestre e marinha da Nova Zelândia que são capazes de formar associações planta-micro-organismo benéficas com o cultivo estrangeiro. 3. A natureza do benefício pode abranger maior produtividade da planta, por exemplo, através de um ou mais dos itens dispostos a seguir, entre outros: aumento da raiz ou da massa foliar, ou através do aumento da eficiência na utilização de nutrientes através da fixação de nitrogênio por diazatróficos como Klebsiella ou Rhizobium, ou pela liberação de nutrientes vegetais do solo, como fosfatos lançados do solo através da produção de fitases microbianas, ou através de melhorias no fenótipo vegetal, por exemplo, data de floração, ou mudanças na forma física, por exemplo, cor, frequência da raiz ou da ramificação foliar ou mudanças no perfil químico, incluindo compostos associados ao gosto, cheiro ou propriedades que tornam a planta adequada para uma finalidade específica. 4. Na Nova Zelândia, a empresa nacional identifica quais micro-organismos indígenas podem formar uma associação com a planta de estrangeira, expondo a semente aos micro-organismos, com ou sem o conhecimento de seus prováveis efeitos sobre a planta, pelo método de germinação da semente e crescimento da planta em um material em crescimento que assegura o contato da planta durante seu crescimento com micro-organismos indígenas através de revestimento de sementes, inoculação direta em ou plântulas em germinação e/ou contaminação do meio em crescimento. A invenção não está limitada a este acordo ou metodologia. Por exemplo, pode ser aparente que os micro-organismos presentes no solo que não na Nova Zelândia podem oferecer benefícios e testes podem ser realizados nessas regiões além ou em vez da Nova Zelândia. Além disso, podem ser criados ambientes artificiais. Referindo-se ao exemplo anterior, ele pode ser alcançado pela obtenção de solo e/ou micro-organismos dessas regiões e realização dos testes, por exemplo, na Nova Zelândia. Como será evidente, essas modalidades podem incluir provisão para controle artificial das condições climáticas entre outros parâmetros. Assim, a invenção não está limitada à realização de testes em uma região com base em seus micro-organismos indígenas - os microorganismos podem ser artificialmente introduzidos a fim de realizar testes em outros lugares diferentes do ambiente natural dos micro-organismos. 5. O período de crescimento e as condições físicas sob as quais eles ocorrem pode variar amplamente de acordo com a espécie da planta e as características de melhoria da planta específica, inclusive com base em parâmetros desejados ou especificados pela empresa estrangeira. Depois do período relevante do crescimento da planta, a natureza das associações possíveis planta-micro-organismos pode ser determinada pela avaliação microbiológica para determinar se os micro-organismos formaram uma associação endofítica, epífita ou rizosférica com a cultura estrangeira. 6. Se tal(ais) associação(ões) for(em) comprovada(s), os micro-organismos formam uma coleção de micro-organismos (por exemplo, indígena da Nova Zelândia) capazes de se associar à cultura (por exemplo, estrangeira). 7. Em uma modalidade da invenção, os isolados microbianos da coleção podem, por exemplo, estar revestidos em sementes, inoculadas em sementes ou plântulas, ou inoculadas em um meio de crescimento que pode ou não ser estéril. 8. Após um período adequado, as plantas são avaliadas quanto à melhora da raiz e ao crescimento foliar ou a outras características desejadas concebidas para identificar as associações planta-micro- organismo mais capazes de beneficiar a planta da maneira desejada pela empresa estrangeira. 9. Exemplos de critérios de seleção são apresentados antes, onde parâmetros idênticos do segundo ambiente estrangeiro não estão presentes na região nacional ou de teste (ou seja, da Nova Zelândia no exemplo), parâmetros semelhantes mais similares aos do ambiente exterior e que podem ser considerados aceitáveis para a empresa estrangeira podem ser selecionados. Como mencionado no item 4 acima, a invenção também inclui a introdução de material estrangeiro ou a criação de condições na região nacional ou de teste. 10. As etapas que envolvem o crescimento de uma ou mais plantas na presença de um ou mais micro-organismos, selecionando uma ou mais plantas com características desejadas e adquirindo micro-organismos que formam uma associação com a planta serão repetidas uma ou mais vezes. 11. Os micro-organismos de elite que apresentam benefício comercialmente significativo para o crescimento do cultivo estrangeiro são identificados por este processo e podem ser enviados para a empresa no exterior para mais testes e seleção no ambiente estrangeiro. 12. Ainda em outra modalidade, a empresa no exterior irá concordar que os micro-organismos encontraram no, nas sementes, estaquias ou propágulos do cultivo estrangeiro serão adicionados à coleção da empresa nacional para ampliar a coleção para utilização tanto naquele cultivo quanto em outros cultivos estrangeiros recebidos para testes similares de outras empresas.
[0184] Em uma modalidade alternativa, os isolados microbianos capazes de formar associações planta-micro-organismo com o cultivo estrangeiro, ou seja, a coleção, são enviadas para a segunda empresa para teste e seleção, de modo que os itens 7-11 acima sejam realizadas por e/ou nos terrenos da segunda empresa. Isso pode ser realizada por ou sob o controle da primeira empresa.
[0185] Como outra alternativa, ao invés da identificação e do uso de micro-organismos predeterminados de uma coleção, a empresa nacional pode simplesmente expor a semente aos micro-organismos indígenas, com ou sem o conhecimento de seus prováveis efeitos sobre a planta, por exemplo, pela germinação das sementes e crescimento da planta em um material de crescimento que assegura o contato da planta durante seu crescimento com micro-organismos indígenas através de revestimento de sementes, inoculação direta na semente ou germinação de plântulas e/ou contaminação do meio de crescimento médio ou de outra forma. Como ficará evidente, a empresa nacional pode, adicional ou alternativamente, providenciar testes semelhantes em outras regiões, onde os mesmos ou diferentes micro-organismos podem estar presentes. O período de crescimento e as condições físicas sob as quais eles ocorrem pode variar amplamente de acordo com a espécie da planta e as características específicas da planta desejadas pela empresa estrangeira. Após um período de crescimento da planta, a natureza das associações planta- micro-organismo possíveis pode ser determinada de modo semelhante ao descrito acima.
