CN106011004B - 一种固氮微生物g96及其菌剂制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固氮微生物菌剂技术领域，具体涉及一种固氮微生物G96及其菌剂制备方法和应用，所述固氮微生物G96保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015752。所述的一种固氮微生物G96的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选；（2）纯化、保存；（3）固体发酵培养；（4）菌剂制备，即得到巨大芽孢杆菌G96菌剂。该固氮微生物G96不仅具有较高的固氮酶活性，还具有很高的分泌IAA能力，固氮酶活性为1000‑1100nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300‑400 mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及固氮微生物菌剂技术领域，具体涉及一种固氮微生物G96及其菌剂制备方法和应用。
背景技术
微生物肥料是一种利用微生物的溶磷，解钾和固氮特性研制而成的新型肥料，它不仅能使农作物增产，改善农产品的品质，而且能改善土壤，增加土壤肥力。固氮微生物肥料是一种节能环保、符合可持续发展生态农业要求的新型肥料，它是通过固氮微生物固定空气中的N2，并把它转化成供农作物直接利用的NH4 +，从而达到减少化肥用量的目的。由于芽孢杆菌具有耐储存，抗逆性强和耐盐碱等诸多优点，但同时目前研究发现的固氮菌能产芽孢的相对较少，因此筛选出具有固氮功能的芽孢杆菌菌种对于微生物肥料的生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种固氮微生物G96，其具有固氮酶活性和分泌生长素吲哚乙酸的功能。
本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种固氮微生物G96菌剂的制备方法，工艺简单，可规模化生产，制得的固氮微生物G96菌剂具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，农业应用范围广，经济效益高。
本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种固氮微生物G96菌剂的应用，可促进玉米、西红柿的生长。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种固氮微生物G96，所述固氮微生物G96保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Collection)，地址为中国武汉大学，分类命名为巨大芽孢杆菌 G96Bacillus megaterium G96，保藏号为CCTCCM 2015752，保藏日期为2015年12月15日。
所述固氮微生物G96具有序列表NO.1的DNA序列。
所述固氮微生物G96的固氮酶活性为1000-1100nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。
固氮酶活性测定
1、试验方法
采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定。将保存的各菌株用VM-Ethanol固体培养基活化，用接种环挑取1环菌体于1.5mL的无菌离心管中，用无菌水稀释，按相同接种量接入装有5mL半固体培养基的10mL试管中，用反口橡胶塞密封。37℃培养24h后，注入1/10体积的10％乙炔气体，继续培养24h，从试管中抽取0.5mL气体注入气相色谱仪(北京天普分析仪器厂SP-2100)中，测定乙炔、乙烯的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小(北京农业大学微生物专业编，1986)：
C＝(hx×c×V)/(24.9×hs×t) (2.1)
其中，hx为样品峰面积值；hs为标准C2H4峰面积值；c为标准C2H4浓度(nmol/mL)；
V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C2H4浓度[nmol/(mL·h)]。
2、试验结果
结合公式(2.1)和固氮酶活性测定图4得知，固氮酶活性为1000-1100nmol/(mL·h)。由此可以说明，固氮微生物G96在代谢过程中可以产生特定的固氮酶，可以自生固定大气中的氮气。
生长素定性含量测定
(1)挑取菌株分别接种(OD600＝1.0，0.5mL菌悬液)到盛有50mL King液体培养基的250mL三角瓶中，每组3个重复。
(2)接种完毕后，将三角瓶置于摇床上，28℃，125rpm，培养3d，待测。
(3)将上述在King液体培养基上生长3d的菌悬液50μL置于透明离心管中，同时加50μL比色液。
(4)设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入50μL浓度为10mg/L的植物生长激素(IAA)，同时加50μL比色液。阴性对照中加50μLKing液体培养基，同时加50μL比色液。
(5)将阳性对照液、阴形对照液和测定液置于白陶瓷板并置于室温下15min，观察其颜色变化，颜色变红者为阳性，表示能够分泌IAA，且颜色越深表示分泌IAA的能力越强；若不变色则为阴性，表示该固氮微生物G96不能分泌IAA，由此作为判断依据进行判断分析。
培养基为：King培养基(1L)；试剂配方为蛋白胨20g，K2HPO4 1.725g，MgSO4·7H2O1.5g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL。
生长素定量测定
参照Riberio等的方法略加改动。菌株G96接种到含有1g/L色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180r/min，振荡培养48h。将培养液10000r/min离心5min，取100mL 上清液加到96孔板中，与100mL Salkowski’s试剂(1mL 0.5mol/L FeCl3和49mL 35％高氯酸)混匀，室温静置30min，在波长530nm下用酶标仪测定吸光度。用不同浓度的IAA标准品制作标准曲线，测定结果见表1。
表1菌株G96 IAA测定结果
| 菌株 | G78 | G96 | G95 | G93 |
| IAA浓度(mg/L) | 384.12 | 356.18 | 342.13 | 321.56 |
从表1和图5可以看出，巨大芽孢杆菌G96的生长素浓度为356.18mg/L，因此，可以判断巨大芽孢杆菌G96在生长代谢过程中可以产生IAA，具有促进作物生长的功能。
一种固氮微生物G96的菌剂制备方法，包括以下步骤：
(1)分离、筛选
选取含有固氮微生物G96的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；
(2)纯化、保存
在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到固氮微生物G96单菌落，保存该单菌落备用；如图1所示，固氮微生物G96单菌落的放大菌落图。
