CN105524874B - 一种甲基营养型芽孢杆菌nkg‑1及植物促生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG‑1），所述甲基营养型芽孢杆菌NKG‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码是CGMCC12055，保藏日期是2016年1月15日。利用该菌株实施的植物促生方法，具有明显的促生作用，因此具有良好的应用前景。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌NKG-1及植物促生方法
技术领域
本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌，还涉及利用该菌株实施的植物促生方法，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)，及其对番茄、小白菜、辣椒的促生方法。
背景技术
为了促进植物生长，例如各种农作物，目前通常会对植物各个生长阶段施加肥料，其中施加的主要是化学肥料，具有施肥方便、见效快等特点。但是长期大量施用化学肥料导致残留及环境污染，最终危害人类健康并破坏生态平衡。生物促生因其对环境、生态及人类健康安全、无毒等优点得到了世界各国的广泛重视并发挥着越来越重要的作用。
芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称。芽孢杆菌属的细菌具有生长速度快、营养需求简单、有较强的耐热性及抗逆性；利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。此外，还具有在植物表面易于存活与繁殖、对人畜无害、不污染环境、制剂稳定、施用方便等优势而备受瞩目。不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业的可持续发展提供了保障。芽孢杆菌作为一种理想的生防微生物，逐渐成为近年来研究的热点并越来越引起人们重视。目前，具有促生作用的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。
由于芽孢杆菌既具有广阔的开发应用前景，开发新筛选的未定种的芽孢杆菌及对新菌株的促生作用进行鉴定是具有非常重要的意义的。
发明内容
针对现有技术中存在的需求，本发明的目的在于提供一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)，是一种全新筛选出来的株系，还提供了一种利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)实施的植物促生方法，具有明显的促生作用，因此具有良好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码是CGMCC12055，保藏日期是2016年1月15日。
利用前述的甲基营养型芽孢杆菌NKG-1实施的植物促生方法，用于促进植物生长发育。
进一步，使用所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液对植物生长期进行灌根，或者在植物播种之前浸种；或者将所述菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得液剂，利用所述液剂对植物生长期进行灌根，或者在植物播种之前浸种。
进一步，所述植物为番茄、小白菜或辣椒。
进一步，所述植物为番茄，在番茄幼苗长出2片真叶时利用所述菌液灌根，每隔10天灌根一次，其他时间浇灌清水，共灌根三次。
进一步，所述植物为小白菜，在小白菜播种之前利用所述菌液浸泡小白菜种子24h，然后实施播种。
进一步，所述植物为辣椒，在辣椒幼苗长出2片真叶时利用所述菌液灌根，每隔10天灌根一次，其他时间浇灌清水，共灌根三次。
进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×(106-109)cfu/mL。
进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×107cfu/mL。
本发明利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)实施的植物促生方法具有以下优点：
菌株NKG-1菌液灌根对番茄苗具有明显的促进生长的作用，菌液灌根后的番茄苗与对照组相比生长迅速，叶片浓密，茎部粗壮，尤其是根系发达，根长增加显著，其株高比对照组增加了11.88％，鲜重增加了34.93％，根长增加了54.68％。
菌株NKG-1菌株菌液可以明显促进小白菜的生长，菌液浸种后的小白菜苗比对照组根长增加43.10％，鲜重增加了36.71％，干重增加了33.33％。菌液浸种后的小白菜苗真叶比对照组出现的早，叶片大，叶柄粗，根系发达，生长更均一、旺盛。
菌株NKG-1菌液灌根对辣椒苗具有明显的促进生长的作用，菌液灌根后的辣椒苗与对照组相比生长迅速，叶片浓密，茎部粗壮，尤其是根系发达，根长增加显著，比对照组根长增加31.37％，鲜重增加了27.54％，干重增加了36.31％。
本发明属于生物促生，对环境无污染，没有农药残留，不会破坏生态平衡。
附图说明
图1为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片(10μm级别)；
图2为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片(2μm级别)；
图3为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片(1μm级别)；
图4为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对番茄的促生效果对比图(植物幼苗俯视)；
图5为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对番茄的促生效果对比图(植物幼苗主视)；
图6为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对小白菜的促生效果对比图(植物幼苗俯视)；