EXEMPLOS
[0186] A invenção é adicionalmente descrita com referência aos seguintes exemplos não limitantes. Exemplo 1. Identificar micro-organismos capazes de melhorar o teor de açúcar de culturas forrageiras como azevém: Etapa 1. Sementes de azevém não tratadas são plantadas em uma ampla variedade de solos em potes pequenos. Os solos podem incluir alterações adicionais, compreendendo culturas puras de micro-organismos, misturas de micro-organismos ou de materiais contendo micro-organismos provenientes de outras fontes. Etapa 2. Após um período adequado de crescimento, por exemplo, 1 mês, as plantas são lavadas fora do solo e os micro-organismos são isolados das raízes e caules/folhagem, tanto como isolados individuais em cultura pura ou como populações mistas, por exemplo, como uma suspensão microbiana do esmagamento da raiz aquosa e/ou do esmagamento do caule/foliar. Etapa 3. Os micro-organismos são então adicionados a um meio de crescimento da planta onde sementes de azevém não tratadas são plantadas. Alternativamente, os micro-organismos são misturados em um material de revestimento de sementes adequado, por exemplo, um gel, e são revestidos em sementes antes de serem plantados em um meio de planta similar. Alternativamente, as sementes são geminadas e então expostas a micro-organismos por um curto período (geralmente entre 1 a 24 horas para maximizar a chance de que os micróbios possam formar uma associação endofítica ou epífita com a planta em germinação) e, em seguida, são plantadas em um meio de crescimento similar. Em cada um desses casos o meio de cultura pode ser inicialmente estéril, embora isso não seja essencial. Etapa 4. Após um período de crescimento adequado, por exemplo, 46 semanas, o crescimento foliar é avaliado e teor de açúcar na folhagem esmagada é determinado usando um refratômetro ou outro método conhecido pelos versados na técnica. As plantas com os valores mais altos quanto ao rendimento foliar e/ou teor de açúcar são selecionadas, e sua raiz e micro-organismos foliares são isolados e preparados como na Etapa 2. O processo da etapa 2 para a etapa 3 pode então ser repetido iterativamente, com ou sem modificação dos critérios de seleção quanto ao teor de açúcar em relação ao rendimento foliar. Etapa 5. Após este processo iterativo ter sido conduzido até o ponto em que a melhoria no teor de açúcar é considerada suficiente, as plantas de melhor desempenho são selecionadas e os micro-organismos associados a elas são isolados e usados para desenvolver um produto comercial que melhora o teor de açúcar de azevém. Exemplo 2. Identificar micro-organismos capazes de melhorar o perfilhamento de plantações de grãos como o trigo:
[0187] No caso de variedades de trigo de inverno, principalmente semeadas no hemisfério norte, pode ser importante selecionar as plantas que exibem perfilhamento precoce após exposição de sementes a um meio de crescimento contendo micro-organismos em condições de luz e temperatura similares àquelas vividas por sementes de trigo de inverno no hemisfério norte, já que o perfilhamento precoce é uma característica relacionada à sobrevivência do inverno, crescimento e eventual rendimento do grão no verão. Etapa 1. Sementes de trigo não tratadas são plantadas em uma ampla variedade de substratos microbianos em potes pequenos. Os solos podem incluir alterações adicionais, compreendendo culturas puras de micro-organismos, misturas de micro-organismos ou de materiais contendo micro-organismos provenientes de outras fontes. Etapa 2. Após um período adequado de crescimento, por exemplo, 1 mês, as plantas são lavadas fora do solo e os micro-organismos são isolados das raízes e caules/folhagem, tanto como isolados individuais em cultura pura ou como populações mistas, por exemplo, como uma suspensão microbiana do esmagamento da raiz aquosa e/ou do esmagamento do caule/foliar. Etapa 3. Os micro-organismos são então adicionados a um meio de crescimento da planta onde sementes de trigo não tratadas são plantadas. Alternativamente, os micro-organismos são misturados em um material de revestimento de sementes adequado, por exemplo, um gel, e são revestidos em sementes antes de serem plantados em um meio de planta similar. Alternativamente, as sementes são geminadas e então expostas a micro-organismos por um curto período (geralmente entre 1 a 24 horas para maximizar a chance de que os micróbios possam formar uma associação endofítica ou epífita com a planta em germinação) e, em seguida, são plantadas em um meio de crescimento similar. Em cada um desses casos o meio de cultura pode ser inicialmente estéril, embora isso não seja essencial. Etapa 4. O perfilhamento é avaliado após um período adequado de crescimento. As plantas com os primeiros perfilhos e/ou o maior número de perfilhos durante um período de tempo específico, e sua raiz e microorganismos foliares são isolados e preparados como na Etapa 2. O processo da etapa 2 para a etapa 3 pode então ser repetido iterativamente, com ou sem modificação dos critérios de para perfilhamento em relação ao rendimento de grãos. Etapa 5. Após este processo iterativo ter sido conduzido até o ponto em que a melhoria no perfilhamento é considerada suficiente, as plantas de melhor desempenho são selecionadas e os micro-organismos associados a elas são isolados e usados para desenvolver um produto comercial que melhora a velocidade e o grau do perfilhamento do trigo. Exemplo 3. Uso do processo para selecionar endófitos transmitidas por semente, conferindo uma característica benéfica de cultura
[0188] Forrageiras gramíneas que expressam características benéficas como resistência a insetos e melhor tolerância a estressores bióticos e abióticos através de cepas do fungo transmitido por semente da espécie Neotyphodium foram amplamente adotadas pelos agricultores na Nova Zelândia e em outros lugares. Seria desejável estender os benefícios das características similares às expressas por este fungo transmitido por semente e outras espécies semelhantes na família fúngica, para uma gama mais ampla de micróbios endofíticos transmitidos por semente apresentando, assim, acesso a uma gama muito maior de características benéficas da plantação. Etapa 1. Sementes de azevém não tratadas são plantadas em uma ampla variedade de solos em potes pequenos. Os solos podem incluir alterações adicionais, compreendendo culturas puras de micro-organismos, misturas de micro-organismos ou de materiais contendo micro-organismos provenientes de outras fontes. Etapa 2. Após um período adequado de crescimento, as plantas são lavadas fora do solo, a superfície é esterilizada com uma combinação de etanol e hipoclorito de sódio ou outros métodos conhecidos pelos versados na técnica e os micro-organismos endofíticos (endófitos) são isolados de tecidos internos das raízes e caules/folhagem e sementes, como isolados individuais em cultura pura ou como populações misturadas, por exemplo, como uma suspensão microbiana de um esmagamento de raiz aquosa e/ou esmagamento do caule/foliar. Etapa 3. Os micro-organismos endofíticos são então adicionados a um meio de crescimento da planta em que sementes de azevém esterilizadas em superfície pré-germinada são plantadas (sementes verificadas quanto à esterilidade pela germinação em placas de ágar de nutriente). Alternativamente, os micro-organismos são misturados em um material de revestimento de sementes adequado, por exemplo, um gel, e são revestidos em sementes esterilizadas na superfície antes de serem plantados em um meio de planta similar. Alternativamente, as sementes esterilizadas na superfície são geminadas em placas de ágar de nutriente, verificadas quanto à esterilidade e, em seguida, são expostas a microorganismos por um curto período (geralmente entre 1 a 24 horas para maximizar a chance de que os micróbios possam formar uma associação endofítica ou epífita com a planta em germinação) e, em seguida, são plantadas em um meio de crescimento similar. Em cada caso, o meio de crescimento pode ser inicialmente estéril, embora isso não seja essencial e outros micro-organismos podem ser aplicados ao meio de crescimento e/ou à planta. Etapa 4. Após um período de crescimento adequado, por exemplo, 4 a 6 semanas, as plantas são avaliadas quanto à expressão do fenótipo desejado. Os fenótipos podem incluir melhoria na cor, forma da planta, expressão do metabólito ou similar. Etapa 5. É permitido que plantas selecionadas cresçam em frente ao ponto de conjunto de sementes. Neste estágio, um subconjunto de sementes de cada planta pode ser triado quanto ao transporte endófito usando métodos dependentes ou independentes de cultura. As sementes remanescentes das plantas que produzem resultados positivos na triagem são germinadas e plantadas sem adição microbiana em uma outra rodada de seleção para enriquecer o transporte endófito e a capacidade de transmitir o fenótipo desejado como descrito nas etapas 3 a 5.