具体地，在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到固氮微生物G96单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。
(3)固体发酵培养
选取上述固氮微生物G96单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4，接种量0.5-1.0％，培养温度为30-37℃，培养时间为48-60小时。
影响微生物生长繁殖的环境因素有很多，对发酵影响较大的有pH、接种量、培养温度、和培养时间。
pH是微生物生长和产物合成的非常重要的影响参数，是衡量代谢活动的综合指标。pH的变化会影响到各种酶活、菌对基质的利用速率和细胞的构造，从而影响菌的生长和产物的合成。在固氮微生物G96发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.1-7.4
适当的接种量可调节培养液黏度和溶解氧含量，缩短生长达到高峰的时间、使产物提前合成。固氮微生物G96的接种量设定为0.5-1.0％。
微生物的生长和产物的合成均需要在其各自最合适的温度下进行。温度是保证酶活的重要条件，故在发酵过程中必须保证最适的温度环境。固氮微生物G96的固体发酵温度最佳为30-37℃。
根据固氮微生物G96在摇瓶中的生长情况，设定培养时间48-60小时为发酵终点，发酵效果好。
(4)菌剂制备
将固体发酵培养后的产物于50℃烘干后用小型粉碎机打碎，设定最终产品活菌数为5亿/g，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-10亿/g，产品活菌数完全符合国家标准《微生物菌剂》GB20287-2006要求2亿/g以上，即得到巨大芽孢杆菌G96菌剂。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮70-73份，豆粕20-25份，NaCl 3-5份，CaCO3 1-1.5份，MnSO4·H2O 0.02-0.05份，MgSO4·7H2O 0.01-0.05份，所述培养基的pH为7.1-7.4。
优选地，所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮71份，豆粕23份，NaCl 4.0份，CaCO3 1.2份，MnSO4·H2O 0.04份，MgSO4·7H2O 0.04份，该固体发酵培养基的pH为7.1-7.4。该培养基配方可提高产孢量，促进作物的生长，减少生产成本。
所述步骤(1)分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取上述样品液与磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。
更具体地，分离、筛选的方法为：
从广东省东莞市常平镇黄泥塘农场采取500g土样，加入3L含0.01％吐温80的无菌水，震荡10min，静置半个小时，取上清液于20℃下8000rpm离心20min。弃上清液，保留沉淀物，加入30-50mL含0.01％吐温80的无菌水悬浮，液体于20℃下5000rpm离心5秒钟，去沉淀，将上清液倒入一个干无菌离心管中于20℃下4820rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用10mL的pH 7.0磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取1mL上述样品液与9mL磷酸缓冲液悬浮混合，即为10倍稀释菌悬液。将稀释的菌悬液置于75℃水浴加热15min，自然冷却后吸取100μL涂布于无氮培养基，30℃培养36-48小时获得含固氮微生物G96的固氮菌菌落。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.0-1.4g，MgSO4·7H2O 0.6-1.2g，K2HPO4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeSO4·7H2O 0.001-0.005g，NaMO4·2H2O 0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，所述分离筛选培养基的pH为7.1-7.4。本发明的分离筛选培养基属于改良无氮培养基，培养效果好。
所述纯化保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到枯草芽孢杆菌G96单菌落。将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。固氮微生物G96保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号码为：CCTCCM 2015752。
(2)纯化保存培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，所述纯化保存培养基的pH7.0-7.4。
所述步骤(2)和步骤(3)之间还包括有以下步骤：
(S1)革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；
(S2)芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。
芽孢染色及其革兰氏染色
革兰氏染色和芽孢染色是两种细菌鉴定的常规方法，染色可以缩小鉴定范围。未经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，在显微镜下极难观察。革兰氏染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些菌种属于革兰氏阳性(G+)或者革兰氏阴性菌(G-)，用以分类鉴定。革兰氏阴性菌普遍存在安全隐患，在农业微生物应用过程中直接高温灭菌后舍弃结构特征。芽孢染色将菌体内的芽孢进行染色，可以直观观察芽孢的大小、位置、形状等特点，进一步缩小其鉴定范围。芽孢杆菌具有保质期长，易于存放的特点，在农业微生物产品具有广泛的应用基础。
1、革兰氏染色
(1)涂片：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。
(2)初染：滴加2-5滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
(3)媒染：先用新配的碘液(碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL)冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min，后水洗。
(4)脱色：除去残水后，滴加95％酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗。
(5)复染：滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干。
