CN112831430A - 一种水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种水丛毛单胞菌菌株，命名为水丛毛单胞菌Ca30，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21152；本发明的水丛毛单胞菌Ca30，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治水稻纹枯病的生防菌剂，经过试验证明，本发明提供的生防菌剂在离体条件下处理水稻叶片后使得水稻纹枯病的发病面积减少了94.57％，温室条件下对水稻纹枯病的防治效果达到了65.26％，其防治效果与常用化学农药噻呋·苯醚甲持平，其抑菌效果非常明显。

Description

一种水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是全球重要的粮食作物之一，全世界近2/3以上的人口以稻米为食，尤其是在亚洲、拉丁美洲和非洲。即使在大田管理越来越科学的情况下，水稻的生产过程中仍然避免不了环境中的生物胁迫和非生物胁迫给水稻产量和品质带来的巨大损失。病害被认为是水稻生产的主要品质制约和产量限制因素，目前，超过70多种由真菌，细菌，病毒或线虫引起的病害被报道。
由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的水稻纹枯病(Rice sheathbight)是水稻的三大病害之一。条件和温度适宜时，其发病率可达2.5％-50％。水稻纹枯病菌的有性态是担子菌亚门真菌的瓜亡革菌。菌丝初期为白色，稀疏，后期逐渐变褐色，菌丝聚集、纠结从而产生菌核。水稻纹枯病是一种典型的土传性真菌病害，主要以菌核、病残体的形式在土壤中越冬，翌年通过雨水传播。该病害在水稻的整个生育期都可发生，危害大、流行性强、寄主范围广，其主要危害部位为叶鞘和叶片，产生的菌核能抗逆和忍耐极端环境,对稻米的高产稳产造成了重大的影响。近年来随着矮杆、多蘖良种的推广应用以及栽培密度、氮肥使用量的增加，其危害程度日益严重，在我国尤其是南方造成了严重的经济损失。
在尚无有效抗病品种的情况下，主要依赖于药剂来防治水稻纹枯病，尤其是井冈霉素、噻呋酰胺，虽然防治简便、效果迅速，但长期大规模使用单一药剂会导致病原物抗性增强，防治效果逐渐降低，而剂量不断加大后也会污染环境，造成恶性循环。因考虑环境及人体健康等问题，欧盟早已于2002年提议禁止使用井冈霉素。因此寻找安全的防治措施和新型的防治材料并探究其机理具有重要的研究价值。生物防治，是利用有益微生物或者有益微生物的代谢物对作物病害进行防治，对人、畜安全和对环境污染极少，逐渐被研究学者们所重视，具有良好的应用前景。
目前，利用生防细菌来防治水稻纹枯病的研究非常多，其中发现最多为芽孢杆菌(Bacillus sp.)和假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)和假单胞杆菌 (Pseudomonas sp.)。由于这些细菌菌株绝大部分并非来自水稻根际，导致其在水稻大田难以表现良好的抗病活性。有鉴于此，从水稻根际分离具有高抗病活性的菌株才有潜能真正用于稻田防病。
发明内容
本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种可以防治水稻纹枯病的细菌菌株，还提供了一种包含上述细菌菌株的生防菌剂，可以很好地应用于水稻纹枯病的防治工作中。
为实现本发明的上述目的，采用了以下技术方案：
一种水丛毛单胞菌菌株，命名为水丛毛单胞菌Ca30，分类命名为水生丛毛单胞菌Comamonas aquatica，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号)，保藏编号：CGMCCNO.21152。
本发明的水丛毛单胞菌菌株为2019年在南京市江宁区汤山镇水稻根围土壤中分离得到；
分离方法：采用5点取样法取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室；将土样5g加入45mL无菌水中，于摇床150r/min振荡培养1h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10-6倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于NA平板上，于28℃恒温培养箱中培养 48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入于NA斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。
平板对峙法：选取培养2d的水稻纹枯病菌菌饼(5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼25mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照组。28℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为水丛毛单胞菌Ca30。
生物学特性：革兰氏阴性菌，菌体为球形，有鞭毛，无荚膜。菌落形态：圆形，菌落直径较大，表面光滑，垫状，不透明，边缘完整。
含有所述水丛毛单胞菌Ca30的生防菌剂也属于本申请要求保护的范围，制备方法是将水丛毛单胞菌Ca30经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。
具体的制备方法优选包括以下步骤：将水丛毛单胞菌Ca30在NB培养基中，25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以 1％的接种量接种于基础盐培养基，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×108～1×109CFU/mL的生防菌剂成品。
本发明还提供了一种上述水丛毛单胞菌菌株或生防菌剂在防治水稻纹枯病中的应用。
