CN113088471B - 一株产iaa和cmc酶的普沙根瘤菌x2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌X2及其应用，涉及农业微生物技术领域。本发明所述普沙根瘤菌X2的保藏编号为CGMCCNo.20912。本发明所述普沙根瘤菌X2产CMC酶能力强，且能产IAA，CMC酶活力最高可达到24.96U·ml^‑1，IAA的分泌量最高可达19.07mg·L^‑1。因此，所述普沙根瘤菌X2可用于制备产IAA和/或CMC酶或具促生功能的秸秆促腐菌剂，从而应用于秸秆促腐、作物促生，实现秸秆还田效率和农作物产量提升。

Description

一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌X2及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌X2及其应用。

背景技术

我国农作物秸秆资源丰富，秸秆中含有大量的有机物质和较丰富的养分元素，是一种重要的有机肥料资源。秸秆还田可以有效地增加土壤中养分含量，平衡土壤养分，调节土壤物化性状，改善土壤生态结构，改良土壤，培肥地力，改善作物种植环境，是改造中低产田建设的基本措施之一。

安徽省砂姜黑土的分布面积广泛，约为165万公顷。由于其干坚实、湿粘闭、质地黏重、结构和耕性差、有机质含量低等障碍因子的存在，严重影响了作物的正常生长，导致土壤生产率低下，加上砂姜黑土区耕层浅薄，使得砂姜黑土成为淮北平原主要的中低产田类型。因此通过秸秆还田或施加生物碳等耕作措施提升砂姜黑土有机质含量，消减其障碍因素，进而改善蓄水保土性能，对实现砂姜黑土作物产量提升具有极为重要的现实意义与战略考量。

目前最广泛的秸秆还田方式仍然为直接破碎还田，但由于秸秆的主要成分为木质素、纤维素等大分子物质，直接还田后不易腐化。目前，研究证明可以通过添加产纤维素降解酶的外源微生物的方式来促进秸秆还田后的腐化。因此筛选具有高效纤维素分解能力的菌株，对提高秸秆促腐能力有积极的意义。

此外，腐解不及时的还田秸秆还会影响作物种子的萌发和幼苗的生长。吲哚乙酸(IAA)是一种植物体内普遍存在的内源生长素，其对植物生长有显著的影响。有相关实验表明，IAA在植物体内参与许多生理生化的调节和控制，如细胞的伸长生长、形成层细胞的分裂、维管组织的分化等，对作物种子萌发和生长、生产均有积极的意义。

因此，筛选优势的兼具有高效降解能力和促生能力的功能菌，对实现砂姜黑土区秸秆资源利用、土壤培肥和作物增产具有积极的意义。

目前，国内外大多数研究只对某一株菌的纤维素降解能力或者是促生能力进行研究，致力于研究某一菌株的某项功能，而鲜见具有多重功能的野生菌株。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌X2及其应用，可提高纤维素降解率、促腐秸秆，从而促进还田秸秆腐解，提升秸秆还田效率；另外该菌在优化后还能产生IAA促生激素，促进种子萌发和作物生长，实现农作物增产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)X2，所述普沙根瘤菌X2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20912。

优选的，所述普沙根瘤菌X2的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述普沙根瘤菌X2在制备IAA和/或CMC酶中的应用。

本发明还提供了一种利用上述普沙根瘤菌X2制备IAA和/或CMC酶的方法，包括以下步骤：

当利用所述普沙根瘤菌X2制备IAA时，调节含有100mg·L^-1L-色氨酸的LB培养基的pH值为6.0～9.0，接种所述普沙根瘤菌X2的菌悬液，震荡培养；所述菌悬液的体积为所述LB培养基体积的1％；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8～1.2；

当利用所述普沙根瘤菌X2制备CMC酶时，将液体发酵培养基调节pH值为4.0～6.0，接种所述普沙根瘤菌X2，震荡培养；所述普沙根瘤菌X2的接种体积为所述液体发酵培养基体积的1％；所述液体发酵培养基包括以下浓度的原料：氯化钠6g·L^-1、七水硫酸镁0.1g·L^-1、氯化钙0.1g·L^-1、磷酸二氢钾0.5g·L^-1、酵母膏10g·L^-1和秸秆20g·L^-1。