[0189] Alternativamente, os micróbios endofíticos podem ser adquiridos a partir de um subconjunto de sementes de cada planta isoladas a partir de sementes esterilizadas na superfície ou como explantes, ou como uma suspensão microbiana preparada, por exemplo, pelo esmagamento da semente esterilizada na superfície em solução aquosa. Os isolados e preparações são usados como um inóculo para plantas provenientes de sementes esterilizadas da superfície conforme descrito na etapa 3.
[0190] Em outra variação do método, a seleção para a transmissão da semente do traço pode ocorrer na geração seguinte pela esterilização na superfície de um subconjunto de sementes (com ou sem triagem prévia) de plantas selecionadas da geração anterior e permitindo que elas germinem e cresçam durante o período em que a triagem fenotípica é realizada como geralmente descrito nas etapas 3 e 4 (ou seja, antes do conjunto de sementes). As plantas que apresentam o fenótipo desejado nesta geração (ou seja, pela transmissão da semente), são selecionadas e explantes de tecido são preparados, e/ou micróbios são isolados de tecidos vegetais, e/ou suspensões microbianas brutas são feitas pelo esmagamento da folhagem de superfície ou das raízes em uma solução aquosa. Um ou uma combinação destas preparações são usadas como um inóculo para outras rodadas iterativas de crescimento e seleção e colheita de sementes, como descrito nas etapas 3 a 5. Alternativamente, as sementes remanescentes das plantas que apresentam característica de transmissão por semente desejada podem ser germinadas e plantadas sem adição microbiana em outra rodada de seleção para enriquecer o transporte endófito e a capacidade de transmitir o fenótipo desejado como descrito nas etapas 3 a 5. Etapa 6. No final das rodadas sucessivas deste processo iterativo, conforme determinado pela geração de um fenótipo transmitido por sementes desejado, as melhores linhagens de sementes são selecionadas para avaliação comercial e desenvolvimento do cultivo. Exemplo 4. Uso do processo para adquirir micróbios capazes de melhorar o crescimento de azevém (Lolium perenne).
[0191] O azevém cresce, frequentemente, em solo fértil e é uma plantação importante na produção de forragem. Seria desejável, portanto, usar o processo de seleção direcionada para identificar um grupo de micróbios que são capazes de aumentar a biomassa de azevém em um substrato fértil sem pressões de seleção experimentalmente impostas.
[0192] Setenta e três amostras (tratamentos) do solo da Ilha Norte da Nova Zelândia foram usadas como a fonte da diversidade microbiana para o início do processo. Amostras do solo foram misturadas com areia: vermiculite (1: 1 ou 1:2), como necessário para aumentar a drenagem e o volume. As amostras foram colocadas em dez replicados de 28 ml e são plantadas com sementes de azevém (cultivo de Lolium perenne One50, endófito nulo). As sementes foram regadas com uma mangueira de nebulização até a germinação, e então banhadas até a saturação três vezes por semana, com rega adicional conforme necessário para evitar que as plântulas sequem. Para as condições de crescimento padrão restantes, ver a Tabela 1. Tabela 1: Condições de crescimento padrão
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Seleção da rodada 1
[0193] Sessenta dias após a semeadura (DAS), quatro plantas de cada amostra foram selecionadas e processadas para fornecer um inóculo microbiano para a primeira rodada da seleção. A folhagem foi cortada 2 cm acima do substrato e descartada. As raízes e caules anexados foram chacoalhados para a remoção de terra, lavadas para a remoção da maior parte dos fragmentos de terra e drenadas antes dos caules e raízes serem combinados em sacos plásticos. Este material foi então esmagado dentro de um saco com 10 mls de água adicionados para suspender o material. A parte líquida de uma suspensão resultante foi usada como o inóculo microbiano inicial. Sementes esterilizadas na superfície foram embebidas por uma hora em 1 ml da suspensão de raiz para cada amostra. Sementes embebidas foram plantadas em tubos de 28 ml (15 repetições para cada tratamento) contendo mistura para vasos (Kings Plant Barn, a Nova Zelândia; adubo granulado, musgo de turfa, pedra-pomes e fertilizantes de liberação lenta) umedecidas com água da torneira. A suspensão de raiz remanescente consistiu de um volume final suficiente com SDW e 2 ml foi pipetado por cima das sementes plantadas. Depois de plantadas, as sementes foram finamente cobertas com um substrato seco fresco. Os potes foram posteriormente regados com água da torneira 3 vezes por semana. Seleção da rodada 2
[0194] Em DAS 118 a folhagem foi colhida, pesada e os tratamentos selecionados para fornecer o inóculo microbiano para a segunda rodada de seleção. Apenas as 8 maiores plantas de cada um dos 21 tratamentos com o maior peso foliar médio dos 73 tratamentos originais foram escolhidas para processamento. Além disso, quatro tratamentos com compósito de quatro plantas, cada um foi criado a partir de dezesseis plantas individuais com a maior biomassa foliar. A folhagem foi cortada em 2 cm acima do nível do substrato e pesada. As raízes e caules basais de cada planta foram agitadas sem substrato e, em seguida, foram lavadas, combinadas em sacos de plástico, esmagadas e utilizadas para inocular a segunda rodada de seleção da mesma forma como descrito para a rodada de seleção 1, com a exceção que 30 replicados foram plantados para cada tratamento e o volume final do inóculo foi 65 mls. Seleção da rodada 3
[0195] As plantas da segunda rodada de seleção foram colhidas em 39 DAS. A folhagem foi cortada 2 cm acima do substrato, pesada e descartada. As três maiores plantas dos 15 tratamentos principais foram selecionadas para criar o inóculo para a rodada de seleção 3. As raízes e caules foram esmagados como descrito acima e usados para 30 replicados de cada tratamento. Isolamento microbiano
