CN116042439B - 一种根际放线菌asg及其在耐铝促茶树生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种根际放线菌ASG，SinomonasgamaensisASG，及其在耐铝促茶树生长中的应用，所述根际放线菌ASG属于放线菌门中华单胞菌属，于2022年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO.M2022212。所述根际放线菌ASG的16SrDNA基因序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本发明的根际放线菌ASG是通过梯度稀释法分离自2mM浓度Al3+处理半年的茶园土壤中，该菌株对金属铝的最大耐受浓度达到了6mM；此外，该根际放线菌ASG可以明显提高正常以及2mM铝胁迫下茶树茶籽苗和扦插苗的株高、根长、地上部干重、根干重，对受铝胁迫下的茶树幼苗生长有显著促生作用，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物肥料技术领域，具体涉及一种根际放线菌ASG及其在耐铝促茶树生长中的应用。
背景技术
茶作为我国一种常见的饮料，具有多种保健和养生功能，品种繁多，各有特色。随着市场对茶叶需求的增加，人们越来越关注茶叶的质量。化学肥料是运用最多的一类肥料，它们虽然可以促进植物的生长，抵抗植物所受到的危害，提高产量，但过量施用不仅会造成再生资源的浪费，还会导致土壤肥力下降、影响品质以及污染环境。因此为了满足农业可持续发展的需要，研究人员开始把目光转向生物菌肥。
生物菌肥是一种新型的化学肥料替代品，它包括根瘤菌肥、固氮菌肥、解磷菌肥、解钾菌肥等，菌肥可以单独施用以促进植物生长发育，抵抗各种危害，也可以与化学肥料配合施用，提高对植物生长的作用效果。生物菌肥以对植物促生的多种功能以及作用特点再次进入大家的视野，变成国内外研究的热点。所谓生物菌剂，指的是一种通过对微生物进行特定筛选、加工处理、增殖和扩大，然后再使用吸附剂进行吸附，从而制作而成的活菌剂。这些生物菌剂可以直接接种到农作物，帮助农作物抵抗胁迫，提高农作物的产量。
植物根际促生细菌是一种能在植物根际土壤中正常生长和繁殖，并具有促进植物生长发育、防御抵抗病虫害以及提高农作物产量能力的一类细菌。主要由解钾细菌、解磷细菌、固氮细菌和生物防治细菌等种类组成。许多研究表明根际促生细菌具有促进植物生长、改善根际微生态环境、耐受胁迫等功能，这些功能奠定了根际促生细菌在植物根际有益微生物中的地位。
茶树根际促生细菌对茶树的促生作用有很多，但具体的作用机制还尚未明确，但被大众所认同的作用主要是促进植物吸收外界的营养元素，以及产生一些调节物质，这些物质均可以促进植物生长。例如茶树根际促生细菌可以提高茶树叶片中的叶绿素含量，而叶绿素是茶树光合作用中最主要的一类色素，它可以利用叶绿素进行光合作用从而为植物提供营养。并且由于根际促生细菌定殖在茶树的根际土壤中，这与一些茶树病原菌定殖的生态位一致，所以根际促生细菌还可以与病原菌进行竞争，一起争夺生存空间和营养元素，这些也可以间接的促进茶树生长。能对茶树生长产生积极影响的根际促生细菌一般都具有溶磷能力、固氮能力、产生长素能力、产铁载体能力以及产生ACC脱氨酶的能力等，这些能力均可直接或者间接的帮助茶树吸收更多营养元素或者帮助茶树抵抗胁迫，从而达到更好的生长状态，提高茶叶的产量和品质。
发明内容
本发明从2mM浓度Al3+处理半年的茶树根系土壤进行了根际细菌的分离和纯化，筛选出了一种耐金属铝的放线菌门中华单胞菌属菌株ASG，对铝的最大耐受浓度为6mM；该菌株能够提高正常及铝胁迫下茶苗的根长和侧根干重，对幼苗生长具有显著的促生作用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种根际放线菌ASG，SinomonasgamaensisASG，该根际放线菌ASG属于放线菌门中华单胞菌属，于2022年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO.M2022212。该菌革兰氏染色为阳性，耐酸，杆状，需氧，该菌株具有耐铝、利用ACC脱氨酶、溶磷、产铁载体和产吲哚乙酸的能力，促进茶树生长之功效，可有效用于促进植物生长发育，以及降低铝对植物的毒害。
所述根际放线菌ASG的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了所述根际放线菌ASG在促进茶树生长中的应用。
本发明还提供了所述根际放线菌ASG在提高植物对金属铝胁迫环境耐受性中的应用。
