CN110819567B - 一种罗氏甲基杆菌m520及其应用 - Google Patents

一种罗氏甲基杆菌m520及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60729。本发明还提供了所述M520菌株在制备防治根结线虫或促进植株生长中的应用。将本发明罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520菌株代谢粗提物作用于根结线虫，对根结线虫致死率超过96.6％；另外，该菌株的发酵培养物在有效防治盆栽蔬菜根结线虫的同时，对蔬菜植株生长具有明显促进作用，扩充了甲基杆菌使用范围和使用功效，丰富了根结线虫病的防治手段、提升了蔬菜植株的生长速度和蔬菜产量。

Description

一种罗氏甲基杆菌M520及其应用
技术领域
本发明属于微生物的技术领域，具体涉及一种罗氏甲基杆菌(Methylorubrumrhodesianum)M520及其应用。
背景技术
蔬菜根结线虫病又称“瘤子病”，是一种由根结线虫引起的蔬菜常见病。近年来，由于棚室蔬菜面积的扩大，为该病发生提供了适宜的环境条件，使得线虫病日益严重，尤以棚室连作的黄瓜、西红柿、芹菜更为突出，每年造成的损失高达数十亿元。由于抗根结线虫病的蔬菜种质资源稀少，因此目前防治蔬菜根结线虫病的主要方式仍是化学防治，如阿维菌素、棉隆等。这些化学药剂虽然能高效杀死根结线虫，但同时会带来一系列副作用：影响蔬菜安全性、降低蔬菜食用品质，污染土壤和水资源、破坏生态平衡，影响蔬菜连种、降低产量等。随着绿色安全高效农业的发展需要，越来越多的化学农药被禁止应用于蔬菜，针对蔬菜根结线虫的安全高效的生物防治技术越来越受到重视。
甲基杆菌是一类能够利用非C-C键低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛类等)的微生物。由于这类细菌多为杆状，因此也称为甲基杆菌(Methylotrophic bacteria)。甲基杆菌属的细菌大多数呈粉红色，它们通常被称作PPFM细菌(pink-pigmented facultativelymethylotrophic bacteria)。PPFM细菌通常寄生在植物根、茎、叶表上，以植物分泌的一碳化合物为碳源，并产生植物激素如生长素(IAA)、细胞分裂素(CK)，并对植物氮代谢、种子发芽、光合作用、植物营养等有着正向作用。许多兼性甲基营养菌都对农业有益，将它们施用于种子、根或者叶子上时，能提高植物种子的发芽率，提高植物的生物量，提高农作物的产量。专利US5512069A中揭示了甲基杆菌用于种子的用途，专利US5961687A中揭示了甲基杆菌用于叶子的用途，但鲜少有将甲基杆菌用于农作物根结线虫病防治及促进植株生长领域的研究报导。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种具有抗线虫活性的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520及其应用。
一方面，本发明提供了一种罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60729。
本发明还提供了所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520的菌剂。
本发明还提供了所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520或所述的菌剂在制备防治根结线虫制剂的应用。
本发明还提供了所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520或所述的菌剂在促进植株生长中的应用。
优选的，所述根结线虫为南方根结线虫。
本发明还提供了一种防治根结线虫的方法，使用所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520或所述的菌剂。
优选的，该方法还包括将罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520发酵培养，获得发酵培养物的步骤。
优选的，发酵培养的温度为28～30℃，时间为2～4d。
优选的，该方法还包括在发酵培养物中加入有机溶剂提取，减压蒸馏，获得发酵粗提物的步骤。
优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述提取为浸泡提取或浸泡后震荡提取，浸泡时间为12～36h，震荡时间为0.5～1.5h。