优选的，在制备IAA和制备CMC酶时，所述震荡培养的温度均为28～30℃，震荡速度均为160～180rpm。

优选的，所述LB培养基和液体发酵培养基还包括以下重量百分含量的成分：0.1％碳源、1％氮源。

优选的，所述碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖和果糖中的一种或多种；

所述氮源包括硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素和蛋白胨的一种或多种。

本发明还提供了上述普沙根瘤菌X2在制备促腐促生菌剂中的应用。

优选的，所述促腐促生菌剂的类型为菌水剂；所述菌水剂在应用时，以所述普沙根瘤菌X2的活菌数计，接种量为1～9×10⁶CFU·g^-1秸秆或1～9×10⁷CFU·g^-1土壤。

本发明还提供了上述普沙根瘤菌X2在促进秸秆还田效率和农作物增产中的应用。

本发明提供了一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)X2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20912。本发明所述普沙根瘤菌X2表面光滑，菌落较小，边缘整齐，不透明，乳白色，粘液状；普沙根瘤菌X2为革兰氏阴性菌，好氧，接触酶阴性，MR试验阴性，V.P试验阴性，淀粉水解阴性，明胶水解阴性，柠檬酸盐利用阳性。

本发明所述普沙根瘤菌X2能高产吲哚乙酸，且产CMC酶能力较强，具有较高的作物促生和秸秆促腐能力，IAA的分泌量可达39.67mg·L^-1，CMC酶活最高可达为37.60U·ml^-1。因此可将所述普沙根瘤菌X2用于制备兼具有促生功能的腐秆菌剂，从而用于秸秆促腐、促进秸秆还田效率和农作物增产中。

本发明所述普沙根瘤菌X2能够一菌多用，发挥菌株的最大效能，一方面可以促进作物生长，增加作物产量；另一方面可加速纤维素降解，促腐秸秆，培肥地力，改善土壤理化性质，具有作为功能微生物肥料的潜力，为推进绿色农业发展做贡献。

生物保藏信息

普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)X2，于2020年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.20912。

附图说明

图1为本发明提供的普沙根瘤菌X2的菌落图；

图2为不同菌株的产CMC酶能力；

图3为不同菌株的产IAA能力；

图4根据16S rDNA序列构建的普沙根瘤菌X2的系统发育树；

图5为不同pH对普沙根瘤菌X2产CMC酶活力的影响图；

图6为不同通气量量对普沙根瘤菌X2产CMC酶活力的影响图；

图7为不同氮源对普沙根瘤菌X2产CMC酶活力的影响图；

图8为不同pH值对普沙根瘤菌X2生长情况的影响图；

图9为不同pH值对普沙根瘤菌X2产IAA的影响图；

图10为不同通气量对普沙根瘤菌X2生长状况的影响图；

图11为不同通气量对普沙根瘤菌X2产IAA的影响图；

图12为不同碳源对普沙根瘤菌X2生长状况的影响图；

图13为不同碳源对普沙根瘤菌X2产IAA的影响图；

图14为不同氮源对普沙根瘤菌X2生长状况的影响图；

图15为不同氮源对普沙根瘤菌X2产IAA的影响图。

图16为不同菌株秸秆促腐能力的影响图。

具体实施方式

本发明提供了一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)X2，所述普沙根瘤菌X2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20912。

本发明所述普沙根瘤菌X2从安徽省蒙城县内农业示范科技园区内采集砂姜黑土中筛选得到，经验证后，所述普沙根瘤菌X2为革兰氏阴性菌，好氧，接触酶阴性，M.R试验阴性，V.P试验阴性，淀粉水解阴性，明胶水解阴性，柠檬酸盐利用阳性；菌落结构如图1所示，表面光滑，菌落较小，边缘整齐，菌落圆形，粘液状，乳白色。经测序，所述普沙根瘤菌X2的16S rDNA序列优选如SEQ ID NO.1所示：CCGGTTCGCTGACCTACCGTGGTTAGCTGCCTCCTTGCGGTTAGCGCACTACCTTCGGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCGACATCGCTGTCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCTCGGCTTATCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTTCTGGGGCCAGCCTAACTGAAGGACATCGTCTCCAATGCCCATACCCCGAATGTCAAGAGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAACAGTATACTGCCCGACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGACCAGTAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTTACCTCTTCCATACTCAAGATACCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGCAGTTGAGCTGCGGGATTTCACCCCTGACTTAAATATCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGACTACCGTCATTATCTTCATCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAAGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCCAATCCTTCCCCGATAAATCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAATTCCAGTTTCCCGGAGCTATTCCGCAGGAAAGGGTATGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCACTCCCCTTGCGGGGCGTTCGACTTGCATGGTAAGCCTGCCGCCATTCGGGC。