图7为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对小白菜的促生效果对比图(植物幼苗主视)；
图8为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对辣椒的促生效果对比图(植物幼苗俯视)；
图9为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对辣椒的促生效果对比图(植物幼苗主视)；
图10为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的系统发育分析图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达到预定技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图和较佳实施例，对本发明的结构、特征以及功效详细说明如下。
本发明所提供的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicusstrain NKG-1),是从吉林长白山地区分离获得的，已于2016年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为No.12055。
(一)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的分离与纯化
本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)是从吉林长白山土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
从土壤中分离：称取土样1g，放入盛有99ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀30min，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混和均匀，以此类推分别制成10-2、10-3、10-4不同稀释度的土壤溶液。取100μL土壤溶液涂布于TSA培养基平板上，每个稀释度做3个重复,28℃培养2-3d。挑取单菌落于TSA培养基平板上划线，定时观察菌落生长情况，然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别制作斜面标号保存于4℃冰箱。胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)配方：(g/L)胰蛋白胨15.0；大豆蛋白胨5.0；氯化钠5.0；琼脂15.0；pH值7.3±0.2；称取后，加热搅拌溶解于蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌，倒平板。
(二)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的形态观察
采用梯度稀释法制备strain NKG-1菌悬液，吸取30μL适宜浓度的菌悬液涂布于LB、NA、PDA培养基平板上进行单孢培养，24h-48h后对长出的单菌落的大小、形状、表面、边缘、颜色及透明度等培养特性进行观察。
在LB培养基上培养strain NKG-1菌株，采用插片培养法(阎逊初，1984)在光学显微镜下观察芽孢生长情况及形态特征，光学显微镜镜检时用镊子小心拔出盖玻片，有菌的一面朝下放在载玻片上直接观察即可；电子显微镜镜检时先将盖玻片放入2-4％戊二醛固定液中固定1-2天，0.1M pH7.2PBS缓冲液洗，用1％OsO4固定后1-2小时，再用重蒸水冲洗30分钟，随后用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇梯度脱水，每级15-20分钟，样品脱水后用醋酸异戊酯处理，CO2临界点干燥，干燥好的样品粘贴在样品台上，用离子溅射仪表面喷金，喷金后样品在扫描电镜下扫描，观察芽孢形态拍照并记录。
通过培养和观察发现菌体呈短杆状，芽孢椭圆形，位于菌体中央或稍偏，芽孢大小在1.5μm-2.2μm范围内。菌落为圆形，LB培养基表面和边缘均光滑，NA、PDA培养基表面有褶皱(NA固体培养基：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂17.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。)，不透明，呈白色。革兰氏染色阳性。(电子显微镜扫描图片见图1、图2、图3)
(三)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的生理生化特性分析
挑取单菌落进行形态观察及生理生化测定，生理生化测定参照东秀珠等方法，分别设计吲哚试验、淀粉水解试验、甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、尿素试验、产H2S试验、葡萄糖产气试验及乳糖利用试验，充分验证其菌株的生理生化特征。生理生化特性测定，吲哚试验和甲基红试验为阴性，能利用柠檬酸盐和尿素，有淀粉水解反应发生，能产生H2S，能利用乳糖产酸产气。
(四)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的16srRNA基因序列鉴定
将单菌落接种于LB培养基中，培养经过24h小时后，取1μL进行菌落PCR验证。用于菌液PCR扩增的引物如下：正向引物F：5'-GCAGTCGAGCGGACAGAT-3'；反向引物R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应体系如下:2×TaqPCRmastermix12.5μL，正向F引物10.5μL，反向R引物0.5μL，菌液模板DNA 1μL，ddH2O 10.5μL，总体系25μL。PCR扩增条件为:94℃5min；94℃1min；51℃30s；72℃1min，35个循环；72℃10min。电泳采用琼脂糖凝胶电泳，核酸染料为EB，Maker为DL2000。最后将PCR纯化产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。所得序列NCBI GeneBank核酸数据库中相关序列进行比对分析。用正向引物F和反向引物R进行16SrRNA进行PCR扩增，得到1397kb的片段。通过比对该序列与甲基营养型芽孢杆菌16S rRNA基因在相应区域核苷酸序列相似性均为100％。