本发明的有益效果：
(1)本发明罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520菌株直接从农田地地瓜叶片中分离得到，取之于自然并直接作用于蔬菜土壤。与传统化药防治方案相比，该菌株处理的蔬菜无农残风险、蔬菜产品安全性高；不会产生抗药性，能长期持续防治根结线虫病；无环境污染问题，可满足农业可持续生产需求。
(2)将罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520菌株代谢粗提物作用于根结线虫，对根结线虫致死率超过96.6％；另外，该菌株的发酵培养物在有效防治盆栽蔬菜根结线虫的同时，对蔬菜植株生长具有明显促进作用，扩充了甲基杆菌使用范围和使用功效，丰富了根结线虫病的防治手段、提升了蔬菜植株的生长速度和蔬菜产量。
(3)本发明罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520菌株能长期作用于作物土壤而不改变土壤特性，为蔬菜连种提供了保障，提高了土地利用率和蔬菜产量。
生物材料保藏信息：
罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520，已于2019年7月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。保藏编号GDMCC No.60729，建议的分类名称：Methylorubrum rhodesianum。
附图说明
图1为本发明的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520菌株的菌落形态图；
图2为本发明的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520菌株发酵培养物在防治盆栽黄瓜根结线虫病中的应用效果对比图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式和附图进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，如非特别说明，所用试剂和材料均为常规市售可得。
实施例1：甲基杆菌M520菌株的分离纯化与鉴定
甲基杆菌包括以下的群组：噬氨基甲基杆菌、扭脱原单胞甲基杆菌、福氏甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗氏甲基杆菌、结节性甲基杆菌、费氏甲基杆菌(M.phyllosphaerae)、嗜有机甲基杆菌、甲基杆菌CM4株系、硫氰基甲基杆菌和稻甲基杆菌(M.oryzae)。
1、甲基杆菌M520菌株的分离纯化
样本自福建省的农田地里采集到的地瓜叶片。
秤取1g地瓜叶片，加入到灭过菌的100mL浓度为0.1％的吐温水80中，持掌上型破碎机将叶片打碎，取叶子液体梯度稀释至10-2、10-3浓度，然后涂布于AMS固体无机盐培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养5天，5天后挑取单菌落，继续接种于AMS固体无机盐培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d，然后观察菌落形态，并用光学显微镜观察菌体型态(1000X)。
需要说明的是，AMS固体无机盐培养基的配方为：无水磷酸氢二钾700mg、无水磷酸二氢钾540mg、七水合硫酸镁1g、无水氯化铵500mg、脱水氯化钙200mg、七水合硫酸亚铁4mg、七水合硫酸锌100μg、四水合氯化锰30μg、无水硼酸300μg、六水合氯化钴200μg、脱水氯化铜10μg、六水合氯化镍20μg、脱水钼酸钠60μg、琼脂15g，补水至1L，高温灭菌后加入0.22μm滤膜过滤后的甲醇5mL。
2、甲基杆菌M520菌株的鉴定
AMS固体无机培养基上的菌落形态如图1所示，获得的菌株菌落呈不透明的粉红色，形状为圆形，向上突起，边缘整齐，表面有层膜状。该菌株的菌体能生芽孢，无鞭毛，卵圆形。
随后，对该菌株的序列进行了16S序列片段(扩增引物与测序引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')测定，测定结果见序列表SEQ NO.1；序列16S rRNA序列同源性分析、系统发育分析，通过BLAST同源比对，我们确定该菌株最近的种属为罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)。序列测定结果SEQNO.1所示：