进一步改进在于，所述植物为茶树。
进一步改进在于，所述对金属铝胁迫环境耐受性指对金属铝的最大耐受浓度为6mM。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明所述根际放线菌ASG，是通过梯度稀释法分离自2mM浓度Al3+处理半年的茶园土壤中，该菌株对金属铝的最大耐受浓度达到了6mM。
(2)所述根际放线菌ASG可以明显提高正常以及2mM铝胁迫下茶树茶籽苗和扦插苗的株高、根长、地上部干重、根干重，对受铝胁迫下的茶树幼苗生长有显著促生作用，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为根际放线菌ASG的菌落形态图；
图2为根际放线菌ASG的革兰氏染色显微图；
图3为根际放线菌ASG的耐铝能力示意图；
图4为茶籽苗接种实验组(菌株ASG、Al3+、ASG+Al3+)以及对照组(无菌水)后的茶树幼苗生长指标检测结果示意图(接种2个月后)；
图5为茶籽苗接种实验组(菌株ASG、Al3+、ASG+Al3+)以及对照组(无菌水)后的茶树形态图(接种2个月后)。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。
一种根际放线菌ASG，所述根际放线菌ASG属于放线菌门中华单胞菌属(Sinomonasgamaensis)，于2022年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO.M2022212。该菌株具有利用ACC脱氨酶等促进植物生长的指标，可配制形成微生物菌剂，能够促进茶树的根系生长发育。并且，还可以降低铝对不耐铝植物的毒害作用。同时，该菌株具有耐铝、利用ACC脱氨酶、溶磷、产铁载体和产吲哚乙酸的能力，促进植物生长之功效，可有效用于促进茶树生长发育，以及降低铝对植物的毒害，使用方便，效果好，经济和社会效益显著。
具体实施步骤如下：
1.茶树根际细菌提取、分离、鉴定：
从经过2mM铝处理半年后的舒茶早根际土壤中分离出根际细菌，方法如下：在无菌超净台中将根部土壤自然抖落并刷落粘附于根系表面的土壤，将土壤中的细根等杂质去除，称取5g根际土，并在其中加入45ml PBS缓冲液，混匀后静置。静置半小时后将根际土溶液上清液取出并梯度稀释至浓度为10-3、10-4、10-5，取稀释液200μL涂布于含2mM Al3+的LB固体培养基中，每个处理重复3次，28℃培养48-72h。其菌落形态图如图1所示，再根据固体培养基中菌落的形态、颜色等挑取单菌落，进行反复纯化后进行测序比对获得菌株。
将上述菌株进行革兰氏染色，结果如图2所示，革兰氏染色为紫色，然后通过DNA提取、PCR扩增，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将菌株的16S rDNA基因测序结果进行同源性比对，初步判断该菌株为革兰氏阳性菌，属于放线菌门中华单胞菌属(Sinomonasgamaensis)，命名为根际放线菌ASG，Sinomonas gamaensis ASG。
2.根际放线菌ASG促生指标测定
(1)测定根际放线菌ASG利用ACC能力
将ACC配成浓度为0.5mol/L的母液，用0.22μm过滤器过滤除菌，并配置无(NH4)2SO4的DF培养液并在121℃灭菌20min。随后向灭菌的DF培养液中加入ACC母液使ACC终浓度达到3.0mmol/L，配置成ADF固体培养基。将待测菌株活化成功后点接于ADF固体培养基上，每株待测菌株设置三个重复，置于28℃培养箱中培养3-7d，观察其生长状态，若能生长说明该菌可能具有利用ACC脱氨酶潜在活性，反之，则没有活性。
(2)测定根际放线菌ASG溶磷能力
按照配方配制无机磷固体培养基并在121℃灭菌20min。将待测菌株活化成功后点接于无机磷培养基，每株待测菌株设置三个重复，置于28℃培养箱培养7d，观察有无产生溶磷圈，若有则证明有此能力。
(3)测定根际放线菌ASG产铁载体能力
将待测菌株分别接种至5mL液体MKB无铁培养基中，在28℃摇床中饥饿培养72h。将菌液12000r/min离心1min，弃上清，然后用无菌超纯水12000r/min离心1min洗涤2次，再用无菌超纯水稀释10倍得到菌悬液。取待测菌液点接于无铁MKB固体培养基上，每株待测菌株设置三个重复，置于28℃培养箱培养48h。48h后可见每个MKB无铁固体培养基上都长出了明显的单菌落，待灭菌后的改良CAS检测培养基冷却至60℃左右时，将其按每个平板10mL倒入MKB无铁固体培养基中，放置1h观察每个平板的颜色变化，并记录结果，若菌斑周围颜色由蓝色变为红色则有此能力。
