CN108396005A - 一株水稻内生促生根瘤菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株水稻内生促生根瘤菌及其用途。该水稻内生促生根瘤菌为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)，其菌株号为M15，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.15530。实验证明，栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15能产生IAA，每毫升OD600nm值为1的发酵液中含有85.32μg IAA。栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15能产生ACC脱氨酶，栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的ACC脱氨酶活性为4.86μmolα‑丁酮酸/h·mg蛋白。

Description

一株水稻内生促生根瘤菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物肥料领域中一株水稻内生促生根瘤菌及其用途。
背景技术
根瘤菌是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，能够侵染豆科植物根部或茎部形成根瘤或者茎瘤，以共生形式固定空气中的N2为植物提供可吸收利用的NH4 +。在农业生产中，根瘤菌与豆科作物进行轮作、间作可提高土壤肥力，对增加作物产量起着至关重要的作用。此外，由于根瘤菌可以在作物根部大量的生长繁殖，因此减小了病原微生物的繁殖机会；同时根瘤菌还可诱导植物产生系统抗性，减轻作物发病的几率，提高其抗病性。大豆接种根瘤菌后，可减少氮肥的使用量，有效缓解和改善大豆重迎茬及根腐病，显著提高作物的品质与产量；并且减轻了因大量施用化肥、生产化肥而造成的环境污染。根瘤菌还可以加强作物的抗旱能力。根瘤菌在一些非豆科作物(如棉花、甜玉米、水稻、小麦、油菜等)中被发现也已经是不争的事实,也可作为多种非豆科作物(如小麦、水稻、玉米、土豆、萝卜、油菜等)联合的固氮细菌和植物根际促生细菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)。
目前的大多数研究表明，根瘤菌可以显著增加氮利用率，提高水稻的产量。然而进一步研究表明，氮利用率提高的主要原因并不是因为生物固氮作用，而是根瘤菌分泌的植物生长素IAA和GA7刺激根发生变化，根的结构改变使水稻增加了对氮和土壤中其他营养物的摄取，或者是因为增加了水稻抗病性能、加强了光合作用等。
菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需求促进生长好、抗逆性强的微生物肥料生产用菌种。
发明内容
本发明的目的是提供一株产生植物生长素IAA并具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性的根瘤菌新种。
本发明所提供的根瘤菌新种是栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)，其菌株号为M15，该菌株已于2018年03月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15530，以下简称为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15。
栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15具有序列表中序列1所示的16S rDNA序列。
本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂含有所述栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15。
上述菌剂具有下述1)-4)中全部或部分特性：
1)产生生长素IAA；
2)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC)；
3)产生铁载体；
4)促进植物生长。
上述菌剂的活性成分可为所述栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据该菌剂促进植物生长的效果确定。
该菌剂除包含活性成分外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。
所述菌剂中，栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15或所述菌剂的下述至少一种应用也属于本发明的保护范围：
A1)在制备产生生长素IAA的产品中的应用；
A2)在制备生长素IAA中的应用；
A3)在制备产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的产品中的应用；
A4)在制备1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中的应用；
A5)在制备促进植物生长的产品中的应用；
A6)在促进植物生长中的应用。
上述菌剂和应用中，所述产品均可为菌剂、微生态制剂或生物肥料。
本发明的另一个目的是提供一种培养栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的方法。
本发明所提供的培养栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的方法，包括将栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
