CN114854640B - 一株菠萝泛菌及在番茄促生、抗逆性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及根际促生菌(PGPR)领域，具体涉及一株菠萝泛菌(Pantoeaananatis strain LAD128)及其在番茄促生、抗逆性中的应用。Pantoea ananatisstrain LAD128分离至番茄根际土壤中，其生长温度范围较大，容易适应各种土壤环境，具有固氮解磷等特性，并且LAD128能吸附于生物炭中，同时能促进番茄幼苗生长，并能提高番茄幼苗抗盐胁迫的能力。因此，可用于作物生产中，不仅能促进作物生长，并且对作物抗逆性有很大帮助。

Description

一株菠萝泛菌及在番茄促生、抗逆性中的应用
技术领域
本发明涉及根际促生菌(PGPR)领域，具体涉及一株菠萝泛菌(Pantoea ananatisstrain LAD128)及其在番茄促生、抗逆性中的应用。
背景技术
Pantoea ananatis菌株来源广泛，存在于多种多样的环境中，包括土壤、水、动物和植物等。而作为植物相关的细菌，在大多数水稻中均存在Pantoea ananatis，并且在水稻种子和水稻不同组织中，Pantoea一株菠萝泛菌(Pantoea ananatis strain LAD128)及其在番茄促生、抗逆性中的应用ananatis均作为优势种。从1928年分离出的第一株Pantoeaananatis作为植物病原菌之后，发现绝大部分该菌株均有致病性，但到19世纪中期，一株非致病的Pantoea ananatis AJ13355被发现，具有产色素能力。之后陆续发现具有更多功能，包括促生作用，并且在逆境胁迫下，Pantoea ananatis具有良好的促进效果。因此Pantoeaananatis在农业应用方面具有巨大潜力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有研究的不足，提供一株菠萝泛菌(Pantoea ananatisstrain LAD128)及其在番茄促生、抗逆性中的应用。
为实现本发明所述目的，所提供以下技术方案予以实现:
一株菠萝泛菌，该菌株为Pantoea ananatis strain LAD128，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24784，保藏日期为2022年4月27日。
一种菠萝泛菌的应用，所述菌株再促进番茄幼苗生长中的应用。
所述菌株在提高番茄幼苗抗盐胁迫中的应用。
进一步的说，所述菠萝泛菌(Pantoea ananatis strain)LAD128，具有固氮和解磷的能力，能良好的吸附于生物炭中，作为促进生长剂，LAD128直接添加及其挥发物VOC均能促进番茄幼苗生长，并且提高番茄幼苗的抗盐性。
在1h内生物炭的吸附量分别达到47.47％和40.71，在1-12h内，吸附速率显著降低，在12h时吸附量基本趋于稳定，分别达到71.82％和65.15％，玉米杆炭效率略高于麻秆炭。
其地上干重增加了14.97％，地下干重增加了100％，并且根冠比明显提高，说明LAD128对根的促进效果更强，对其地下部分进行具体分析发现，外源添加LAD128后，其根表面积增加了115.88％，根体积增加了63.04％，根长增加了43.96％。
番茄幼苗在受到盐胁迫条件下，生长明显受限，但在添加LAD128后，这种受限会得到缓解，并且在盐浓度不高于80mmol L-1时，LAD128仍然具有促进番茄幼苗生长的能力；当盐浓度高于80mmol L-1时，添加LAD128能明显缓解其盐胁迫。
一种番茄幼苗促生长剂，番茄幼苗促生长剂含所述Pantoea ananatis strainLAD128。
所述番茄幼苗促生长剂中含所述菌株的培养物、培养浓缩物、培养菌悬液或其挥发物VOC中。
所述培养物为将所述菌株培养至牛肉膏蛋白胨液体培养基中振荡培养得培养物；将所得培养物经浓缩即得浓缩物；将所得浓缩物经无菌水重悬，即得培养菌悬液；将所述菌株培养至牛肉膏蛋白胨固体培养基中，37℃静置培养，收集其挥发物，即得其挥发物VOC。
本发明的有益效果：
本发明中Pantoea ananatis strain LAD128分离至番茄根际土壤中，其生长温度范围较大，容易适应各种土壤环境，具有固氮解磷等特性，并且LAD128能吸附于生物炭中，同时能促进番茄幼苗生长，并能提高番茄幼苗抗盐胁迫的能力。因此，可用于作物生产中，不仅能促进作物生长，并且对作物抗逆性有很大帮助。
附图说明
图1为本发明是实例提供的LAD菌16S rDNA PCR扩增产物电泳检测结果；其中M为5000bp DNA marker，1，2，3，4为LAD128菌株的16S rDNA PCR扩增产物。
图2为本发明是实例提供的基于16S rDNA序列同源性的LAD128系统发育树。
图3为本发明是实例提供的Pantoea ananatis LAD128的不同温度生长曲线。
图4为本发明是实例提供的两种生物炭对LAD128的吸附图。
图5为本发明是实例提供的外源添加LAD128番茄幼苗生长情况图。
图6为本发明是实例提供的外源添加LAD128间接调控番茄幼苗生长情况图。
图7为本发明是实例提供的外源添加LAD128番茄幼苗在盐胁迫下生长情况图。
图8为本发明是实例提供的外源添加LAD128间接调控番茄幼苗在盐胁迫下生长情况图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
本试验从番茄根系中，筛选出一株Pantoea ananatis，探究其促生功能，并探究了其对番茄幼苗生长的影响。因此，筛选具有促生功能Pantoea ananatis为相关研究提供菌种资源。
实施例1Pantoea ananatis strain LAD128的分离及鉴定