将获得的芽孢杆菌strain NKG-116s rRNA序列同GenBank中已有的18条不同种的芽孢杆菌16s rRNA序列进行比较，其中选择差异较大的组外序列为根瘤菌(Rhizobiumsp.)。通过DNAMAN version 6.0(LynnonBiosoft)对核苷酸和相应氨基酸序列进行分析对比，用Bioedit对全长核苷酸序列进行编辑整理。MEGA(version 5.0)进行Clustal W多序列比对和系统进化分析；通过neighbour-joining的方法构建进化树，bootstrap设置为1000次重复。结果表明，获得的芽孢杆菌strain NKG-1其系统发育分析与甲基营养型芽孢杆菌strainR1B和strain MER处于同一分支，说明其亲缘关系较近，结合形态结构和生理生化特性，我们将该菌株鉴定为甲基营养性芽孢杆菌(Bacillus methylotrophilus)，命名为Bacillus methylotrophicus strain NKG-1。
芽孢杆菌strain NKG-1系统发育如图10所示，图中：
Bacillus methylotrophicus甲基营养型芽孢杆菌strain NKG-1；
Bacillus methylotrophicus甲基营养型芽孢杆菌strainR1B；
Bacillus methylotrophicus甲基营养型芽孢杆菌strainMER；
Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌；
Bacillus inaquosus缓病芽孢杆菌；
Bacillus popilliae日本金龟子芽孢杆菌；
Bacillus licheniformis地衣芽孢杆菌；
Bacillus pumilus短小芽孢杆菌；
Bacillus cirulans环状芽胞杆菌；
Bacillus coagulans凝结芽孢杆菌；
Bacillus firmus坚强芽孢杆菌；
Bacillus cereus蜡状芽胞杆菌；
Bacillus megaterium巨大芽胞杆菌；
Bacillus A5 2009芽孢杆菌A5 2009；
Bacillus sphaericus球形芽孢杆菌；
Bacillus larvae幼虫芽孢杆菌；
Bacillus macerans浸麻芽孢杆菌；
Bacillus polymyxa多粘芽孢杆菌；
Rhizobium sp.根瘤菌。
甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的基因序列见序列表。
(五)甲基营养型芽孢杆菌菌株(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)发酵过程
LB液体培养基培养基，配方为：蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，酵母膏10.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2。
大量液体发酵培养基配方(质量百分含量)：黄豆粉2.5％，玉米粉3.5％，NaCl0.1％，CaCO30.2％，其余为水。
大量固体发酵过程：
(1)将甲基营养型芽孢杆菌菌株NKG-1的孢子移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养18h得到种子液；
(2)按1.0％比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28-30℃，培养时间24h，通风比1：0.9。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达106-109cfu/ml。
(3)将甲基营养型芽孢杆菌菌株发酵液与微粉碳酸钙基质进行混合均匀，干燥，经干燥后发酵液菌数>108cfu/ml。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:1。
本发明所应用的甲基营养型芽孢杆菌的菌液浓度为1×(106-109)cfu/mL。以下实施例优选采用甲基营养型芽孢杆菌的菌液浓度为1×107cfu/mL。
实施例1：番茄促生试验方法
如图4、图5所示为本发明的一个实施例。图中左侧为CK组，右侧为菌株NKG-1菌液灌根组。还可以采用将菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得液剂，利用液剂对番茄进行灌根的方法。
试验采用穴盘种植，于营养土中进行，营养土与蛭石按9:1的比例配置基质，将其置于穴盘中。每穴撒2-3粒番茄种子，用少量的营养土覆盖种子，浇灌适量的水，并用保鲜膜覆盖，待苗出土长出2片子叶时去掉保鲜膜。试验分为两组，试验组使用甲基营养型芽孢杆菌菌液(浓度为1×107cfu/mL)灌根，对照组浇灌清水，每个处理20株苗，3次重复。于温室中25℃，相对湿度为60％的环境下培养，生长大约7天，番茄苗长出2片真叶时，开始灌浇菌液，之后每隔10天灌根一次，其他时间浇灌清水。在灌根3次后，也就是番茄苗生长到约40天时，小心将番茄苗挖出，洗去根部泥土，测其生长指标：株高、根长、鲜重。
表1.菌株NKG-1菌液灌根对番茄生长的促进作用
结论：由上表可以看出利用菌株NKG-1菌液(1×105cfu/mL～1×109cfu/mL)灌根对番茄苗具有明显的促进生长的作用；菌液灌根后的番茄苗与对照组相比生长迅速，叶片浓密，茎部粗壮，尤其是根系发达，根长增加显著。从1×105cfu/mL开始，随着浓度的增加，促生效果有所增加，达到1×107cfu/mL时，其株高比对照组增加了11.88％，鲜重增加了34.93％，根长增加了54.77％，而后浓度继续升高对于番茄的促生效果不是特别显著。
实施例2：小白菜促生试验方法
如图6、图7所示为本发明的一个实施例。图中左侧为CK组，右侧为菌株NKG-1菌液浸种组。还可以采用将菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得液剂，利用液剂对小白菜进行浸种的方法。