实验证明，栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15能产生IAA，每毫升OD600nm值为1的发酵液中含有85.32μg IAA。栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15能产生ACC脱氨酶，栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的ACC脱氨酶活性为4.86μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白。栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15具有产IAA能力，进而具有促进植物根系生长、增强根系吸收矿物质营养和水分的能力，对于植物生长具有很好的促进作用。栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15在微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：栖稻根瘤菌
拉丁名：Rhizobium oryzihabitans
菌株编号：M15
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年03月30日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15530
附图说明
图1为根据16S rRNA基因序列构建的栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的与相关模式菌的系统进化树。其中，内生细菌M15为栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15。
图2为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15与Rhizobium属相关模式菌株基因组构建的系统发育进化树。其中，内生细菌M15为栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15。
图3为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15分泌生长素的定性检测照片。图中，M15为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15。
图4为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15在CAS蓝色定性检测平板上产生了黄色晕圈的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面实施例中所用培养基的配方如下：
R2A固体培养基的配方：0.5g酵母浸粉，0.5g胰蛋白胨，0.5g酪蛋白氨基酸，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g丙酮酸钠，0.3g K2HPO4，0.05g MgSO4·7H2O，琼脂20g，去离子水定容至1000mL，pH为7.2±0.2。
R2A液体培养基的配方：0.5g酵母浸粉，0.5g胰蛋白胨，0.5g酪蛋白氨基酸，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g丙酮酸钠，0.3g K2HPO4，0.05g MgSO4·7H2O，0.2g L-色氨酸，去离子水定容至1000mL，pH为7.2±0.2。
改良YMA无氮培养基的配方：10g甘露醇，1g酵母膏，0.5g K2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.1g NaCl，0.05g(NH4)2SO4，0.00121g Na2MoO4·2H2O，5g蔗糖，20g琼脂，去离子水定容至1000mL，pH为6.8-7.0。
DF培养基：4.0g KH2PO4，6.0g Na2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，2.0g葡萄，2.0g葡萄糖酸钠，2.0g柠檬，2.0g(NH4)2SO4，组分一、组分二溶液各0.1ml，H2O 1000mL，pH 7.2；其中组分一：10mg H3BO3，11.19mg MnSO4·H2O，124.6mg ZnSO4·7H2O，78.22mg CuSO4·5H2O，10mgMoO3，溶于100mL灭菌蒸馏水中；组分二：100mg FeSO4·7H2O溶于10mL灭菌蒸馏水中。
不含(NH4)2SO4的DF培养基：与DF培养基的区别仅在于不含(NH4)2SO4。
ADF培养基：将ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)溶于超纯水，过滤灭菌，加到不含(NH4)2SO4的灭菌DF培养基中，使ADF的浓度至3.0mM。
实施例1、栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的分离与鉴定
1栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的分离
栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15分离自水稻根，水稻品种为90-3(Oryza sativa L.japonica 90-3)，采样地点为河北省滦南县桑园镇百亩农业试验示范基地。分离过程：水稻根表面采用乙醇-次氯酸钠联合灭菌，梯度稀释后，在R2A固体培养基上涂布分离，28℃培养48h，挑取平板上单菌落划线纯化，得到纯化菌株，接斜面置于4℃冰箱内保存。将其中一株分离纯化所得的内生细菌编号为M15，以下简称内生细菌M15。
2栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的鉴定
2.1形态学鉴定
通过平板划线，对处于对数生长期的内生细菌M15进行菌落菌体状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。另一方面，对处于对数生长期的内生细菌M15经革兰氏染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明内生细菌M15的菌落形态呈圆形，直径1mm-2mm，乳白色，不透明，表面湿润，有凸起，边缘整齐。光学显微镜观察其菌体为革兰氏染色阴性，细杆状，不产芽孢。
2.2 16S rRNA基因及基因组序列同源性分析