(6)镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。
2、芽孢染色
在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1～2滴石碳酸碱性复红染液，染色3min。用蒸馏水冲洗掉染液，风干后，将载玻片置于光学显微镜下观察。
如图2和图3所示，通过革兰氏染色和芽孢染色结果可以看出，固氮微生物G96为革兰氏阳性菌，杆状，含有芽孢。
一种固氮微生物G96的应用，将所述的一种固氮微生物G96的菌剂制备方法制备的固氮微生物G96菌剂用于玉米、甘蔗、水稻等农作物、西红柿、菜心、辣椒等蔬菜作物的促生长。
本发明的有益效果：
(1)本发明从大量的土壤样品中分离筛选到一株具有固氮功能的菌株G96，该固氮微生物G96不仅具有较高的固氮酶活性，还具有很高的分泌IAA能力。所述固氮微生物G96的固氮酶活性为1000-1100nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。
(2)盆栽试验结果表明，G96菌剂能够有效地促进玉米和番茄的生长，减少氮素投入。西红柿大田示范试验中，在施肥成本基本一致的基础上，试验组节氮率达19.8％，而增产率达32.43％，显著地提高了西红柿的产量，说明施用G96菌剂在减少氮素投入的同时能够带来更大的经济效益。本发明的固氮微生物G96在农业生产中具有很好的应用前景。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为分离得到的固氮微生物G96单菌落在显微镜下放大10×100倍的菌落图。
图2为固氮微生物G96革兰氏染色结果图。
图3为固氮微生物G96芽孢染色结果图。
图4为固氮微生物G96固氮酶活性测定结果图。
图5为固氮微生物G96IAA比色效果图。
图6为固氮微生物G96微生物菌剂玉米盆栽效果图。
图7为固氮微生物G96微生物菌剂西红柿盆栽效果图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例的一种固氮微生物G96，所述固氮微生物G96保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015752。所述固氮微生物G96具有序列表NO.1的DNA序列。
所述固氮微生物G96的固氮酶活性为1050.56nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为356.18mg/L。
一种固氮微生物G96的菌剂制备方法，包括以下步骤：
(1)分离、筛选
选取含有固氮微生物G96的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；
(2)纯化、保存
在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到固氮微生物G96单菌落，保存该单菌落备用；
(3)固体发酵培养
选取上述固氮微生物G96单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1，接种量0.5％，培养温度为30℃，培养时间为60小时；
(4)菌剂制备
将固体发酵培养后的产物烘干后打碎，活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是8亿/g，即得到巨大芽孢杆菌G96菌剂。
所述步骤(2)纯化、保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36小时分离得到固氮微生物G96单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36小时，置于4℃冰箱中保存。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮71份，豆粕23份，NaCl 4.0份，CaCO3 1.2份，MnSO4·H2O 0.04份，MgSO4·7H2O 0.04份，所述培养基的pH为7.1。
所述步骤(1)分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液； 取上述样品液与磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.2g，MgSO4·7H2O 0.8g，K2HPO4 1.6g，NaCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.002g，NaMO4·2H2O 0.08g，蔗糖8g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，所述分离筛选培养基的pH为7.1。
一种固氮微生物G96的应用，将所述的一种固氮微生物G96的菌剂制备方法制备的固氮微生物G96菌剂用于玉米的促生长。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例的所述步骤(2)和步骤(3)之间还包括有以下步骤：
(S1)革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；
(S2)芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。
具体地，革兰氏染色方法为：
(1)涂片：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。
(2)初染：滴加2-5滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
(3)媒染：先用新配的碘液(碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL)冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min，后水洗。
(4)脱色：除去残水后，滴加95％酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗。
(5)复染：滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干。
(6)镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。
具体地，芽孢染色方法为：
在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1～2滴石碳酸碱性复红染液，染色3min。
本实施例的其余内容与实施例1相同，这里不再赘述。
实施例3
本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述固氮微生物G96的固氮酶 活性为1000nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300mg/L。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4 1.0g，NaCl 0.1g，FeSO4·7H2O 0.001g，NaMO4·2H2O 0.05g，蔗糖5g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，所述分离筛选培养基的pH为7.2。