本发明还提供了上述普沙根瘤菌X2在制备IAA和/或CMC酶中的应用。

本发明所述普沙根瘤菌X2能高产吲哚乙酸，且产CMC酶能力较强，在不同的优化条件下，可用于生产OAA和/或CMC酶，且IAA的分泌量可达39.67mg·L^-1，CMC酶活最高可达为37.60U·ml^-1。

本发明还提供了一种利用上述普沙根瘤菌X2制备IAA和/或CMC酶的方法，包括以下步骤：

当利用所述普沙根瘤菌X2制备IAA时，调节含有100mg·L^-1L-色氨酸的LB培养基的pH值为6.0～9.0，接种所述普沙根瘤菌X2的菌悬液，震荡培养；所述菌悬液的体积为所述LB培养基体积的1％；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8～1.2；

当利用所述普沙根瘤菌X2制备CMC酶时，将液体发酵培养基调节pH值为4.0～6.0，接种所述普沙根瘤菌X2，震荡培养；所述普沙根瘤菌X2的接种体积为所述液体发酵培养基体积的1％；所述液体发酵培养基包括以下浓度的原料：氯化钠6g·L^-1、七水硫酸镁0.1g·L^-1、氯化钙0.1g·L^-1、磷酸二氢钾0.5g·L^-1、酵母膏10g·L^-1和秸秆20g·L^-1。

本发明在利用所述普沙根瘤菌X2制备IAA时，在优化后的LB培养基中接种普沙根瘤菌X2的菌悬液，所述菌悬液优选为利用接种环从固体培养基上挑取一环菌体，将其接入含6ml LB培养基的25ml试管中，随后将试管加塞置于30℃、180rpm摇床中过夜培养所得；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8～1.2，接种体积为所述LB培养基体积的1％。本发明在所述接种后进行震荡培养，此时培养基的装液量优选为25ml/250ml，培养时间为15h，在该条件下培育出的普沙根瘤菌X2产IAA的量最高且菌株生长能力最佳。本发明所述震荡培养的温度优选为28～30℃，震荡速度优选为160～180rpm。

本发明在利用所述普沙根瘤菌X2制备CMC酶时，优选在所述液体发酵培养基上接种所述普沙根瘤菌X2，并震荡培养，所述震荡培养的温度优选为28～30℃，震荡速度优选为160～180rpm。

在本发明中，所述LB培养基和液体发酵培养基中优选还包括以下重量百分含量的成分：0.1％碳源、1％氮源；所述碳源优选包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖和果糖中的一种或多种，更优选为甘露醇；所述氮源优选包括硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素和蛋白胨的一种或多种，更优选为酵母粉或蛋白胨。

本发明还提供了上述普沙根瘤菌X2在制备促腐促生菌剂中的应用。

本发明所述普沙根瘤菌X2可产生CMC酶，并降解作物秸秆，是一种纤维素降解菌，结合所述普沙根瘤菌X2的产IAA能力，可将其用于制备促腐促生菌剂。

本发明所述促腐促生菌剂的类型优选为菌水剂；所述菌水剂在应用时，以所述普沙根瘤菌X2的活菌数计，接种量优选为1～9×10⁶CFU·g^-1秸秆或1～9×10⁷CFU·g^-1土壤。

本发明还提供了上述普沙根瘤菌X2在促进秸秆还田效率和农作物增产中的应用。本发明所述应用中普沙根瘤菌X2的使用方法和施用量与上述应用相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌X2及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、试剂准备：

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，调节pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟(固体培养基在此配方上加琼脂20g)。

无机盐培养基：硫酸铵2.0g，磷酸二氢钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.2g，二氯化钙0.1g，蒸馏水1000ml，调pH值7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。