内生细菌M15总基因组DNA的提取采用天根细菌基因组提取试剂盒。16S rRNA基因的扩增采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。反应体系为50μL：包括10×buffer(5μL)、dNTP(2.5mmol/L)4μL、引物27F(10mmol/L)2μL、引物1492R(10mmol/L)2μL、Taq酶(5U/L)0.25μL、3μLDNA作为模板、ddH2O补足至50μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增片段克隆到载体PEASY-T1(天根公司)，用蓝白斑筛选的方法选取阳性克隆，委托上海生工以T7和SP6作为测序引物双向测序。相关序列通过Eztaxon server(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/ezt_identify)进行序列分析。
通过16s rRNA基因片段进行扩增并克隆测序，获得长度为1448bp片段，其序列详见序列表中序列1。将该基因序列在Eztaxon网站进行相似性比对，结果表明内生细菌M15的16s rRNA基因序列与Rhizobium radiobacter ATCC 19358T(99.64％)，Rhizobiumpusense LMG 25623T(99.36％)，Agrobacterium salinitolerans YIC 5082T(99.08％)，和Rhizobium nepotum 39/7T(99.08％)相似性最高。依据16S rRNA基因序列构建的系统进化树(图1)。结果表明内生细菌M15与模式菌株Rhizobium pusense LMG 25623T稳定的聚在一起。
内生细菌M15的基因组测序是由上海派诺森生物科技有限公司采用Hiseq 2500(Zetabio)完成。获得基因组的序列长度为4,985,334bp，G+C mol％值为59.3％。与相近类群基因组构建进化树，结果如图2，结果发现M15与Rhizobium pusense LMG 25623T和Agrobacterium salinitolerans YIC 5082T聚为同一分支。根据基因组数据，通过http://ggdc.dsmz.de网站，计算基因组间的DNA相似性，结果发现，M15与Rhizobium pusense LMG25623T、Agrobacterium salinitolerans YIC 5082T和Rhizobium nepotum 39/7T DNA相似性分别为45.2％，47.3％和46.6％，均远低于不同种间杂交值低于70％的分类标准。同时，ANI值通过https://www.ezbiocloud.net/tools/ani计算，内生细菌M15与Rhizobiumpusense LMG 25623T、Agrobacterium salinitolerans YIC 5082T和Rhizobium nepotum397T的ANI值分别是87.23％，88.83％和85.86％，而不同种间ANI值的临界值为95％-96％。
尽管内生细菌M15与已知类群的16S rRNA相似性高达99.64％，但ANI值及DNA-DNA杂交值均远低于种水平的分类标准，因此可以确定内生细菌M15为Rhizobium属的新种。
2.3 C/N源利用的测定
以Rhizobium pusense LMG 25623T为标准菌株，利用微生物全自动鉴定分析系统(Biolog)对内生细菌M15与Rhizobium pusense LMG 25623T进行C/N源利用的测定。具体方法如下：把活化好的菌体在YMA培养基(酵母甘露醇琼脂)上划线接种，30℃培养直至生长对数期；用棉签从YMA培养基上挑取菌加到Biolog培养液中。并将装培养液的试管放入浊度计中检测浊度，按照要求将菌液浊度调到规定值后混匀，制成接种液。然后将接种液倒入V型加样槽中，用排枪把接种液打到Biolog板子中的96孔内(GN板)。盖上盖子，适温培养4-6h,12-24h；在Biolog仪器上分别读取两次数据(4-6h和12-24h)，并综合记录结果(表1)。
结果表明内生细菌M15和Rhizobium pusense LMG 25623T在如下21项生理生化特征方面存在明显差别：1)内生细菌M15不能利用糊精，Rhizobium pusense LMG 25623T能利用糊精，但对糊精的利用能力很弱；2)内生细菌M15能较好地利用N-乙酰基-D-半乳糖胺，Rhizobium pusense LMG 25623T不能利用N-乙酰基-D-半乳糖胺；3)内生细菌M15能较好地利用N-乙酰基-D-氨基葡萄糖，Rhizobium pusense LMG 25623T对N-乙酰基-D-氨基葡萄糖的利用能力很弱；4)内生细菌M15对乳果糖的利用能力很弱，Rhizobium pusense LMG25623T能较好地利用乳果糖；5)内生细菌M15不能利用阿洛酮糖，Rhizobium pusense LMG25623T能较好地利用阿洛酮糖；6)内生细菌M15能较好地利用L-棉子糖，Rhizobiumpusense LMG 25623T对L-棉子糖的利用能力很弱；7)内生细菌M15不能利用甲基丙酮酸，Rhizobium pusense LMG 25623T能利用甲基丙酮酸，但对甲基丙酮酸的利用能力很弱；8)内生细菌M15不能利用单甲基琥珀酸，Rhizobium pusense LMG 25623T能利用单甲基琥珀酸，但对单甲基琥珀酸的利用能力很弱；9)内生细菌M15不能利用顺-乌头酸，Rhizobiumpusense LMG 25623T能较好地利用顺-乌头酸；10)内生细菌M15不能利用甲酸，Rhizobiumpusense LMG 25623T能较好地利用甲酸；11)内生细菌M15不能利用β-羟基丁酸，Rhizobiumpusense LMG25623T能利用β-羟基丁酸，但对β-羟基丁酸的利用能力很弱；12)内生细菌M15能较好地利用α-酮戊二酸，Rhizobium pusense LMG 25623T不能利用α-酮戊二酸；13)内生细菌M15能较好地利用D,L-乳酸，Rhizobium pusense LMG 25623T对D,L-乳酸的利用能力很弱；14)内生细菌M15不能利用溴丁二酸，Rhizobium pusense