所述步骤(2)纯化、保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养38小时分离得到固氮微生物G96单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养38小时，置于4℃冰箱中保存。
所述步骤(3)固体发酵培养：选取上述固氮微生物G96单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.2，接种量0.6％，培养温度为32℃，培养时间为50小时。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮70份，豆粕20份，NaCl 3份，CaCO3 1份，MnSO4·H2O 0.02份，MgSO4·7H2O 0.01份，所述培养基的pH为7.2。
所述步骤(4)菌剂制备：将固体发酵培养后的产物烘干后打碎，活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是5亿/g，即得到巨大芽孢杆菌G96菌剂。
一种固氮微生物G96的应用，将所述的一种固氮微生物G96的菌剂制备方法制备的固氮微生物G96菌剂用于甘蔗的促生长。
本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。
实施例4
本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述固氮微生物G96的固氮酶活性为1020nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为365mg/L。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.3g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO4 1.8g，NaCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.003g，NaMO4·2H2O 0.06g，蔗糖7g，琼脂19g，蒸馏水1000ml，所述分离筛选培养基的pH为7.3。
所述步骤(2)纯化、保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养42小时分离得到固氮微生物G96单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养42小时，置于4℃冰箱中保存。
所述步骤(3)固体发酵培养：选取上述固氮微生物G96单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.3，接种量0.7％，培养温度为35℃，培养时间为52小时。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮72份，豆粕23份，NaCl 4份，CaCO3 1.4份，MnSO4·H2O 0.04份，MgSO4·7H2O 0.04份，所述培养基 的pH为7.3。
所述步骤(4)菌剂制备：将固体发酵培养后的产物烘干后打碎，活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是6亿/g，即得到巨大芽孢杆菌G96菌剂。
一种固氮微生物G96的应用，将所述的一种固氮微生物G96的菌剂制备方法制备的固氮微生物G96菌剂用于水稻的促生长。
本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。
实施例5
本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述固氮微生物G96的固氮酶活性为1100nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为400mg/L。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.4g，MgSO4·7H2O 1.2g，K2HPO4 2.0g，NaCl 0.4g，FeSO4·7H2O 0.005g，NaMO4·2H2O 0.1g，蔗糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，所述分离筛选培养基的pH为7.4。
所述步骤(2)纯化、保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养48小时分离得到固氮微生物G96单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养48小时，置于4℃冰箱中保存。
所述步骤(3)固体发酵培养：选取上述固氮微生物G96单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.4，接种量1.0％，培养温度为37℃，培养时间为48小时。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮73份，豆粕20份，NaCl 5份，CaCO3 1.5份，MnSO4·H2O 0.05份，MgSO4·7H2O 0.05份，所述培养基的pH为7.4。
所述步骤(4)菌剂制备：将固体发酵培养后的产物烘干后打碎，活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是10亿/g，即得到巨大芽孢杆菌G96菌剂。
一种固氮微生物G96的应用，将所述的一种固氮微生物G96的菌剂制备方法制备的固氮微生物G96菌剂用于菜心或辣椒的促生长。
本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。
本发明的固氮微生物菌剂中的巨大芽孢杆菌的16S rDNA序列菌种鉴定
细菌的个体微小，形态简单，传统方法鉴定细菌常根据它们在生理生化上的不同反应作为分类鉴定的主要依据。20世纪70年代后期以来，国际上通用的“正式的”或“官方的”细菌分类方法是以《伯杰氏鉴定细菌学手册》为依据。在生理生化鉴定中，通常会出现一个或者几个生理指标不符合该菌种所具有的独特性质，难以明确对该固氮微生物G96 进行鉴定。目前，细菌鉴定的方法通常将菌株的生理生化指标与分子生物学特性相结合，得出较为可靠地结论。其中DNA序列分析的16S rRNA基因进化发育系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴定常用的技术手段(Kim et al，2004；Prap et al，1997)。