液体发酵培养基：氯化钠6g，七水硫酸镁0.1g，氯化钙0.1g，磷酸二氢钾0.5g，酵母膏10g，秸秆20g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20分钟。

富集培养基：羧甲基纤维素钠20g，微晶纤维素5g，纤维素粉5g，磷酸氢二钾1g，硝酸1g，七水硫酸镁0.2g，二水氯化铜0.1g，三氯化铁0.02g，蒸馏水1000ml。121℃灭菌20分钟。

羧甲基纤维素培养基：羧甲基纤维素钠15g，硝酸铵1g，酵母膏1g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。121℃灭菌20分钟。

2、菌株筛选

将从安徽省蒙城县内农业示范科技园区内采取的砂姜黑土称取10g土壤样品接种于90ml无菌水中，28℃，150rpm摇床震荡30min，在无菌操作台中，取1ml土壤悬液，加入9ml无菌水，制成浓度为10^-1的原液。稀释平板法分离纯化菌株，纯培养的菌株置于4℃冰箱中保存。

供试土壤的基本性质如表1所示：

表1供试土壤的基本性质

再将分离、纯化获得的菌株分别接种在羧甲基纤维素钠选择培养基上，刚果红染色法放置20min后测量菌落直径(D)和透明圈直径(H)，根据H/D值大小，初步判断菌株降解纤维素能力的强弱。

用刚果红染色法筛选出具有纤维素降解能力的所有菌株，根据H/D结果表明，X2菌株降解纤维素能力较高。

3、纤维素酶活测定

粗酶液制备：将菌种接种于以小麦秸秆粉为唯一碳源的液体发酵培养基中37℃液体摇瓶培养60h，把发酵液于4℃、5000rpm离心10min，上清液即为粗酶液。取0.2ml上清液于25ml干燥刻度试管中，加入1.8ml 1％CMC-Na溶液(pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)50℃水浴30min后加入DNS试剂3.0ml，沸水浴5min，终止反应并显色。冷水淋浴冷却，定容至25ml摇匀，用520nm波长下测定吸光度。空白对照为酶液在沸水浴中15min使其失活，其它条件不变。

本试验酶活力X＝1000×G×25/0.2×30×180，式I。

式中：X：样品的酶活力(U·ml^-1)；1000：换算倍数；G：标准曲线上光吸收值所对应的葡萄糖毫克数；25：定容体积(ml)；0.2：加酶量(ml)；30为作用时间(min)；180：葡萄糖的分子量(g·mol^-1)。

在上述条件下，酶活力按照国际单位规定定义为：每分钟催化底物(羧甲基纤维素钠)水解生成1pmol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位U。

筛选出的8株菌中X2降解纤维素能力较强，CMC酶活可达17.98U·ml^-1(图2)。

定性测定：将具有纤维素降解功能细菌接种于含有L-色氨酸(100mg·L^-1)的LB液体培养基，30℃，180rpm，培养1d，取100μl菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入100μlSalkowski比色液(50ml 35％HClO₄，1ml 0.5mol·L^-1FeCl₃，遮光保存)，将白色陶瓷板在室温下遮光放置30分钟后对其进行观察，颜色变红者表示其能分泌吲哚乙酸(IAA)，颜色的深浅代表着其产吲哚乙酸能力的高低，不变色代表其不产吲哚乙酸，阳性对照为100μl未接种菌液的LB培养基加入100μl Salkowski比色液。

定量测定：对通过定性分析筛选出的具有分泌IAA能力的菌株进行定量测定，培养条件同定性测定，先用分光光度法测定菌悬液的OD₆₀₀值，然后吸取5ml菌悬液于10000rpm离心10分钟，取2ml上清液加入等体积Salkowski比色液，室温遮光静置30分钟，在波长为530nm时，测定其OD值，通过IAA标准曲线计算菌悬液中IAA含量。

通过IAA定性分析，有4株菌具有产IAA能力，分别为X1、X2、X4、X5，又通过定量测定，结果表明，X2菌株在未优化条件下，产IAA为13.02mg·L^-1，高于其余菌株(图3)。