LMG 25623T能较好地利用溴丁二酸；15)内生细菌M15能较好地利用L-丙氨酸，Rhizobium pusense LMG 25623T对L-丙氨酸的利用能力很弱；16)内生细菌M15能较好地利用L-丙氨酰甘氨酸，Rhizobiumpusense LMG 25623T对L-丙氨酰甘氨酸的利用能力很弱；18)内生细菌M15不能利用L-苏氨酸，Rhizobium pusense LMG 25623T能利用L-苏氨酸，但对L-苏氨酸的利用能力很弱；19)内生细菌M15能利用肌苷，对肌苷的利用能力很弱，Rhizobium pusense LMG 25623T不能利用肌苷；20)内生细菌M15能利用尿苷，但对尿苷的利用能力很弱，Rhizobium pusense LMG25623T不能利用尿苷；21)内生细菌M15能较好地利用丙三醇，Rhizobium pusense LMG25623T对丙三醇的利用能力很弱(表1)。
表1.内生细菌M15和Rhizobium pusense LMG 25623T对碳源和氮源利用的对比
注：所有的实验都是在相同的条件下进行的。“┿”表示阳性，即可以较好地利用；“W”表示弱阳性，即利用能力很弱；“━”表示阴性，即不能利用；黑体显示有差异的生理生化特征。
2.4脂肪酸特征
参照Sasser M法提取总脂。将提取的总脂进行皂化、甲基化处理后，萃取上层有机相，用具有气相色谱(GC)分析功能的MIDI微生物鉴定系统对内生细菌M15和Rhizobiumpusense LMG 25623T进行脂肪酸组成分析。具体操作按照仪器使用说明进行。按MIDI微生物鉴定系统分析结果见表2，内生细菌M15的主要脂肪酸组成为C9:0，C13:1 at 12-13，C16:0，C16:0 3-OH，C19:0 cycloω8c，第二特征特征类型*，第三特征特征类型*，第八特征特征类型*。结果表明，内生细菌M15同近缘菌LMG 25623(Rhizobium pusense)脂肪酸组成成分基本相同，但含量存在较明显的差异。
表2 内生细菌M15和Rhizobium pusense LMG 25623T脂肪酸的组成比较(>1％)
注：数据均来源于本实验，且表中数据为三次重复实验结果的平均值；“–”表示未检测。第二特征特征类型*包括醛-C12：0和/或未知等效链长度(ECL)10.9525；第三特征特征类型*包括C16:1ω6c和/或C16:1ω7c；第八特征特征类型*包括C18:1ω7c和/或C18:1ω6c。
综上所述，尽管内生细菌M15与已知类群的16S rRNA相似性高达99.64％，但ANI值及DNA-DNA杂交值均远低于分类标准，并且生理生化特征差别较大，脂肪酸含量差别也较大，因此可以确定内生细菌M15为Rhizobium属的新种，命名为Rhizobium oryzihabitans，其中文名称为栖稻根瘤菌。该栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15已于2018年03月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15530。以下简称为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15。
实施例2、栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的生理生化特性
1.1耐盐能力测定：在含有0％、1.0％、3.0％、5.0％、7.0％、8.0％、10.0％NaCl的YMA液体培养基中接种相同浓度的栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15菌液(1％接种量，v/v)，30℃振荡培养7天，用UV-1800紫外分光光度仪测量600nm处的吸光值，发现栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15在盐度7.0％依旧可以生长(长势较弱)，且最适生长盐浓度范围为0-3％。
1.2pH范围测定：配制磷酸盐缓冲液(甲液：磷酸8.3mL，加去离子水混匀定容至500mL；乙液：Na2HPO4 14.326g，加去离子水混匀定容至500mL；取甲液72.5mL与乙液27.5mL混匀，pH约2.0)、乙酸-乙酸钠缓冲体系(0.2mol/L乙酸与0.2mol/L乙酸钠进行配制，pH约5.0-6.0)、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(取6.805g KH2PO4，加去离子水混匀定容至350mL，用1mol/L NaOH溶液调pH约7.0-8.0)和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲体系(0.1mol/L Na2CO3与0.1mol/L NaHCO3以1：9的比例混合，pH约9.0-10.0)，在含有3％NaCl的YMA液体培养基中用上述缓冲液调pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，接菌、培养及OD测量同盐度实验，结果表明栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15最适生长pH为5.0-12.0。
1.3温度生长范围：在pH为6.0、含有3％NaCl的YMA液体培养基中接入栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15菌液，分别在4、15、25、30、37、40、45和50℃条件下震荡培养，测OD值发现：栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15在15-50℃都可以生长，且最适生长温度为28-30℃。
1.4氧化酶活性：将栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15接种到YMA培养基上培养18-24h。在干净培养皿中放一张滤纸(滤纸不能进行灭菌锅灭菌，取新开封的滤纸直接使用)，滴上数滴l％(w/v)对氨基二甲苯胺盐酸盐溶液，使滤纸湿润，室温自然干燥，用竹签(不能用铁、镍等金属)挑取菌体涂抹到滴加l％(w/v)对氨基二甲苯胺盐酸盐溶液的干燥的滤纸上，并立即计时，10s变红者为阳性反应，10-60s现红色为延迟反应，60s以上现红色者按照阴性处理。结果表明栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15具有氧化酶活性。