核糖体16S rDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成。利用保守区域设计的通用引物，可以扩增出所有细菌的16S rDNA片段。16S rDNA序列分析技术的基本原理是从微生物样本中提取16S rDNA片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rDNA的序列信息，再与16S rDNA数据库的序列数据或者其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。利用16S rDNA片段保守区域设计的通用引物，不会对非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此通过对某菌株16S rDNA序列测定来获得最终鉴定证明的做法是被普遍认可的。
1、方法：
(1)PCR反应体系(25μL)：
(2)PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环，72℃延伸10min。使用ABI 3730xl DNA分析仪(应用生物系统公司)进行DNA测序。
2、测序结果
3、同源性分析
鉴定本细菌为Bacillus megaterium，巨大芽孢杆菌。
应用例：盆栽试验
对玉米和西红柿的促生效果
(1)玉米和西红柿育苗将玉米种子温水中浸泡过夜，播种于装有土壤的塑料杯，自然条件育苗12-14天，选择长势均匀的玉米和西红柿移栽到花盆中。
(2)土壤预处理土壤风干后，过1mm筛。每个处理设置3个重复。每个花盆分别装有土壤4.0kg，尿素407mg、过磷酸钙162mg和硫酸钾418mg。
(3)试验设置选用具有自生固氮及促进作物生长功能的G96微生物菌剂进行盆栽效果对比试验，每盆添加菌剂1g。设置膨润土添加为对照实验，每盆添加膨润土1g。每天浇水适量，每盆的水量要相同、播洒均匀，不要使水流出盆底以免肥料损失而产生误差。
(4)试验结果
在移苗第64天后，测定玉米和西红柿株高、叶片数及其单株鲜重，可以得出接种G96巨大芽孢杆菌菌剂可以明显促进玉米和西红柿生长，见表2-3，图6-7。
表2 G96微生物菌剂玉米盆栽效果对比试验
| 菌株 | 株高(cm) | 叶片数(个) | 单株鲜重(g) |
| G96 | 106.5 | 11.7 | 44.6 |
| Ck | 77.6 | 8.8 | 29.2 |
表3 G96微生物菌剂西红柿盆栽效果对比试验
本发明由广东省引进创新创业团队项目资助研发，制得的固氮微生物菌剂G96及其菌剂具有广阔的市场前景，经济效益高。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
<0001>
SEQUENCE LISTING
<110>东莞市保得生物工程有限公司
<120>一种固氮微生物G96及其菌剂制备方法和应用
<130>0
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1406
<212>DNA
<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)G96的16s rDNA基因序列
<400>1
gagcgaactg attagaagct tgcttctatg acgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60
gggcaacctg cctgtaagac tgggataact tcgggaaacc gaagctaata ccggatagga 120
tcttctcctt catgggagat gattgaaaga tggtttcggc tatcacttac agatgggccc 180
gcggtgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcaacgatgc atagccgacc 240
tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300
agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 360
ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag ggaagaacaa gtacaagagt aactgctcgt 420
accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480
cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta 540
agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg gggaacttga 600
gtgcagaaga gaaaagcgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660
acaccagtgg cgaaggcggc tttttggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg 720
gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta 780
gagggtttcc gccctttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg 840
gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900
tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga caactctaga 960
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ggctgcaaga ccgcgaggtc aagccaatcc cataaaacca ttctcagttc ggattgtagg 1260
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aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380
agtcggtgga gtaaccgtaa ggagct 1406
Claims (4)
1.一种固氮微生物G96，其特征在于：所述固氮微生物G96保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015752。
2.根据权利要求1所述的一种固氮微生物G96，其特征在于：所述固氮微生物G96具有序列表NO.1的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的一种固氮微生物G96，其特征在于：所述固氮微生物G96的固氮酶活性为1000-1100nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。
4.一种固氮微生物G96的应用，其特征在于：将权利要求1-3任意一项所述的一种固氮微生物G96的菌剂用于农作物、蔬菜作物的促生长。
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