(4)测定根际放线菌ASG产生IAA能力
按照沙氏比色法配方配制有氮培养基，并在115℃高压灭菌30min。将色氨酸配成2.5mg/mL的溶液，过滤除菌。在无菌超净工作台中吸取5mL灭菌后的有氮培养基溶液分装于试管中，加入过滤除菌的2.5mg/mL色氨酸溶液，使色氨酸的浓度为0.5mg/mL，再吸取28℃摇床过夜的菌液100μL接种于上述培养液中，摇床培养24h。将培养好的细菌培养液与比色液Ⅰ按1:1比例混匀避光反应30分钟，观察颜色变化，若显粉红色则呈阳性。将培养好的细菌培养液与比色液Ⅱ按1:2比例混匀避光反应30分钟，用分光光度计在波长530nm下测定吸收值。将IAA标准品进行上述实验，得到标准曲线，将不同菌液的吸收值代入其中换算得到IAA含量。
3.根际放线菌ASG耐铝能力测定
先将待测菌株接种到LB液体培养基中置于28℃摇床过夜，将过夜活化成功的待测细菌溶液按接种量的1％接种到含有不同Al3+浓度(0、1、2、4、6、8mmol/L)的LB液体培养基中，并在28℃，180rpm摇床中培养12-24h后用分光光度计测量在600nm波长下的细菌生长的OD值，以Al3+浓度为0的LB液体培养基中细菌生长的OD值为对照，不同Al3+浓度的OD值结果如图3所示。同时吸取过夜活化的待测菌株溶液5μL点接到含有不同Al3+浓度(0、1、2、4、6、8mmol/L)的LB固体培养基中，并在28℃培养箱中培养48h，每株待测菌株设置三个重复，观察菌株生长状态并测量其菌斑的大小。
通过上述5个植物生长促进指标的测定以及耐铝能力测定(数据如表1所示)，可以看出，根际放线菌ASG的ACC脱氨酶活性、溶磷能力、IAA产生能力以及对金属铝的耐受性均较强。
表1菌株ASG的各项指标
注：合成ACC脱氨酶能力用“+”和“-”表示，“+”表示具有合成ACC脱氨酶能力，“-”表示没有合成ACC脱氨酶能力。溶磷能力＝溶解晕圈直径/菌斑直径，数值越大，能力越强。产铁载体能力＝晕圈直径/菌斑直径，数值越大，能力越强。(>2，+++；1.5-2，++；1-1.5，+；“-”表示无能力。
4.根际细菌菌株ASG处理茶树幼苗
(1)茶树茶籽苗菌处理：取适量舒茶早茶籽并浸泡在水中2d，每天换水，两天后将水更换成OD600值为0.3的菌液，将茶籽再放入其中浸泡1d，让根际细菌充分进入茶籽。随后将浮于水面的茶籽去除，将沉底的茶籽撒播在灭菌的土壤中，再将剩余菌液浇灌在土中。待茶籽萌芽生根后，将长势良好的茶籽苗分别移栽于灭菌的土壤中，并每2-3周浇一次菌液，每株茶苗每次浇5mL菌液。每种处理各20棵茶籽苗，浇满2-3个月后观察茶籽苗生长情况并测量其各项生理指标。如图5所示，为茶籽苗接种实验组(菌株ASG、Al3+、ASG+Al3+)以及对照组(无菌水)后的茶树形态图(接种2个月)，与对照组以及Al3+实验组相比，接种ASG菌株的两实验组茶籽苗长势明显更好。
(2)茶树扦插苗菌处理：将根际细菌ASG活化培养后配制成OD600＝0.3的菌液，随后以每株10mL量的菌液浇灌在扦插苗根部土壤内。随后浇灌根际细菌菌液的频率为每月一次，浇菌量为每株扦插苗根部土壤10mL的菌液。浇满6个月后观察并测量扦插苗的地上和地下部分的各项生理指标。(扦插促生实验每组处理扦插苗98株；实验重复3次。)
结果：根际放线菌ASG对茶籽苗的根长和侧根干重的影响如图4所示，与对照组相比，接种根际放线菌ASG的实验组茶籽苗根长以及侧根干重都明显增加，金属铝处理后的茶籽苗实验组根长变化不明显，侧根干重显著增加，根际放线菌ASG和2mM铝同时施用的处理组根长和侧根干重都显著增加，这表明根际放线菌ASG对茶籽苗有一点的促进作用，并且在高浓度的铝处理下仍能保持这种促进效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种根际放线菌ASG，其特征在于，所述根际放线菌ASG属于放线菌门中华单胞菌属，于2022年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO. M 2022212。
2.一种如权利要求1所述根际放线菌ASG在促进茶树生长中的应用。
3.一种如权利要求1所述根际放线菌ASG在提高茶树对金属铝胁迫环境耐受性中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种根际放线菌ASG在提高茶树对金属铝胁迫环境耐受性中的应用，其特征在于，所述对金属铝胁迫环境耐受性指对金属铝的最大耐受浓度为6 mM。
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