[0196] A folhagem da seleção da rodada 3 foi colhida e pesada em 63 DAS e as maiores plantas dos cinco tratamentos com pesos foliares médios maiores foram selecionadas para apresentar inóculo para isolamentos microbianos. As raízes e caules de 2 cm foram lavados e, em seguida, esmagados em sacos plásticos, conforme descrito anteriormente. Um pequeno volume do inóculo foi retirado para fazer uma série de diluição dez vezes chapeada sobre R2A. Os pedaços de raiz triturada de cada uma das preparações também foram inoculados em meio de malato semissólido N-deficiente (Eckford et al., 2002. Após 2 a 4 dias de incubação à temperatura ambiente, as películas resultantes foram escoadas e espalhadas em ágar R2A para isolamento de colônias individuais. Uma etapa de isolamento seletivo de actinomicetos foi realizada na qual o etanol foi adicionado à suspensão de raiz a uma concentração final de 25%, incubada à temperatura ambiente (RT) por 30 min e, em seguida, foi chapeada sobre R2A. Para isolamentos de fungos, os pedaços de raiz esmagada foram incorporados ao PDA fundido (arrefecido a 45°C). Após 24 a 72 h de incubação a 25°C as placas R2A e PDA foram examinadas sob um microscópio de dissecação. Colônias de bactérias e fungos foram avaliadas pela abundância, agrupamento de acordo com a morfologia e isolados representativos foram selecionados e estriadas para a obtenção de pureza em placas R2A e PDA. Métodos padrão foram usados para identificar isolados a um nível de espécie através da extração de DNA, amplificação de PCR e sequenciamento de genes 16S rRNA (bactérias) ou região ITSS (fungos). Avaliação microbiana
[0197] A avaliação microbiana foi realizada em 61 isolados individuais e 28 consórcios escolhidos com base em sua abundância, diversidade de características de espécie. Os isolados selecionados foram espalhados em um R2A (bactéria) ou PDA (fungos), encubados a 25°C por 72 horas, e então raspados da superfície ágar com SDW adicionado em contêineres esterilizados. As bactérias foram colhidas em 2 ml de SDW. Os fungos foram peneirados através de um coador de chá estéril com 5-10 ml de SDW para remover grupos de micélios e pedaços de ágar anexados. Diluições em série de células colhidas foram chapeadas e incubadas a 25°C por 24 horas para estimar o número de unidades de formação de Colônia (CFU) em cada suspensão. Volumes de diluição correspondentes a 1x107 (bactéria) e 1x103 (fungos) CFU por ml foram calculados a partir dessas contagens de placa. Sementes de azevém (One50 nil endófito) foram embebidas em água por uma hora em suspensões de micróbio, e então plantadas individualmente em tubos de 28 ml contendo mistura para vasos umedecida. Dois mililitros de suspensão isolada formam pipetados sobre as sementes que foram, em seguida, cobertas com o substrato. Todas as plantas foram posteriormente regadas com água da torneira 3 vezes por semana. A folhagem foi cortada e pesada a 41 DAS. Raízes foram lavadas, secas com papel mata-borrão e pesadas. Os tratamentos microbianos que resultaram em um ganho de biomassa nas platas de pelo menos 5% sobre os controles livres de micróbios são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Tratamentos microbianos associados com aumento de biomassa de azevém
Figure img0002
FW= peso de folhagem fresca; RW=peso de raiz fresca; BM=biomassa da planta (raízes + folhagem) Itálicos indicam um IOC significativo (aumento sobre controles; LSD de Fisher) ID - Identificação putativa baseada na correspondência mais próxima da sequência em bancos de dados RDPII e/ou NCBI
[0198] Os três tratamentos microbianos que resultaram em um aumento significativo em pesos foliares (LSD de Fisher) foram todos isolados do sítio que produziu o maior aumento de peso foliar na terceira rodada de seleção.
[0199] Estes resultados fornecem evidências de que o método de seleção dirigida de micróbios descrito pela presente invenção é capaz de identificar um conjunto de micróbios que melhoram significativamente o crescimento do azevém cultivado sob condições favoráveis. Exemplo 5 Uso de processos para identificar os micróbios capazes de melhorar o conteúdo de carboidratos solúveis em água de manjericão (Ocium basilicum).
[0200] Amostras de solo de 43 sítios na Ilha Norte da Nova Zelândia foram usadas como uma fonte de diversidade microbiana para este processo.
[0201] As amostras foram misturadas com areia:vermiculita (1:2), como necessário para aumentar a drenagem e volume. Cada amostra foi usada para encher cinco tubos de 28 ml replicados que foram plantados com 3 - 5 sementes de manjericão (Ocium basilicum, tipo Genovese doce) por tubo. Plântulas foram germinadas em uma sala de cultivo sob as condições descritas na Tabela 1. A rega foi realizada com água da torneira, como necessária para evitar a murchidão.
[0202] Cerca de 14 DAS, as plantas foram colhidas e a folhagem foi cortada e descartada. Para cada amostra, as raízes e caules basais foram sacudidas para retirar o pó, lavadas em água destilada (SDW) e as replicadas combinadas em um saco plástico. O material de planta foi então completamente esmagado dentro dos sacos plásticos. 10ml de SDW foi adicionado ás raízes esmadas, e a suspensão resultante usada como inóculo microbiano para a primeira rodada de seleção.
[0203] Sementes de manjericão foram embebidas em água por um período mínimo de uma hora no extrato de raiz e então plantadas em tubos de 28 ml contendo a mistura para vasos (40% v/v turfa, 30% felema de pinho compostado, 30% de púmice fino, ajustado a um pH de 6,1 com limo) umedecida com 6ml de fertilizante líquido (Miracle-Gro, Scotts Australia Pty Ltd). A suspensão de raiz restante foi diluída com 40ml de SDW e 2 mil foi pipetado sobre as sementes. Dez tubos replicados foram preparados para cada amostra, juntamente com um conjunto de 20 controles de sem micróbios que foram preparados usando sementes embebidas em água destilada esterilizada. Todos os tubos foram randomizados em racks. Plântulas foram germinadas em uma sala de cultivo sob as condições descritas acima. Após a germinação, cada tubo foi capinado para deixar uma muda aleatoriamente selecionada.