具体方法为：在使用前，将制得的生防菌剂稀释至OD＝1.0，在水稻苗期喷施叶片。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的生防菌剂中含有抑制水稻纹枯病病原菌生长的专一性菌株水丛毛单胞菌Ca30，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明提供的生防菌剂在离体条件下处理水稻叶片后使得水稻纹枯病的发病面积减少了94.57％，温室条件下对水稻纹枯病的防效达到了65.26％，其防效与常用化学农药噻呋·苯醚甲持平；
(2)本发明的水丛毛单胞菌Ca30，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治水稻纹枯病的生防菌剂；
(3)本发明提供的生防菌剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以减少甚至不用其他相应化学农药，不仅节省农民开支，还提高稻米品质；
(4)经过试验证明，本发明提供的生防菌剂，具有抗病作用，进而大幅度促进农民增收。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1：水丛毛单胞菌Ca30的分离纯化与鉴定
本发明所涉及的防治水稻纹枯病的水丛毛单胞菌Ca30，为2019年在南京市江宁区汤山镇水稻根围土壤中分离得到。
分离方法：采用5点取样法取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室；将土样5g加入45mL无菌水中，150r/min下于摇床振荡培养1h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10-6倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于NA平板上，于28℃恒温培养箱中培养 48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入于NA斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。
平板对峙法：选取培养2d的水稻纹枯病菌菌饼(5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼25mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL 供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照组。28℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株Ca30。
生物学特性：革兰氏阴性菌，菌体为球形，有鞭毛，无荚膜。菌落形态：圆形，菌落直径较大，表面光滑，垫状，不透明，边缘完整。
参照《细菌鉴定手册》，根据生物学特性鉴定为水丛毛单胞菌(Comamonasaquatica)，于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC NO.21152。
实施例2：生防菌剂的制备
用分离得到的水丛毛单胞菌Ca30制备生防菌剂，具体包括以下步骤：将水丛毛单胞菌Ca30在NB培养基中28℃、180rpm振荡培养20h，获得种子液，种子液中活菌总浓度约为106CFU/mL；将种子液以1％的接种量接种于基础盐培养基，装量50mL(250mL三角瓶)，于30℃、180rpm摇床振荡培养72 h，获得活菌总浓度为1×109CFU/mL的生防菌剂成品。
NB培养基：牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g，蒸馏水定容至1L。
NA固体培养基：牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂18g，蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0，并于1×105Pa灭菌30min。
基础盐培养基：葡萄糖5g、硫酸铵2g、柠檬酸钠1g、七水硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾6g，双蒸水定容至1L，调节pH值至5.0，并于 1×105Pa灭菌30min。
实施例3：平板对峙试验检测生防菌剂对水稻纹枯病的防效
将实施例2制得的生防菌剂稀释5倍得到活菌总浓度为2×108CFU/mL的生防菌剂，采用菌丝生长速率法，将水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)转接到PDA平板中，25℃下活化96h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并转接到含有0.1mL活菌总浓度为2×108CFU/mL生防菌剂的 PDA平板中作为处理组，对照组为直接将水稻纹枯病菌转接到PDA平板中；处理组、对照组均在25℃培养，待对照组菌落长至约平板直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径，计算菌落直径均值，表1示出了生防菌剂对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制效果，按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率；
菌丝生长平均抑制率＝[(对照组菌落直径均值-处理组菌落直径均值)/(对照组菌落直径均值-接种菌饼直径)]×100％。
表1生防菌剂对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制效果
Figure RE-GDA0003028672480000061
表1数据显示，由水从毛单胞菌Ca30制备的生防菌剂对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制效果达90.3％。
实施例4：生防菌剂对水稻纹枯病的离体防效测定