1.Pantoea ananatis strain LAD128的分离
在微生物菌肥处理的试验站，取番茄根际新鲜土壤样品10g，放入装有90mL无菌水且含少量玻璃珠的三角瓶中，将其置于28℃恒温摇床中，180rpm振荡培养30min，使土壤样品均匀分散在稀释液(无菌水)中制成10-1稀释液。吸取1mL 10-1稀释液于装有9mL无菌水的玻璃试管中，振荡混匀制成10-2稀释液。依次类推，连续稀释，直至稀释到10-6。本研究选取10-3、10-4、10-5三个稀释梯度的土壤稀释液，分别吸取0.1mL稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板中，30℃培养24h，待平板上微生物菌落长出后，通过观察菌落的形态特征，挑取少许长势良好且表面湿润、光滑凸起、有粘液的不同细菌的单菌落，划线转接牛肉膏蛋白胨固体培养基中，30℃培养24h。依此方法连续划线纯化培养3次以上，镜检其纯度，直至获得纯培养，划线于试管斜面，并置于4℃冰箱中保藏备用。
2.Pantoea ananatis strain LAD128的鉴定
挑取上述获得的单菌落接入液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，取培养好的发酵液利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取，DNA提取后，对其16S rDNA进行PCR扩增。以16S rDNA扩增引物27F(SEQ ID NO：1)和1492R(SEQ ID NO：2)为上下游引物，LAD菌总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：LAD菌总DNA 1.5μL；2×TaqMasterMix 12.5μL；上下游引物(10μmol/L)各0.5μL；无菌水10μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，称取0.4g琼脂糖粉末，加入40mL 1×TAE缓冲液中，加热至琼脂糖完全溶解后加入2μL DNA染色液Goldview，混合均匀，趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，将制备好的琼脂糖凝胶放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中，缓冲液应没过胶面，吸取2μL与上样Buffer混匀的PCR产物加入琼脂糖凝胶的点样孔，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准(DNA marker)，接通电源在5V/cm条件下电泳30min，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于紫外透射仪上成像，根据DNA分子量标准(DNA marker)判断扩增条带的浓度及大小。如图1所示，在1100-1500bp处出现与预期一致的特异性条带，说明16S rDNA扩增成功。将经电泳检测的16S rDNA PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并将测序结果在GenBank中进行比对，其序列如下。结果显示，通过在NCBI比对发现，推断LAD128菌株为菠萝泛菌，命名为Pantoeaananatis strain LAD128，其系统发育分析如图2所示。
SEQ ID NO:1
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
SEQ ID NO:2
TACGGCTACCTTGTTACGACTT
SEQ ID NO:3
LAD128 16S rDNA序列
AGGCCTTGGCGGCAGCTACACATGCAGTCGGACGGTAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATGTGGTTAATAACCGCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACAGAACTTAGCAGAGATGCTTTAGTGCCTTCGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACCTCAAAGGAG
上述分离纯化后菌株为一株菠萝泛菌(Pantoea ananatis strain)LAD128，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO 24784，保藏日期为2022年4月27日。
实施例2Pantoea ananatis strain LAD128生物学性质测定1.生长曲线测定
挑取保存的LAD128菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，使LAD128菌株处于活跃状态。将活化后的菌液按2wt％接种量接入50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180rpm，分别置于20、25、30、35和40℃条件下培养。每隔2h测定菌液OD600值，直至OD值趋于稳定，做三组平行，以空白培养基为对照，绘制生长曲线。如图3所示，LAD128菌株在20℃和40℃时生长量较低，在20-35℃之间，达到平稳期后，菌体生长量没有显著差异，但在35℃培养条件下，最早达到平稳期并且相对同时期其他温度培养条件下生长量更高。
2.固氮能力测定