首先分别用甲基营养型芽孢杆菌菌液(浓度为1×107cfu/mL)和清水浸泡小白菜种子24h，然后分别播种于穴盘中，每穴2-3粒种子，每个处理20株苗，重复3次。穴盘中含有营养土与蛭石按9:1的比例配置的基质，播种后用少量营养土覆盖，浇灌适量的水，并用保鲜膜覆盖，在温室25℃，相对湿度为60％的环境下培养，待苗出土长出2片真叶后去掉保鲜膜。之后正常浇灌清水，待小白菜苗生长至50天时，小心将小白菜苗挖出，洗去根部泥土，测量其根长、鲜重后，90℃烘干至恒重，测其干重。
表2.菌株NKG-1菌液浸种对小白菜生长的促进作用
由上表可知，菌液浸种试验表明菌株NKG-1菌株菌液可以明显促进小白菜的生长，表现为叶片生长旺盛，叶片明显增厚，鲜重和干重均有所增加，根长显著增长。菌液(1×105cfu/mL～1×109cfu/mL)浸种后的小白菜苗比对照组明显有促生作用。从1×105cfu/mL开始，随着浓度的增加，促生效果有所增加，达到1×107cfu/mL时，其根长比对照组增加了43.09％，鲜重增加了36.71％，干重增加了30.16％；而后浓度继续升高对于小白菜的促生效果不是特别显著。
小白菜，拉丁学名：Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino(var.communis Tsen et Lee)。
实施例3：辣椒促生试验方法
如图8、图9所示为本发明的一个实施例。图中左侧为CK组，右侧为菌株NKG-1菌液灌根组。还可以采用将菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得液剂，利用液剂对辣椒进行灌根的方法。
试验采用穴盘种植，于营养土中进行，营养土与蛭石按9:1的比例配置基质，将其置于穴盘中。每穴撒2-3粒辣椒种子，用少量的营养土覆盖种子，浇灌适量的水，并用保鲜膜覆盖，待苗出土长出2片子叶时去掉保鲜膜。试验分为两组，试验组使用甲基营养型芽孢杆菌菌液(浓度为1×107cfu/mL)灌根，对照组浇灌清水，每个处理20株苗，3次重复。于温室中25℃，相对湿度为60％的环境下培养，辣椒苗长出2片真叶时，开始灌浇菌液，之后每隔10天灌根一次，其他时间浇灌清水。在灌根3次后，也就是辣椒苗生长到约40-50天时，小心将辣椒苗挖出，洗去根部泥土，测其生长指标：株高、根长、鲜重、干重。
表3.菌株NKG-1菌液对辣椒生长的促进作用
上面所述只是为了说明本发明，应该理解为本发明并不局限于以上实施例，符合本发明思想的各种变通形式均在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌NKG-1及植物促生方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1）
<221> 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1）的16S rRNA基因序列
<400> 1
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ggttgtctga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180
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gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780
tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840
gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900
tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 960
ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc1080
agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca1200
aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc1260
agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc1380
cgaagtcggt gaggtaa 1397

Claims (8)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）NKG-1，其保藏编号为CGMCC NO：12055。
2.利用权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌NKG-1促进植物生长的方法，其特征在于：
1）使用所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液对植物生长期进行灌根，或者在植物播种之前浸种；
或2）将所述菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得液剂，利用所述液剂对植物生长期进行灌根，或者在植物播种之前浸种。
3.如权利要求2所述的植物促生方法，其特征在于，所述植物为番茄、小白菜或辣椒。
4.如权利要求3所述的植物促生方法，其特征在于，所述植物为番茄，在番茄幼苗长出2片真叶时利用所述菌液灌根，每隔10天灌根一次，其他时间浇灌清水，共灌根三次。
5.如权利要求3所述的植物促生方法，其特征在于，所述植物为小白菜，在小白菜播种之前利用所述菌液浸泡小白菜种子24h，然后实施播种。
6.如权利要求3所述的植物促生方法，其特征在于，所述植物为辣椒，在辣椒幼苗长出2片真叶时利用所述菌液灌根，每隔10天灌根一次，其他时间浇灌清水，共灌根三次。
7.如权利要求3所述的植物促生方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×106 cfu/mL ~1×109 cfu/mL。
8.如权利要求7所述的植物促生方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×107 cfu/mL。
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