选取长势一致的水稻叶片(生长60d左右)。用无菌剪刀将稻叶分段，每段5cm，叶片使用2％次氯酸钠表面消毒30s，并用无菌蒸馏水洗涤5次。将叶片置于水琼脂平板中，每个平板中放置3段。水稻叶片中间部位接入培养2d 的纹枯病菌菌饼(直径为5mm)，以不接病原菌菌饼为对照。采用下述处理： (1)叶片浸泡于100mL生防菌剂悬浮液(OD600＝1.0)1h，(2)叶片浸泡于100 mL 10％井冈霉素WP(0.3125μg/mL)1h，(3)叶片浸泡于100mL噻呋·苯醚甲(0.3125μg/mL)1h，(4)叶片浸泡于100mLNB培养基中1h，每个处理均含有0.02％吐温80。每处理9片叶片，设3个重复。平板置于28℃的光照培养箱中培养，3d后观察叶片发病面积，统计发病情况，表2示出了水丛毛单胞菌Ca30对水稻纹枯病的离体防治效果数据；发病级数用“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”分别代表0、1、2、3、4级发病情况，即级数越高发病情况越严重，实验重复三次，具体地，
“-”：叶片无病；
“+”：病斑面积/叶片面积＝25％以下；
“++”：病斑面积/叶片面积＝26％-50％；
“+++”：病斑面积/叶片面积＝51％-75％；
“++++”：病斑面积/叶片面积＝76％以上。
表2水丛毛单胞菌Ca30对水稻纹枯病的离体防效
Figure RE-GDA0003028672480000071
由表2数据可知，用水丛毛单胞菌Ca30、噻呋·苯醚甲、10％井冈霉素和 NB培养基处理水稻叶片后，分别于叶片中部接种5mm菌饼，3d后发病面积分别为4.57％、9.23％、65.82％和84.25％，可见生防菌剂悬浮液(OD600＝1.0) 处理过的叶片发病面积低于阳性对照(10％井冈霉素和噻呋·苯醚甲)和阴性对照(NB)，使用水丛毛单胞菌Ca30处理水稻叶片后其发病面积相对于对照的发病面积减少了94.57％。另外，只用菌株Ca30处理的水稻叶片，无任何不良症状。
实施例5：生防菌剂对水稻纹枯病的盆栽防效测定
取水稻种子(武运粳21号)于121℃高温灭菌20min后用无菌水浸泡6h，接种2d菌龄的纹枯病菌，28℃培养7d作为接种物。田间取土，121℃高温灭菌60min，以去除土壤中病残体。水稻种子使用2％次氯酸钠消毒30min，无菌水洗涤5次，使用无菌水浸泡12h后，将种子放入含有2层浸湿的无菌滤纸中催芽。水稻秧苗移栽至塑料盆(长16cm、宽16cm、高25cm)，每盆移栽3 丛秧苗，每丛3株水稻，然后将水稻置于温室(20～30℃，湿度85％，光照 16L:8D)培养，待秧苗长至分蘖期时，进行试验处理。
试验处理：用相同体积的NB培养基、生防菌剂培养液(OD600＝1.0)、噻呋酰胺(0.3125μg/mL)喷施水稻植株直至滴水为止，此后每隔7d处理一次。每个处理均含有0.02％吐温80；在化学喷涂之前，塑料盆中灌满水，喷施药剂后抽出水，以防止从根部吸收化学药剂。喷施处理12h后，使用镊子将预先培养好的接种物置于水稻基部，每丛接种6粒接种物，接种后使用塑料膜覆盖保湿 12h。于处理后21d调查病害严重程度。试验重复三次，每次处理6盆。实验重复三次；表3示出了使用以下方法评估纹枯病的严重程度(IRRI,1980)，具体地：
水稻纹枯病病情分级标准
“0”，无症状；
“1”，病变限于较低叶鞘面积的1/4；
“3”，叶片下半部分存在病变鞘面积；
“5”，病斑存在于叶鞘面积的1/2以上，在下部(第3或第4)叶上轻微感染；
“7”，病变存在超过3/4的叶鞘，上部严重感染叶子(旗子和第2片叶子)；
“9”，病变到达分蘖顶部。
病情指数＝∑(病级株数×该病级数)/(总植株数×最高病级数)
防效＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％
表3温室中生防菌剂Ca30对水稻纹枯病的防效
Figure RE-GDA0003028672480000091
在温室盆栽条件下，水丛毛单胞菌Ca30对水稻纹枯病的防治效果如表3 所示，水丛毛单胞菌Ca30、噻呋·苯醚甲与对照相比明显减轻了水稻纹枯病的发生；第21d时，水丛毛单胞菌Ca30对水稻纹枯病的防治效果为65.26％。在 5％的显著水平上，对照的病情指数显著高于噻呋·苯醚甲与水丛毛单胞菌Ca30 处理的病情指数，且杀菌剂的病情指数与Ca30的病情指数没有显著性差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种水丛毛单胞菌菌株，其特征在于，命名为水丛毛单胞菌Ca30，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21152。
2.含有权利要求1所述水丛毛单胞菌菌株的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，生防菌剂中活菌总浓度为1×108～1×109CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂由权利要求1所述的水丛毛单胞菌菌株经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。
5.一种如权利要求4所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将水丛毛单胞菌Ca30在NB培养基中25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于基础盐培养基，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×108～1×109CFU/mL的菌剂成品。
6.如权利要求1所述的水丛毛单胞菌菌株或权利要求2所述的生防菌剂在防治水稻纹枯病中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在使用前，将制得的生防菌剂稀释至OD＝1.0，在水稻苗期喷施叶片。
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