ttcgcgtccctctgtcaccgccattgtagcacgtgtgtagcccatcccgtaagggccatgaggacttgacgtcatccacaccttcctcgcggcttatcaccggcagtctccctagagtgcccaactgaatgatggcaactaaggacgtgggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgtgcacgcctccgaagaggatcccaaatctctctgggtaacatgccatgtcaagggatggtaaggttctgcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagcggcgccactgacctgcaagcaggccaacggctggcattcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagaaccggaccagacagccgccttcgccactggtgttcttgcgaatatctacgaatttcacctctacactcgcagttccgctgtcctcttccggtctcaagccaaccagtatcgaaggcaattctgtggttgagccacaggctttcacccccgacttaatcggccgcctacgcgccctttacgcccagtgattccgagcaacgctagcccccttcgtattaccgcggctgctggcacgaagttagccggggcttattcttccggtaccgtcattatcgtcccggacaaaagagctttacaaccctaaggccttcatcactcacgcggcatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcatcctctcagaccagctactgatcgtcgccttggtaggccgttaccccaccaacaagctaatcagacgcgggccgatccttcggcagtcaacctttccccataagggcgtatccggtattagctcaagtttccctgagttattccgaaccgaagggcacgttcccacgtgttactcacccgtctgccactgacatc
实施例2：甲基杆菌M520菌株代谢粗提物杀灭蔬菜根结线虫的效果
1、制备试验用线虫
根结线虫采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。将根结线虫自发病辣椒的根系取出，用水轻轻冲洗，从根系表面小心取下卵块，放在0.5％的次氯酸钠中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，24h-48h收集孵化的根结线虫二龄幼虫，用无菌水悬浮用于试验研究。
2、甲基杆菌M520菌株代谢粗提物的制备
甲基杆菌M520菌株代谢粗提物的制备方法：
S1：将活化的甲基杆菌M520菌株接种1mL到AMS液体培养基上，28℃摇床无菌培养3天，获得发酵培养物；
AMS液体培养基：无水磷酸氢二钾700mg、无水磷酸二氢钾540mg、七水合硫酸镁1g、无水氯化铵500mg、脱水氯化钙200mg、七水合硫酸亚铁4mg、七水合硫酸锌100μg、四水合氯化锰30μg、无水硼酸300μg、六水合氯化钴200μg、脱水氯化铜10μg、六水合氯化镍20μg、脱水钼酸钠60μg，补水至1L，分装100ml培养基于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，冷却后每100ml加入0.22μm滤膜过滤后的甲醇0.5mL。
S2：将得到的发酵培养物用乙酸乙酯进行提取(提取方式见表1)，提取后，静置分层，将上层有机相倒出，得到粗提液；再分离粗提液中的乙酸乙酯(分离方式见表1)，得到代谢粗提物。
根据步骤S2中的乙酸乙酯提取方式和分离方式的不同，设定三组实验组，参数如表1：
表1不同条件下代谢粗提物的制备
实验组1 实验组2 实验组3
提取方式 浸泡后震荡提取 浸泡提取 浸泡后震荡提取
提取时间 36h 36h 24h
分离方式 蒸馏 蒸馏 减压蒸馏
注：提取方式中的震荡方式为浸泡完成后进行超声震荡，震荡时间1h。
3、甲基杆菌M520菌株代谢粗提物杀线虫测定
在24孔无菌细胞培养板上，分别向孔内加入不同条件下制得的代谢粗提物5μL(加入1％(v/v)的甲醇作为溶剂)，以无菌水(加入1％(v/v)的甲醇)作为对照，然后分别向处理和对照中加入100μL线虫悬浮液(约100条线虫)和395μL无菌水，使总体积为500μL。放在室温下24h，观察根结线虫的死亡情况，计算校正死亡率，即为杀线虫效果，每组试验重复三次，杀线虫效果见表2。