Seleção da rodada 1
[0204] Em 20 DAS, metade das plantas de cada tratamento foram aleatoriamente selecionadas para a colheita. O restante das plantas foi retida na sala de cultivo para a preparação dos extratos para inocular a segunda rodada da seleção. As plantas selecionadas para a colheita foram removidas dos vasos, lavadas para remover a mistura de vaso aderente, secadas em papel toalha e pesadas antes de serem colocadas em tubos de 2 ml contendo um único rolamento de aço inoxidável. Amostras foram congeladas a -20 °C, na pendência de análise para carboidratos solúveis em água.
[0205] A concentração de carboidratos solúveis em água (WSC) em extratos de planta foi determinada usando o método antrona, como descrito de forma geral por Yemm e Willis (Biochem. J. 1954, 57: 508-514). Extratos de plantas inteiras foram preparados por um bead beater por 2 minutos a 22hz. Um mL de água destilada esterilizada foi então adicionado a cada amostra. Após a mistura, 0,5 mL de suspensão de líquido foram transferidos a um bloco com 96 poços para microtubo que foi colocado em um banho de água fervente durante 30 minutos. Cada bloco foi então transferido a um banho de água fria por cinco minutos, seguido de centrifugação a 3000 rcf por 10 minutos para sedimentar os detritos. Os sobrenadantes foram recuperados, diluídos em 1:25 em SDW, e amostras de 40μL foram transferidas placa blocos com 96 poços para microtubos. As amostras foram então sobrepostas com 200μl de solução recém-preparada de antrona (2 mg/mL de ácido sulfúrico a 70%). Blocos foram refrigerados por 5 minutos em um banho de água gelada, misturados por inversão, colocados em um banho de água fervente por 60 segundos, e imediatamente recolocados no banho de água fria. Uma vez resfriado, uma amostra de 100ul de cada reação foi transferida para uma placa para microtitulação de fundo chato e a absorção foi medida a 600 nm em um espectrofotômetro SpectraMax M5e. Padrões de glicose foram preparados em água ultra pura e processados como extratos por planta para gerar uma curva de calibração. Os resultados são relatados em equivalentes de glicose (mg) por grama de tecido de planta.
[0206] Vinte dos 43 tratamentos renderam um aumento positivo no conteúdo de açúcar mediano em comparação ao controle não microbiano.
Seleção da rodada 2
[0207] Os 13 tratamentos que renderam um conteúdo de açúcar mediano maior foram selecionados para a segunda rodada de seleção. Extratos microbianos foram preparados de 5 das plantas restantes em cada tratamento e plicadas às sementes de manjericão de acordo com o procedimento descrito acima, com a exceção do número de réplicas foi aumentado para 30 para cada tratamento, e 60 para cada controle não micróbio.
[0208] Quinze dias após a semeadura (DAS), 15 das plantas de cada tratamento foram colhidas. O restante das plantas foi retido em uma sala de cultivo para experimentos de isolação subsequentes. Plantas selecionadas para colheita foram removidas de potes e processadas para a análise de carboidratos solúveis em água, como descrito previamente, com a exceção da solução de antrona, que foi preparada em ácido sulfúrico a 80% para reduzir a formação de precipitados.
[0209] Oito dos 13 tratamentos renderam um aumento positivo no conteúdo de açúcar mediano em comparação ao controle não microbiano. Neste ponto, as rodadas de seleção iterativa foram concluídas e o isolamento microbiano foi realizado.
Isolamento microbiano
[0210] Bactérias e fungos foram isolados a partir de até cinco das plantas restantes de cada um dos sete tratamentos com o maior WSC maior. Para cada tratamento, as raízes e o 1° cm inferior do material de caule de cada planta foi chacoalhado para ser limpo do substrato e lavado em água destilada esterilizada, e então dividido em duas partes. Uma parte foi esterilizada na superfície em 6,6 de Dettol® (ingrediente ativo: cloroxilenol 4,8%) por 1 minutos, seguido por 3 lavagens em SDW de 1 min. cada. As raízes esterilizadas na superfície foram cortadas em pedaços (cerca de 1-2 cm de comprimento) usando tesouras esterilizadas e jogadas em um tubo de teste contendo um meio NDSM (Eckford et at., 2002.). Após 2-4 dias encubados a temperatura ambiente, os tubos foram observados e películas óbvias foram retiradas e purificadas por subcultura em ágar R2A (Difco).
[0211] As raízes de uma parte foram combinadas em um saco plástico e esmagadas dentro do saco com 10 mls de água adicionados para suspender o material de raiz. Pedaços de raiz esmagada foram recuperados e também colocados em placas de PDA, ou incorporado em PDA derretido a 45 °C. Uma diluição em série de dez vezes da suspensão foi preparada em SDW e usada para preparar o espalhamento em placas em ágar R2A (Difco). Placas R2A e PDA foram incubadas a 25 °C e examinadas sob um microscópio de dissecção após uma incubação de 24 - 72 horas. Colônias foram avaliadas pela abundância, agrupamento de acordo com a morfologia e isolados representativos foram selecionados e estriadas para a obtenção de pureza em placas R2A e PDA. Métodos padrão foram usados para identificar isolados a um nível de espécie através da extração de DNA, amplificação de PCR e sequenciamento de 16S rDNA (bactérias) ou região ITSS (fungos).
Avaliação microbiana
[0212] Duas rodadas de avaliação microbiana foram realizadas em isolados selecionados com base em abundância, diversidade e características de espécie. Na primeira avaliação, 80 tratamentos foram testados compreendendo 68 isolados individuais e 12 consórcios.
[0213] Isolados bacterianos e fúngicos foram cultivados em placas R2A e PDA, respectivamente, e suspensões foram preparadas em SDW para a inoculação de sementes, como geralmente descrito no exemplo 4.
[0214] As suspensões foram diluídas em 1x107 (bactéria) e 1x103 (fungo) por ml para o uso em tratamentos individuais. Consórcios foram preparados usando volumes iguais de cada suspensão microbiana individual. Sementes de manjericão foram embebidas por uma hora em suspensões microbianas e então plantadas em tubos de 28 ml contendo uma mistura para vasos comercial (descrita no exemplo 4) que tinha sido umedecida com 6 ml de água de torneira. Dois ml de suspensão microbiana foram pipetados por cima de cada semente. Trinta réplicas foram preparadas para cada tratamento, e 45 réplicas foram preparadas no controle não microbiano.
[0215] Treze DAS, 15 plantas de cada tratamento e 22 controles sem micróbios foram selecionados para colheita e determinação de WSC; A preparação das amostras foi realizada como descrito previamente, com a exceção de que após a o uso do bead beater, 0,8 ml de SDW foi adicionado a cada tubo e uma segunda rodada no bead beater foi realizada. Uma amostra de 0,5 mL da suspensão misturada resultada foi então transferida para um bloco de diluição com 96 poços para microtubo e armazenado a -20 °C. Blocos foram descongelados e analisados para carboidratos, como descrito anteriormente.