通过以上测定即可筛选出产CMC酶能力较强，且具有较高的小麦秸秆促腐(纤维素降解)能力的普沙根瘤菌X2。

将上述方法筛选分离出的菌株经南京公司进行测序，根据所获得的16S rDNA序列结果，在GenBank数据库中进行比对，Blast搜索同源序列，使用MEGA5.0软件，用Neighbour-Joining法构建系统发育树(图4)。结合形态学分析及该菌株的生理生化结果特征，鉴定为普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)。

对该菌的生理生化性质进行统计，如表2所示：

表2普沙根瘤菌X2的生理生化特征

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应

实施例2

针对不同pH、通气量、不同氮源测试对菌株产CMC酶能力的影响

1、培养基初始pH对产CMC酶能力影响

将菌种接种于以小麦秸秆粉为唯一碳源的液体发酵培养基中，37℃液体摇瓶培养60h，用分光光度计测定其OD₅₂₀值。设置初始pH分别为4、5、6、7、8、9、10，培养60h后用分光光度计测定其产CMC酶的含量。

结果如图5所示：在pH值为5.0时，CMC酶活力最高，达到24.83U·ml^-1，pH值为4.0时酶活次之，为23.38U·ml^-1，表明X2菌株具有较强的的耐酸能力，在pH为4.0、5.0时CMC酶活力显著高于其他pH条件下的酶活。

2、通气量对产CMC酶能力影响

将菌种接种于以小麦秸秆粉为唯一碳源的液体发酵培养基中，37℃液体摇瓶培养60h，用分光光度计测定其OD₅₂₀值。设置25、50、75、100、150ml的培养液装于250ml的三角瓶中，培养60h后用分光光度计测定其产CMC酶的含量。

结果如图6所示：当250ml三角瓶装液量为25ml，通气量最大时，X2菌株产CMC酶活力最高，为37.60U·ml^-1。

3、氮源对产CMC酶能力影响

在以小麦秸秆粉为唯一碳源的液体发酵培养基中分别加入0.1％(m/V)的氮源，氮源包括硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨，37℃液体摇瓶培养60h，用分光分度计测定菌株CMC酶的含量。

结果如图7所示：不同氮源对X2菌株产CMC酶能力的影响不同，其中以酵母粉、蛋白胨为氮源时，产CMC酶能力最显著，分别高达19.45、16.04U·ml^-1。

实施例3

测试不同pH、通气量、不同碳源、不同氮源对菌株IAA产量和菌株生长量的影响

1、pH值对菌株IAA产量和菌株生长量的影响

将含有100mg·L^-1L-色氨酸的LB培养基分别调节到不同的pH(4、5、6、7、8、9、10)，取50ml LB液体培养基装于250ml三角瓶中，按照1％(V/V)的接种量接种OD₆₀₀值约为1的菌悬液，30℃，180rpm摇床培养24h，分别在10、15、20、32、44、56h动态取样，测定菌株生长情况(OD₆₀₀)和产IAA能力(OD₅₃₀)，每个处理设三个重复。

IAA标准曲线方程式：y＝0.0211x-0.134式II，R²＝0.9998，其中y为OD₅₃₀，x为IAA浓度(μg·ml^-1)。

结果如图8和图11所示：在pH为6.0时，菌株OD₆₀₀值和OD₅₃₀值均达到最大，OD₆₀₀为1.03，产IAA浓度为14.96mg·L^-1。砂姜黑土自身pH为酸性，表明菌株的生活习性适应于砂姜黑土。在pH 6.0～9.0之间，菌株生长情况和产IAA含量相对稳定。

2、通气量对菌株IAA产量和菌株生长量的影响

将含有100mg·L^-1L-色氨酸LB液体培养基按25ml，50ml，75ml，100ml，150ml装于250ml三角瓶中，按照1％(V/V)的接种量接种OD₆₀₀值约为1的菌悬液，30℃，180rpm摇床培养，分别在10、15、20、32、44、56h动态取样，测定菌株生长情况(OD₆₀₀)和产IAA能力(OD₅₃₀)，每个处理设三个重复。

结果如图9和图10所示：由于菌株X2是好氧细菌，250ml三角瓶装液量为25ml时，其生长状况和产IAA条件达到最优，OD₆₀₀为1.47，产IAA浓度为22.13mg·L^-1。随着装液量的增加，X2菌株的生长趋势和产IAA含量总体上显著下降。