挑取保存的LAD128菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，使LAD128菌株处于活跃状态。将活化后的菌株涂布于阿须贝固体培养基，在37℃恒温培养箱中培养4d，观察其生长情况。同时将活化后的菌液按2wt％接种量接入50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，利用细菌固氮酶试剂盒(ELISE)测定其固氮酶活。测得其固氮酶活为14.66U L-1
3.溶解有机磷能力测定
挑取保存的LAD128菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，使LAD128菌株处于活跃状态。将活化后的菌液点接2.5μL于孟金娜固体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养7d观察并记录菌株是否产生解磷圈，如果有，记录解磷圈直径(D)和菌落的直径(d)，其D/d值为1.53。同时将活化后的菌液按2wt％接种量接入50mL孟金娜液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养5d，采用钼锑抗比色法测定其解磷量，其解磷量为0.009±0.002。
4.菌体在生物炭中吸附能力
挑取保存的LAD128菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，使LAD128菌株处于活跃状态。将活化后的菌液按2wt％接种量接入100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养8h，12000rpm,4℃离心10min得到菌体，用生理盐水洗涤细胞两次得到菌悬液，吸取10mL菌悬液加入到10mL含有0.06g不同的生物炭(玉米杆炭或麻杆炭)的生理盐水中，振荡培养1h、6h、12h、24h，放置一定时间待生物炭沉淀后，分别吸取不同生物炭不同放置时间下上清液经生理盐水稀释至106后，取20ul稀释液涂布至固体牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养24h，计菌落数，每组实验设置三个平行，以未加入生物炭的生理盐水的涂板结果作为对照，结果如图4所示。由图可知，在1h内生物炭的吸附量分别达到47.47％和40.71，在1-12h内，吸附速率显著降低，在12h时吸附量基本趋于稳定，分别达到71.82％和65.15％，玉米杆炭效率略高于麻秆炭。
实施例3Pantoea ananatis strain LAD128促进番茄生长
1.番茄种子与LAD菌株预处理
v番茄种子的预处理：番茄种子置于55℃水浴锅中，热击5min后，先用70％酒精表面消毒1min，再用4％次氯酸钠溶液表面消毒7min，最后用无菌水冲洗7-8次。将番茄种子点接至MS固体培养基中25℃黑暗培养4d。
LAD128菌株的预处理：挑取保存的LAD128菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，使LAD128菌株处于活跃状态。取1mL菌液于1.5mL离心管中，5000rpm离心3min，去上清，用1mL ddH2O将沉淀充分打散混匀，使菌悬液OD600≈1.5
2.外源添加LAD128对番茄幼苗的促进作用
选取上述预处理后芽长1cm左右的番茄幼苗移栽至空白MS培养基中，每个平板移入5株幼苗，取120μl LAD128菌悬液滴加到幼苗根部，放置在光照培养箱中培养14d(光照强度15000Lux条件下26℃培养16h，黑暗条件下18℃培养8h)后测幼苗的生长指标。以番茄苗根部滴加ddH2O作为对照，每组实验设置三个平行。外源添加LAD128后，番茄幼苗生长明显高于对照组，如图5所示，其地上干重增加了14.97％，地下干重增加了100％，并且根冠比明显提高，说明LAD128对根的促进效果更强，对其地下部分进行具体分析发现，外源添加LAD128后，其根表面积增加了115.88％，根体积增加了63.04％，根长增加了43.96％，生长指标见表1。
表1外源添加LAD128番茄幼苗生长情况
Figure BDA0003661247450000061
3.LAD128的间接调控对番茄幼苗的促进作用
取9ul上述步骤1)所得LAD128细菌悬液分为三滴，滴至二分培养皿的牛肉膏蛋白胨培养基的一侧，28℃培养三天后选取步骤1)预处理后芽长1cm左右的番茄幼苗移栽至二分平板中另一侧含有MS培养基中，每个平板移入2株幼苗，用封口膜封装后放置在光照培养箱中培养14d(光照强度15000Lux条件下26℃培养16h，黑暗条件下18℃培养8h)后测幼苗的生长指标。以牛肉膏蛋白胨培养基一侧滴加ddH2O作为对照，每组实验设置三个平行。外源LAD128间接调控后，番茄幼苗生长明显高于对照组，如图6所示，起地上干重增加了17.93％，地下干重增加了69.87％，并且根冠比明显提高，说明LAD128的间接调控对根的促进效果较强，对其地下部分进行具体分析发现，外源添加LAD128后，其根表面积增加了80.46％，根体积增加了152.04％，根长增加了142.66％，生长指标见表2。
表2外源添加LAD128间接调控番茄幼苗生长情况
Figure BDA0003661247450000062
实施例4Pantoea ananatis strain LAD128提高番茄抗盐能力
1.外源添加LAD128对番茄抗盐能力的提高
选取上述实施例3步骤1预处理后芽长1cm左右的番茄幼苗移栽到含有0mmol L-1、40mmol L-1、80mmol L-1、120mmol L-1、200mmol L-1浓度NaCl的MS固体培养基中，每个平板移入5株幼苗，取120ul上述实施例3步骤2的菌悬液滴加到幼苗根部，用封口膜封装后置于光照培养箱中竖直培养14d(光照强度15000Lux，26℃培养16h，黑暗条件下，18℃培养8h)。以番茄苗根部滴加dd H2O作为对照，每组实验设置三个平行。其生长情况如图7所示。番茄幼苗在受到盐胁迫条件下，生长明显受限，但在添加LAD128后，这种受限会得到缓解，并且在盐浓度不高于80mmol L-1时，LAD128仍然具有促进番茄幼苗生长的能力；当盐浓度高于80mmol L-1时，添加LAD128能明显缓解其盐胁迫，各项指标见表3。