[0216] Um total de 36 tratamentos microbianos renderam concentrações de carboidratos medianas maiores do que os controles livres de micróbios. Esses dados foram usados para gerar um conjunto refinado de 44 tratamentos compreendendo 34 isolados individuais e 10 consórcios para uma segunda rodada de avaliação microbiana. Os tratamentos foram selecionados com base nos resultados para um WSC aumentado, e incluíam vários isolados individuais que tiveram um bom desempenho em consórcio, assim como novos consórcios preparados a partir de micróbios bem classificados.
[0217] Tratamentos microbianos foram preparados e as sementes de manjericão foram embebidas e plantadas, como descrito acima, exceto pelo fato de que o número de réplicas de tratamento foi aumentado para 45 e os controles não microbianos aumentados para 90
[0218] Todas as plantas foram colhidas 14 dias após a semeadura e processadas para análise WSC, como descrito acima, com a exceção de que os blocos foram congelados durante a noite após uma primeira etapa de aquecimento de 30 minutos. As amostras foram então descongeladas e processadas como descrito anteriormente. Uma série de diluição para uma única amostra de manjericão foi colocada em todos os blocos para servir como de controle interno e permitir a normalização de variações entre blocos.
[0219] Um total de 20 tratamentos microbianos rendeu concentrações medianas de WSC maiores que a dos controles livres de micróbios, com 11 tratamentos rendendo aumentos maiores do que 5% com relação ao controle (IOC; Tabela 3). O tratamento que rendeu a maior concentração de carboidrato mediana foi o consórcio novo dos três isolados com a melhor classificação da primeira rodada de avaliação microbiana. TABELA 3. Tratamentos microbianos rendendo concentrações de carboidratos maiores que os controles livres de carboidratos na 2a rodada da avaliação microbiana.
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ID - Identificação putativa baseada nas correspondências mais próximas em bancos de dados RDPII e/ou NCBI.
[0220] Estes resultados fornecem evidências de que o método para direcionar a seleção de micróbios descrito pela presente invenção é capaz de produzir um conjunto de micróbios que melhoram a produção de carboidratos solúveis em manjericão. Exemplo 6 Identificação de micróbios endofíticos que melhoram o crescimento de milho (Zea mays).
[0221] Micróbios endofíticos são estreitamente associados com ou contidos dentro dos tecidos da planta, e, logo, podem ser menos expostos a competição e estressores em comparação com micróbios associados com a rizosfera da planta. Seria desejável criar um grupo de micróbios endofíticos que são capazes de promover o crescimento do melhor por meios como um aumento da biomassa da planta ou do rendimento de grão. Neste exemplo, um micróbio endofítico é definido como um que ainda é viável após a esterilização da superfície dos tecidos da planta de milho com 6,6 Dettol® (ingrediente ativo: cloroxilenol 4,8%) por 1 minuto.
[0222] Setenta e três amostras do solo da Ilha Norte da Nova Zelândia foram usadas como a fonte da diversidade microbiana. Amostras do solo (tratamentos) foram misturadas com areia esterelizada:vermiculite (1: 1 ou 1:2), como necessário para aumentar a drenagem e o volume. As misturas resultantes foram colocadas em tubos de 28 ml e plantadas com 15 réplicas do milho (Sementes híbridas de Zea mays de Pioneer 37Y12) Plântulas foram regadas com uma mangueira de nebulização até a germinação, e então banhadas até a saturação três vezes por semana, com rega adicional conforme necessário. Para as condições de crescimento padrão restantes, ver a Tabela 1.
[0223] Três plantas de cada tratamento foram selecionadas em 60 dias após a semeadura (DAS). Os caules das plantas de milho foram cortados 5 cm acima do solo e descartados. As raízes e caules anexados foram chacoalhados para a remoção de terra, lavadas para a remoção de fragmentos de terra e drenadas antes dos caules e raízes serem combinados em sacos plásticos. Este material foi então esmagado dentro de um saco com 10 mil de água adicionados para suspender o material. A parte líquida de uma suspensão resultante foi usada como o inóculo microbiano para uma rodada de enriquecimento não seletiva. A finalidade desta rodada extra foi aumentar a abundância de micróbios crescente dentro dos tecidos de milho. Sementes de milho (37Y12) esterilizado na superfície foram embebidas por uma hora em 1 ml da suspensão de raiz para cada amostra. As sementes embebidas foram então plantadas em tubos de 28 ml (15 reps para cada tratamento) contendo areia esterilizada e vermiculite 1:2 umedecido com 6 ml de alimento para planta solúvel Phostrogen® (1/450 v/v em água destilada esterilizada). A suspensão de raiz restante consistiu de um volume final de 40 ml usando água destilada esterilizada (SDW) e 2 ml foi pipetado por cimas das sementes plantadas.
Seleção da rodada 1
[0224] Sessenta dias após a semeadura (DAS), as cinco maiores plantas em cada tratamento foram selecionadas e processadas para fornecer um inóculo microbiano para a primeira rodada da seleção. A folhagem de cada uma das plantas selecionadas foi cortada a 5cm acima do nível do substrato e descartada. As raízes e caules basais restantes foram rigorosamente lavadas em água de torneira para remover qualquer solo aderente e então combinadas dentro dos tratamentos em sacos plásticos antes de serem esterilizadas com 6,6% de Dettol®por 1 minuto para selecionar micróbios endofíticos. As raízes foram então lavadas 3 vezes em SDW por 1, 5 e então 10 minutos com agitação. As raízes lavadas foram esmagadas dentro dos sacos plásticos, como descrito acima, e suspensas em um volume final de 20 ml de SDW. A suspensão resultante foi usada para inocular 15 sementes de milho esterilizadas na superfície (Zea mays de Pioneer P9400) pela embebição da mesma por uma hora em 10 ml do inóculo antes de serem plantadas em areia esterilizada:vermiculite 1:3 umedecido com fertilizante sintético estéril (Fahraeus, 1957). A suspensão restante resultou em um volume final de 40 ml para cada tratamento e 2 ml foi pipetado por cima de cada semente plantada. Trinta réplicas do tubo de sementes de controle livre de micróbios foram embebidas em SDW e pipetadas com 2 mls de água por tubo em um processo duplicado livre do inóculo de micróbios. Depois de plantadas, as sementes foram cobertas com um substrato seco fresco. Os vasos foram regados com SDW durante uma primeira semana após o plantio para manter as condições estéreis, seguido de água de torneira três vezes por semana.