1.5过氧化氢酶活性：将栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15菌体接种到YMA培养基上培养18-24h。取一干净培养皿，滴加数滴5％H2O2溶液，用竹签挑取菌体涂抹于5％H2O2溶液中，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。结果表明栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15具有过氧化氢酶活性。
实施例3、栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的分泌生长素的定性检测和定量分析
根据参考文献(Eric G lickm ann,Yves Dessaux.A critical exam ination ofthe specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced byphytopathogentic bacteria[J].Applied and Environ mental Microbiology,1995(2):793-796)所述的Salkowski比色法测定栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15分泌植物生长激素(IAA)性能。将栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15接种于R2A液体培养基，28℃摇床，180rpm震荡培养4d，得到栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15发酵液。以未接菌的R2A液体培养基作为空白对照，测定栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15发酵液的OD600nm值，结果表明该栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15发酵液的OD600nm值为1.52(该数值为去除空白对照的OD600nm的数值)。
定性检测按照如下操作：取50μL栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15发酵液与50μL Salkowski比色液(50mL 35％HClO4+1mL 0.5M FeCl3)滴于白色陶瓷板上于室温避光放置0.5h后观察，颜色变红表示能够分泌IAA。将50μL栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15发酵液中加入50μL 50mg/L IAA的比色液处理作为阳性对照，将50μLR2A液体培养基中加入50μL 50mg/L IAA的比色液处理作为阴性对照。实验设三次重复。
定量分析按照如下操作：将栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15发酵液用无菌R2A液体培养基稀释至OD600nm值为1(以未接菌的R2A液体培养基作为空白对照)，10000rpm离心10min，取上清液与Salkowski比色液(成分同上)等体积混合，避光静置0.5h后在530nm波长处比色，每个样品设3个重复，空白对照为未接菌的R2A液体培养基与Salkowski比色液的等体积混合液。计算菌发酵液的OD600nm值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量。标准曲线的绘制按照参考文献(Fry NK,Warwick S,Saunders NA.The use of16S ribosomal RNA analyses to investigate the phylogeny of the familyLegionellaceae.J Gen Microbiol,1991,137(5):1215-1222)的方法，采用分析纯的3-吲哚乙酸(3-IAA)梯度稀释制备。最终实验数据为三次重复实验结果的平均值。
定性检测结果显示，在栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15发酵液滴加Salkowski比色液后，菌液颜色变红，表明栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15能够分泌植物生长激素(IAA)。进一步定量分析结果表明，每毫升OD600nm值为1的发酵液中含有85.32μg IAA，IAA分泌能力较强。
实施例4、栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的ACC脱氨酶活性测定
(1)初筛
用排枪向96孔板中每孔加入200μL TSB(胰酪胨大豆肉汤培养基)液体培养基，点接栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15，30℃培养24h。吸取10μL加入到200μL DF培养基中，30℃培养24h。吸取10μL加入到200μL ADF培养基中，30℃培养48h。将在ADF中生长的菌种重复转接一次，30℃培养48h后，利用酶标仪测定菌浓度OD600nm，以不接菌的ADF为阴性对照，测得的数值去除阴性对照的OD600nm即为实际菌液浓度，实际菌液浓度OD600nm大于0.1以上，表明栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15能够利用1-氨基环丙烷羧酸(ACC)作为唯一氮源生长，初步认为栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15是ACC脱氨酶活阳性菌。
(2)ACC脱氨酶活性测定
1)菌体收集
将栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15接入5mL TSB液体培养基,30℃培养24h，活化菌体。吸取0.5mL菌液至60mL TSB培养基中，30℃扩培24～48h后，4℃，8000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。将菌体用15mL不含(NH4)2SO4的DF培养基离心洗涤两次。将菌体重悬于24mL ADF培养基中(ACC终浓度3mM)，30℃培养24h，4℃，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，并记录菌体重量。将菌体用20mL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)离心洗涤两次，将菌体平均分于三个EP管中。-20℃贮存菌体。
2)粗酶液的制备
取贮存菌体重悬于1mL0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，转移到1.5mL离心管中，12000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体。将菌体重悬于600μL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，加入30μL甲苯，迅速振荡30s，破碎细胞，得到粗酶液。分装：取200μL粗酶液4℃贮存，用于蛋白浓度测定；其余粗酶液马上用于ACC脱氨酶活性测定。
3)ACC脱氨酶活性测定
取200μL粗酶液转移到1.5mL离心管中，加入20μL 0.5M ACC溶液混匀。同时做不添加ACC的空白对照。置于30℃水浴15min。随即加入1mL 0.56M HCl溶液终止反应。12000rpm离心5min，取上清液。在玻璃管中，每1mL上清液加入800μL0.56M HCl溶液和300μL浓度为0.2％的2,4-二硝基苯肼溶液(2M HCl溶液中溶解)，30℃保温30min。加入2mL 2M NaOH溶液混匀。用蒸馏水替代上清液，其他同上，用作分光光度计的调零使用。540nm测吸光度值，与对照组进行比较。对照α-丁酮酸标准曲线和牛血清白蛋白标准曲线计算菌株的酶活性。实验重复三次。ACC脱氨酶表示方法为：上述反应条件下，每毫克菌体蛋白每小时催化ACC脱氨形成α-丁酮酸的微摩尔数，单位是(μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白)。
其中，α-丁酮酸标准曲线制作方法如下：将α-丁酮酸溶于10mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)配制成10mM的标准液。分别取0、5、10、20、40、60、80、100μL标准液加入试管中，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)补足至1mL。再依次加入800μL 0.56M HCl溶液和300μL 2,4-二硝基苯肼，30℃水浴30min。加入2mL 2M NaOH溶液，540nm测吸光度值。其中，粗酶液蛋白含量测定方法如下：用PBS缓冲液配置0.1mg/mL的BSA标准液。分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0mL的BSA稀释液分别加入到试管中，加入PBS缓冲液补足到1mL。向各试管中加入3mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5min。利用紫外分光光度计测定各样品595nm处吸光值，以不含BSA的样品作为空白对照。绘制BSA标准曲线。各取200μL粗酶液于试管中，加入PBS缓冲液补足到1mL。向各试管中加入3mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5min。利用分光光度计测定各样品595nm处吸光值，以不含BSA的样品的吸光值作为空白对照。
结果显示栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的ACC脱氨酶活性为4.86μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白。
实施例5、栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15的产铁载体能力测定
CAS蓝色检测液是由络天青(CAS)、十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)和铁离子组成的一种复合物CAS-Fe-HDTMA，呈亮蓝色，当铁离子从CAS蓝色复合物中解离出来，CAS蓝色检测液颜色变为桔黄色。
定性检测：将活化后的栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15分别点接于CAS蓝色定性检测平板上进行培养，培养基平板底部划小方格，并标号，每个平板点接约25个菌，30℃培养一周。产生黄色晕圈或紫色晕圈的则表示产铁载体。结果表明栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15在CAS蓝色定性检测平板上产生了黄色晕圈，说明栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)能产生产铁载体。
序列表
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 一株水稻内生促生根瘤菌及其用途
<130> GNCFH181014
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> 栖稻根瘤菌（Rhizobium oryzihabitans）
<400> 1
tagagtttga tcatggctca gaacgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgaa 60
cgccccgcaa ggggagtggc agacgggtga gtaacgcgtg ggaacatacc ctttcctgcg 120
gaatagctcc gggaaactgg aattaatacc gcatacgccc tacgggggaa agatttatcg 180