表3外源添加LAD128番茄幼苗在盐胁迫下生长情况
Figure BDA0003661247450000071
2.外源LAD128间接调控对番茄抗盐能力的提高
取9ul上述实施例3步骤2的LAD128细菌悬液分为三滴，滴至二分培养皿的牛肉膏蛋白胨培养基的一侧，28℃培养三天后选取芽长1cm左右的番茄幼苗移栽到二分培养皿中含有0mmol L-1、40mmol L-1、80mmol L-1、120mmol L-1、200mmol L-1浓度NaCl的MS固体培养基的一侧，每个平板移入2株幼苗(发芽的种子，芽长1cm左右)，用封口膜封装后置于光照培养箱中竖直培养14d(光照强度15000Lux，26℃培养16h，黑暗条件下，18℃培养8h)。以牛肉膏蛋白胨培养基一侧滴加ddH2O作为对照，每组实验设置三个平行，结果如图8所示。番茄幼苗在受到盐胁迫条件下，生长明显受限，但在LAD128的间接调控下，这种受限会得到缓解，并且在盐浓度不高于80mmol L-1时，LAD128仍然具有促进番茄幼苗生长的能力；当盐浓度高于80mmol L-1时，添加LAD128能明显缓解其盐胁迫，生长指标见表4。
表4外源添加LAD128间接调控番茄幼苗在盐胁迫下生长情况
Figure BDA0003661247450000081
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一株菠萝泛菌及在番茄促生、抗逆性中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggccttggc ggcagctaca catgcagtcg gacggtagca cagaggagct tgctcctcgg 60
gtgacgagtg gcggacgggt gagtaatgtc tggggatctg cccgatagag ggggataacc 120
actggaaacg gtggctaata ccgcataacg tcgcaagacc aaagaggggg accttcgggc 180
ctctcactat cggatgaacc cagatgggat tagctagtag gcggggtaac ggcccaccta 240
ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc 300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag 360
ccatgccgcg tgtatgaaga aggccttcgg gttgtaaagt actttcagcg gggaggaagg 420
cgatgtggtt aataaccgcg tcgattgacg ttacccgcag aagaagcacc ggctaactcc 480
gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa 540
gcgcacgcag gcggtctgtt aagtcagatg tgaaatcccc gggcttaacc tgggaactgc 600
atttgaaact ggcaggcttg agtctcgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga 660
aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac gaagactgac 720
gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacgatgtcg acttggaggt tgttcccttg aggagtggct tccggagcta acgcgttaag 840
tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctactcttga 960
catccacaga acttagcaga gatgctttag tgccttcgga actctgagac aggtgctgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcacgagc gcaaccctta 1080
tcctttgttg ccagcgattc ggtcgggaac ctcaaaggag 1120

Claims (6)

1.一株菠萝泛菌，其特征在于：该菌株为Pantoea ananatis strain LAD128，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24784，保藏日期为2022年4月27日。
2.一种权利要求1所述菠萝泛菌的应用，其特征在于：所述菌株在促进番茄幼苗生长中的应用。
3.一种权利要求1所述菠萝泛菌的应用，其特征在于：所述菌株在提高番茄幼苗抗盐胁迫中的应用。
4.一种番茄幼苗促生长剂，其特征在于：番茄幼苗促生长剂含权利要求1所述菠萝泛菌。
5.按权利要求4所述的番茄幼苗促生长剂，其特征在于，所述番茄幼苗促生长剂中含权利要求1所述菌株的培养物、培养浓缩物、培养菌悬液。
6.按权利要求5所述的番茄幼苗促生长剂，其特征在于，所述培养物为将所述菌株培养至牛肉膏蛋白胨液体培养基中振荡培养得培养物；将所得培养物经浓缩即得浓缩物；将所得浓缩物经无菌水重悬，即得培养菌悬液。
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