Seleção da rodada 2
[0225] As plantas foram colhidas em 26 DAS. A folhagem foi cortada e pesada conforme descrito acima. As raízes e caule basal restantes de cada planta foram lavadas, secas com papel toalha fresco e então pesadas e ensacadas individualmente. O inóculo para a segunda rodada de seleção foi preparado a partir de 20 tratamentos que renderam a maior biomassa média e as cinco maiores plantas individuais de cada tratamento. As raízes e caules basais das 10 maiores plantas de cada tratamento selecionado foram agrupados, esterilizados na superfície e esmagados, como descrito acima. AS cinco maiores plantas individuais foram processadas individualmente, como acima. Trinta repetições (sementes Pioneer P9400) foram plantadas para cada um dos 25 tratamentos em areia esterilizada:vermiculite 1:3 umedecida com fertilizante sintético esterilizado.
Seleção da rodada 3
[0226] As plantas foram colhidas a 26 DAS e processadas da maneira descrita anteriormente. As seis maiores plantas dos 7 tratamentos que renderam a maior biomassa mediana foram selecionadas para criar o inóculo para a terceira rodada da seleção. As plantas foram cultivadas por 28 dias, colhidas e analisadas como descrito para as rodadas anteriores. As raízes e caules basais das três maiores plantas dos três melhores tratamentos foram agrupados, e as duas maiores plantas no experimento foram selecionadas para individualmente fornecerem o inóculo para o isolamento microbiano.
Isolamento microbiano
[0227] Os isolamentos microbianos foram realizados em suspensões de raízes usadas como inóculo na seleção de R3 e nas suspensões preparadas a partir das plantas R3 selecionadas acima. Isolados fúngicos e bacterianos foram realizados, de forma geral, como descrito acima, usando meios R2A, DPA e NDSM. Uma etapa de isolamento seletiva para actinomicetos foi realizada no qual etanol foi adicionado a suspensão de raiz a uma concentração final de 25%, incubado em RT por 30 min e então colocado em uma placa em R2A. As placas foram examinadas após 1-7 dias de incubação a 25°C. Colônias foram analisadas para a abundância, agrupadas de acordo com suas morfologias e subcultivadas em R2A. Métodos padrão foram usados para identificar os isoládos a um nível de espécie através da extração de DNA, amplificação de PCR e sequenciamento do gene 16S rRNA (bactéria) e regiões ITTS (fungos).
Rodadas de avaliação microbiana
[0228] Foram realizadas duas rodadas de avaliação microbiana. Na primeira rodada de avaliação, 79 cepas foram selecionadas com base na abundância, diversidade e características de espécie. Isolados bacterianos foram preparados e usados para inocular sementes esterilizadas na superfície, como descrito no exemplo 4, com a exceção do fato de que foram usadas sementes de milho (P9400) Cepas fúngicas foram plaqueadas em PDA incubado a 25 °C por 7 dias, e então raspadas das placas com 5-10 ml de SDW e peneiradas através de um coador de chá para remover tufos de micélio e pecados de ágar presos. O número de esporos de hifa foi determinado usando um hemocitômetro neubauer melhorado e um microscópio de compostos e uma série de diluição de 5x102, 1x103 e 2x103 foi preparada. Cada diluição foi então pipetada sobre as 10 sementes plantadas, assim totalizando 30 sementes por replica cada a níveis de 3 dose. Para tanto os fungos quanto para as bactérias, sementes de milho (Pioneer P9400) foram plantadas em tubos de 28 ml contendo uma mistura de vasos esterilizada (40% turfa, 30% felema de pinho compostado, 30% de púmice fino, ajustado a um pH de 6,1 com limo) umedecidos com uma solução Fahraeus (Fahraeus, 1957) antes de serem cobertas com um substrato seco fresco. Todas as plantas foram posteriormente regadas com água da torneira 3 vezes por semana.
[0229] As plantas foram colhidas 24 DAS e tanto a folhagem quanto as raízes foram pesadas. Isolados microbianos que renderam um aumento de peso medo foliar e/ou de raiz em comparação aos controles livres de micróbios foram selecionados para uma segunda rodada da avaliação. As cepas escolhidas foram processadas e plantadas como descritas acima, com a exceção d e que as sementes foram embebidas e inoculadas com cepas fúngicas a uma concentração de 1x103 ao invés de três diluições e 15 réplicas foram plantadas para todas as cepas. A folhagem e as raízes foram colhidas e pesadas 20 DAS. Os resultados são mostrados na tabela 4. Quatro dos isolados resultaram em uma biomassa significativamente maior do que os controles livres de micróbios. Tabela 4. Micróbios endofíticos produzindo milho de biomassa aumentada
Figure img0005
Itálicos indicam uma diferença significativa do controle livre de micróbios (LSD de Fisher), % IOC, aumento de porcentagem sobre controles. ID putativa com base na correspondência mais próxima no banco de dados RDPII para sequência rRNA 16S.
[0230] Estes resultados fornecem evidências de que o método para direcionar a seleção de micróbios descrito pela presente invenção é capaz de produzir um conjunto de micróbios endofíticos que melhoram o crescimento do milho.
[0231] A invenção foi descrita neste documento, com referência a determinadas modalidades preferenciais, a fim de permitir que o leitor pratique a invenção sem experimentação indevida. No entanto, uma pessoa versada na técnica reconhecerá facilmente que muitos dos componentes e parâmetros podem ser variados ou modificados em certo grau ou substituídos por equivalentes conhecidos, sem se desviar do escopo da invenção. Deve ser contemplado que essas modificações e equivalentes estão incorporados neste documento como se individualmente estabelecidos. Adicionalmente, títulos, cabeçalhos ou similares são fornecidos para melhorar a compreensão do leitor deste documento e não deve ser lido de forma a limitar o escopo da presente invenção.
[0232] As divulgações completas de todos os pedidos, patentes e publicações citados acima e abaixo, se houver, estão incorporados por meio deste por referência. No entanto, a referência a quaisquer pedidos, patentes e publicações nesta especificação não são, e não devem ser tomados como uma confirmação ou qualquer forma de sugestão de que estes constituem o estado da técnica válido ou formam parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo.