gggaaggatt ggcccgcgtt ggattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac 240
gatccatagc tggtctgaga ggatgatcag ccacattggg actgagacac ggcccaaact 300
cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc 360
cgcgtgagtg atgaaggcct tagggttgta aagctctttc accggagaag ataatgacgg 420
tatccggaga agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggggc 480
tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg cggatattta agtcaggggt 540
gaaatcccag agctcaactc tggaactgcc tttgatactg ggtatcttga gtatggaaga 600
ggtaagtgga attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggagga acaccagtgg 660
cgaaggcggc ttactggtcc attactgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg ttagccgtcg ggcagtatac 780
tgttcggtgg cgcagctaac gcattaaaca ttccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta 840
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 900
caacgcgcag aaccttacca gctcttgaca ttcggggtat gggcattgga gacgatgtcc 960
ttcagttagg ctggccccag aacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctt agttgccagc attgagttgg 1080
gcactctaag gggactgccg gtgataagcc gagaggaagg tggggatgac gtcaagtcct 1140
catggccctt acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg tggtgacagt gggcagcgag 1200
acagcgatgt cgagctaatc tccaaaagcc atctcagttc ggattgcact ctgcaactcg 1260
agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cagatcagca tgctgcggtg aatacgttcc 1320
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg ttttacccga aggtagtgcg 1380
ctaaccgcaa ggaggcagct aaccacggta gggtcagcga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1440
ggtaacca 1448

Claims (6)

1.栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)，其菌株号为M15，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.15530。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的栖稻根瘤菌(Rhizobiumoryzihabitans)M15。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述1)-4)中全部或部分特性：
1)产生生长素IAA；
2)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶；
3)产生铁载体；
4)促进植物生长。
4.权利要求1所述的栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)的下述至少一种应用：
A1)在制备产生生长素IAA的产品中的应用；
A2)在制备生长素IAA中的应用；
A3)在制备产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的产品中的应用；
A4)在制备1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中的应用；
A5)在制备促进植物生长的产品中的应用；
A6)在促进植物生长中的应用。
5.权利要求2或3所述的菌剂的下述至少一种应用：
A1)在制备产生生长素IAA的产品中的应用；
A2)在制备生长素IAA中的应用；
A3)在制备产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的产品中的应用；
A4)在制备1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中的应用；
A5)在制备促进植物生长的产品中的应用；
A6)在促进植物生长中的应用。
6.培养权利要求1所述的栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)的方法，包括将权利要求1所述的栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
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GR01 Patent grant
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