3、氮源对菌株IAA产量和菌株生长量的影响

在不包括硫酸铵的无机盐培养基(含有100mg·L^-1L-色氨酸)中分别加入0.1％(W/V)的氮源，氮源包括硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨，取50ml装于250ml三角瓶中，按照1％(V/V)的接种量接种OD₆₀₀值约为1的菌悬液，30℃，180rpm摇床培养24h，分别在10、15、20、32、44、56h动态取样，测定菌株生长情况(OD₆₀₀)和产IAA能力(OD₅₃₀)。

结果如图14和图15所示：以酵母粉为氮源时，X2菌株的生长量(OD₆₀₀)最大，为1.08，同时以酵母粉为氮源时，菌株产IAA含量(OD₅₃₀)最高，高达39.67mg·L^-1。

4、碳源对菌株IAA产量和菌株生长量的影响

在无机盐培养基(含有100mg·L^-1L-色氨酸)中分别加入1％(W/V)的碳源，碳源分别有葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖、果糖，取50ml装于250ml三角瓶中，按照1％(V/V)的接种量接种OD₆₀₀值约为1的菌悬液，30℃，180rpm摇床培养24h，分别在10、15、20、32、44、56h动态取样，测定菌株生长情况(OD₆₀₀)和产IAA能力(OD₅₃₀)。

结果如图12和图13所示：以甘露醇为碳源时，产IAA能力最高，可达24.89mg·L^-1，菌株生长量也达到最大，为0.20。显著高于其它碳源条件下的IAA含量和OD值。

实施例4

混合菌剂的秸秆培养降解试验

试验过程：称取粉碎后过20目筛的小麦秸秆粉5g于250ml三角瓶中，加水30ml，加硝酸钠2g，加入10ml离心重悬到无菌水中的菌液，使得菌液浓度达到10⁸CFU·ml^-1左右，培养15d后将秸秆取出，用蒸馏水反复清洗侧壁，80℃烘干至恒重，另设无菌水替代菌液，其它步骤一致，作为对照处理，每个处理三个重复。

降解试验如图16所示：经过15天的降解，加入菌剂的处理小麦秸秆的降解率达到16.1％，高于对照6.4％。

实施例5

玉米生长试验

试验土壤：取自安徽省蒙城县农业示范园

试验所用种子：将玉米种子均匀的铺在附有洁净滤纸的培养皿中，用蒸馏水在28℃下浸泡2天，选择出芽良好整齐的种子播种。

试验方法：以花盆(上口直径5cm、下底直径3cm、高5cm)为培养容器，每盆装土5.0kg，种植玉米2株，将供试菌株X2培养后制成菌水剂，按照5×10⁸CFU·g^-1的接种量接种到土壤中，以不接菌剂为对照，每组5个重复。播种前，分别用上述菌液浸泡经催芽的玉米种子。每盆放入土壤距离上沿1cm，将浸泡后的种子播种到盆里，再覆盖一层浮土，玉米每盆播种一粒种子，每种处理种植5盆。播种后将花盆置于人工气候箱中(白天30℃，夜晚25℃；光照时间为16小时)。所有处理在相同条件下随机排列，在同一时间进行浸盆浇水。N、K肥的用量分别为每盆尿素2.0g、氯化钾1.4g。

样品收获：玉米生长49天后采样，测量玉米的根长、植株干重、鲜重。

表3接种菌株X2对玉米植株的影响

注：*表示两处理间有显著性差异(P<0.05)，**表示两处理间有极显著差异(P<0.01)

结果如表3所示：菌株X2有促进植株生长的作用，在本试验中，经过接菌处理后，玉米植株和根系性状均有所改善，根表面积、植株地上部全钾、土壤碱解氮值较对照处理增加且差异显著(P＜0.05)；地上部干重较对照处理差异极显著(P＜0.01)。其中根表面积、植株地上部全钾、土壤碱解氮值较对照处理分别增长28.64％、15.16％、72.79％，地上部干重较对照增长33.33％。株高和土壤速效磷均比对照组有所增加，分别增加5.79％、8.32％。综上：接菌植株在形态和养分吸收上优于对照处理。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌X2及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1399