[0233] Ao longo desta especificação e quaisquer reivindicações que seguem, salvo indicação em contrário, as palavras "compreendem", "compreendendo" e similares, devem ser interpretados em um sentido inclusivo, em oposição a um sentido exclusivo, ou, em outras palavras, no sentido de "incluindo, mas não limitado a”. BIBLIOGRAFIA Pikovskaya RI (1948). Mobilization of phosphorus in soil connection with the vital activity of some microbial species.Microbiologia 17:362-370 Miche, L e Balandreau, J (2001). Effects of rice seed surface sterilisation with hypochlorite on inoculated Burkholderia vietamiensis. Appl. Environ. Microbiol.67(7): p3046-3052 Fahraeus, G. (1957). J. Gen Microbiol. 16: 374-381 Gen Microbiol 374-381 Ruth Eckford, R., Cook, F.D., Sauld, D., Aislabie J., e J. Foght (2002) Free-living Heterophobic Bacteria Isolated from Fuel-Contaminated Antartci Spoils. Appl. Environ. Microbiol. 68(10):5181 Yemm e Willis (Biochem. J. 1954, 57: 508-514

Claims (16)

1. Método iterativo de triagem de traço fenotípico ou genotípico de planta para selecionar um ou mais micro-organismos capazes de transmitir pelo menos um traço fenotípico ou genotípico benéfico à uma planta, caracterizado por compreender: a) sujeitar uma pluralidade de plantas (incluindo sementes, plântulas, estacas, e/ou propágulos destas) à um meio de crescimento na presença de um primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos; b) cultivar a pluralidade de plantas no referido meio de crescimento; c) selecionar uma ou mais plantas da referida pluralidade após a etapa b), com base em um critério de seleção de traço fenotípico ou genotípico benéfico para a planta, em que a referida uma ou mais plantas selecionadas exibem pelo menos um ou mais traços fenotípicos ou genotípicos benéficos, em comparação com outras plantas da referida pluralidade; d) adquirir um segundo conjunto de um ou mais micro-organismos da referida uma ou mais planta e/ou rizosfera da planta da referida uma ou mais planta selecionada na etapa c); e) repetir as etapas a) a d) uma ou mais vezes, em que o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos adquiridos na etapa d) é usado como o primeiro conjunto de micro-organismos na etapa a) de qualquer repetição sucessiva; e f) selecionar um ou mais micro-organismos que é associado com a transmissão de um traço fenotípico ou genotípico benéfico para a planta.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que duas ou mais plantas são sujeitas a um meio de crescimento na presença do primeiro conjunto de micro-organismos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais plantas é selecionada com base em uma combinação de um ou mais traços genotípicos e um ou mais traços fenotípicos.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que critérios de seleção diferentes são usados em diferentes iterações do método.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o segundo conjunto de um ou mais micro-organismos são adquiridos de forma bruta.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que onde dois ou mais micro-organismos são adquiridos na etapa d), o método compreende ainda as etapas de separar os dois ou mais micro-organismos em isolados individuais, selecionar dois ou mais isolados individuais, e, então, combinar os dois ou mais isolados selecionados.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os isolados combinados são usados como o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos na etapa a) de qualquer repetição sucessiva do método.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que dois ou mais métodos da invenção podem ser realizados separadamente e o segundo conjunto de um ou mais microorganismos adquiridos na etapa d) de cada método separado são combinados.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos combinados são usados como o primeiro conjunto de um ou mais micro-organismos na etapa a) de qualquer repetição sucessiva do método.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o material da planta (incluindo sementes, plântulas, estaquias, e/ou propágulos dos mesmos) é usado como a fonte de micro-organismos para a etapa a).
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o método é usado para selecionar um ou mais micro-organismos incultiváveis ou um ou mais endófitos.
12. Método para a produção de uma composição para apoiar o crescimento, qualidade e/ou saúde da planta, o método caracterizado por compreender as etapas de um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e a etapa adicional de combinar o um ou mais micro-organismos selecionados pelo método com um ou mais ingredientes adicionais.
13. Método para a seleção de uma composição que é capaz de transmitir uma ou mais fenótipos ou genótipos à uma planta, o método caracterizado por compreender pelo menos as etapas de: a) cultivar um ou mais micro-organismos selecionados por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separar o um ou mais micro-organismos do um ou mais meios em uma ou mais culturas após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente livres de micro-organismos; c) submeter uma ou mais plantas (incluindo sementes, plântulas, estaquia e/ou propágulos da mesma) para a uma ou mais composições da etapa b); d) selecionar uma ou mais composições da etapa c) caso seja observado a transmissão de um ou mais fenótipos ou genótipos benéficos para a uma ou mais plantas.
14. Método para a seleção de uma composição que é capaz de transmitir um ou mais fenótipos ou genótipos benéficos a uma planta, o método caracterizado por compreender pelo menos as etapas de: a) cultivar um ou mais micro-organismos selecionados por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em um ou mais meios para formar uma ou mais culturas; b) inativar a uma ou mais culturas da etapa a) para fornecer uma ou mais composições contendo um ou mais micro-organismos inativos; c) sujeitar uma ou mais plantas (incluindo sementes, plântulas, estaquias, e/ou propágulos dos mesmos) para a uma ou mais composições da etapa b); d) selecionar uma ou mais composições da etapa c) caso seja observado a transmissão de um ou mais fenótipos ou genótipos benéficos para a uma ou mais plantas.
15. Método para a seleção de um ou mais micro-organismos que sejam capazes de produzir uma composição capaz de transmitir um ou mais fenótipos ou genótipos benéficos à uma planta, o método caracterizado por compreender: a) cultivar um ou mais micro-organismos selecionados por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) separar o um ou mais micro-organismos do um ou mais meios em uma ou mais culturas da etapa a) após um período de tempo para fornecer uma ou mais composições substancialmente livres de micro-organismos; c) sujeitar uma ou mais plantas (incluindo sementes, plântulas, estaquias, e/ou propágulos dos mesmos) para a uma ou mais composições da etapa b); d) selecionar o um ou mais micro-organismos associados com uma ou mais composições nas quais se observou a transmissão de um ou mais fenótipos ou genótipos benéficos para a uma ou mais plantas.
16. Método para a seleção de um ou mais micro-organismos que sejam capazes de produzir uma composição capaz de transmitir um ou mais fenótipos ou genótipos benéficos à uma planta, o método caracterizado por compreender pelo menos as etapas de: a) cultivar um ou mais micro-organismos selecionados por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em um ou mais meios para fornecer uma ou mais culturas; b) inativar a uma ou mais culturas da etapa a) para fornecer uma ou mais composições contendo um ou mais micro-organismos inativos; c) submeter uma ou mais plantas (incluindo sementes, plântulas, estaquia e/ou propágulos da mesma) para a uma ou mais composições da etapa b); e d) selecionar o um ou mais micro-organismos associados com uma ou mais composições nas quais se observou a transmissão de um ou mais fenótipos ou genótipos benéficos para a uma ou mais plantas.
BR112015006119-2A 2012-09-19 2013-09-19 Método iterativo de triagem de traço fenotípico ou genotípico de planta para selecionar um ou mais microorganismos capazes de transmitir pelo menos um traço fenotípico ou genotípico benéfico à uma planta, método para a produção de uma composição, métodos para a seleção de composições e métodos para a seleção de um ou mais micro-organismos. BR112015006119B1 (pt)

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