<212> DNA

<213> Rhizobium pusense

<400> 1

ccggttcgct gacctaccgt ggttagctgc ctccttgcgg ttagcgcact accttcgggt 60

aaaaccaact cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc 120

agcatgctga tctgcgatta ctagcgattc caacttcatg cactcgagtt gcagagtgca 180

atccgaactg agatggcttt tggagattag ctcgacatcg ctgtctcgct gcccactgtc 240

accaccattg tagcacgtgt gtagcccagc ccgtaagggc catgaggact tgacgtcatc 300

cccaccttcc tctcggctta tcaccggcag tccccttaga gtgcccaact aaatgctggc 360

aactaagggc gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct 420

gacgacagcc atgcagcacc tgttctgggg ccagcctaac tgaaggacat cgtctccaat 480

gcccataccc cgaatgtcaa gagctggtaa ggttctgcgc gttgcttcga attaaaccac 540

atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gttttaatct tgcgaccgta 600

ctccccaggc ggaatgttta atgcgttagc tgcgccaccg aacagtatac tgcccgacgg 660

ctaacattca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg 720

ctttcgcacc tcagcgtcag taatggacca gtaagccgcc ttcgccactg gtgttcctcc 780

gaatatctac gaatttcacc tctacactcg gaattccact tacctcttcc atactcaaga 840

tacccagtat caaaggcagt tccgcagttg agctgcggga tttcacccct gacttaaata 900

tccgcctacg tgcgctttac gcccagtaat tccgaacaac gctagccccc ttcgtattac 960

cgcggctgct ggcacgaagt tagccggggc ttcttctccg actaccgtca ttatcttcat 1020

cggtgaaaga gctttacaac cctaaggcct tcatcactca cgcggcatgg ctggatcagg 1080

cttgcgccca ttgtccaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1140

cagtcccaat gtggctgatc atcctctcag accagctatg gatcgtcgcc ttggtaggcc 1200

tttaccccac caactagcta atccaacgcg ggccaatcct tccccgataa atctttcccc 1260

cgtagggcgt atgcggtatt aattccagtt tcccggagct attccgcagg aaagggtatg 1320

ttcccacgcg ttactcaccc gtctgccact ccccttgcgg ggcgttcgac ttgcatggta 1380

agcctgccgc cattcgggc 1399

Claims (9)

1.一株产IAA和CMC酶的普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)X2，其特征在于，所述普沙根瘤菌X2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20912。

2.权利要求1所述普沙根瘤菌X2在制备IAA和/或CMC酶中的应用。

3.一种利用权利要求1所述普沙根瘤菌X2制备IAA和/或CMC酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

当利用所述普沙根瘤菌X2制备IAA时，调节含有100mg·L^-1L-色氨酸的LB培养基的pH值为6.0～9.0，接种所述普沙根瘤菌X2的菌悬液，震荡培养；所述菌悬液的体积为所述LB培养基体积的1％；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8～1.2；

当利用所述普沙根瘤菌X2制备CMC酶时，将液体发酵培养基调节pH值为4.0～6.0，接种所述普沙根瘤菌X2，震荡培养；所述普沙根瘤菌X2的接种体积为所述液体发酵培养基体积的1％；所述液体发酵培养基包括以下浓度的原料：氯化钠6g·L^-1、七水硫酸镁0.1g·L^-1、氯化钙0.1g·L^-1、磷酸二氢钾0.5g·L^-1、酵母膏10g·L^-1和秸秆20g·L^-1。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，在制备IAA和制备CMC酶时，所述震荡培养的温度均为28～30℃，震荡速度均为160～180rpm。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述LB培养基和液体发酵培养基还包括以下重量百分含量的成分：0.1％碳源、1％氮源。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖和果糖中的一种或多种；

所述氮源包括硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素和蛋白胨中的一种或多种。

7.权利要求1所述普沙根瘤菌X2在制备促腐促生菌剂中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述促腐促生菌剂的类型为菌水剂；所述菌水剂在应用时，以所述普沙根瘤菌X2的活菌数计，接种量为1～9×10⁶CFU·g^-1秸秆或1～9×10⁷CFU·g^-1土壤。

9.权利要求1所述普沙根瘤菌X2在促进秸秆还田效率和农作物增产的应用。

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