矫正死亡率计算公式：
Figure BDA0002281977350000071
通过表2可知，不同条件下制得的甲基杆菌M520菌株代谢粗提物对线虫作用效果有所差异，经震荡浸泡提取可有效提升代谢粗提物的校正死亡率达到98.2％以上，直接浸泡提取的代谢粗提物矫正死亡率也高达96.6％，亦能有效杀死根结线虫，农业应用上可根据不同的需求采用不同方式制备代谢粗提物防治根结线虫病。
表2不同条件下制得的代谢粗提物杀线虫效果
线虫死亡率 实验组1 实验组2 实验组3 无菌水对照
重复1 98.5 97.5 99.2 1.1
重复2 97.1 94.1 97.4 1.0
重复3 99.0 98.2 98.9 1.2
矫正死亡率 98.2 96.6 98.5 -
实施例3：甲基杆菌M520菌株发酵培养物在防治盆栽蔬菜根结线虫病中的效果
1、制备试验用线虫和甲基杆菌M520菌株发酵培养物
制备根结线虫：根结线虫采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。将根结线虫发病辣椒的根系取出，用水轻轻冲洗，从根系表面小心取下卵块，放在0.5％的次氯酸钠中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，24h-48h收集孵化的根结线虫二龄幼虫，用无菌水悬浮用于试验研究。
制备发酵培养物：将活化的甲基杆菌M520菌株接种到AMS液体培养基上，28℃摇床无菌培养3天，获得甲基杆菌M520菌株发酵培养物。其中，AMS液体培养基的配方为：无水磷酸氢二钾700mg、无水磷酸二氢钾540mg、七水合硫酸镁1g、无水氯化铵500mg、脱水氯化钙200mg、七水合硫酸亚铁4mg、七水合硫酸锌100μg、四水合氯化锰30μg、无水硼酸300μg、六水合氯化钴200μg、脱水氯化铜10μg、六水合氯化镍20μg、脱水钼酸钠60μg，补水至1L。经121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后每100mL培养基加入0.22μm滤膜过滤后的甲醇0.5mL。
2、甲基杆菌M520菌株发酵培养物防治盆栽蔬菜根结线虫病效果测试
将中农6号黄瓜种子用1％次氯酸钠消毒，催芽后，种到灭菌的草炭和细沙混合基质中育苗。至第一片真叶长出时，移苗至7cm*7cm*10cm的塑料钵中，以灭菌的草炭和细沙作为混合基质，待中农6号黄瓜幼苗长至两片真叶，在黄瓜幼苗土壤中接种15mL甲基杆菌M520菌株发酵培养物，1天后，接种根结线虫二龄幼虫，每株黄瓜幼苗接种300条，在室温下正常管理，并在5周后检测黄瓜幼苗上的根结数量，计算甲基杆菌M520菌株发酵培养物对根结线虫的防治效果。以无菌水处理作为对照，同时以农药“阿维菌素”处理结果作为防治效果参考，每组处理30株黄瓜苗，重复3次，防治效果见表3和图2。
防治效果计算公式：
Figure BDA0002281977350000091
通过表3可以看出，无菌水对照处理组黄瓜幼苗上的平均根结数为120.7个/株，而甲基杆菌M520菌株发酵培养物处理的盆栽黄瓜幼苗上的平均根结数为41.97个/株，其对根结线虫的防治效果达到了65.2％，说明罗氏甲基杆菌M520菌剂可以显著降低黄瓜幼苗根系上的根结数、有效防治黄瓜根结线虫病。另外，农药阿维菌素处理的黄瓜幼苗上的平均根结数低至3.1个/株，防治根结线虫效果最佳。但是，经阿维菌素处理的黄瓜苗死苗率高(此处数据未列出)；且按照中国农药毒性分级标准，阿维菌素属于高毒杀虫剂，对鱼类等具有高毒性，一旦使用不当将直接危害人类健康。相较而言，甲基杆菌M520菌株取之于自然，具有高效安全等特点，在农业生产中防治根结线虫病具有重要价值。
表3甲基杆菌M520菌株发酵培养物对盆栽蔬菜根结线虫病防治效果
根结数 无菌水对照 菌株发酵培养物 农药阿维菌素
重复1 117.9 40.5 2.9
重复2 120.7 41.9 3.2
重复3 123.5 43.5 3.2
平均根结数 120.7 41.97 3.1
防治效果 - 65.2％ 97.4％
实施例4：甲基杆菌M520菌株发酵培养物在促进蔬菜植株生长中的效果
制备发酵培养物：将活化的甲基杆菌M520菌株接种到AMS液体培养基上，28℃摇床无菌培养3天，获得甲基杆菌M520菌株发酵培养物。其中，AMS液体培养基的配方为：无水磷酸氢二钾700mg、无水磷酸二氢钾540mg、七水合硫酸镁1g、无水氯化铵500mg、脱水氯化钙200mg、七水合硫酸亚铁4mg、七水合硫酸锌100μg、四水合氯化锰30μg、无水硼酸300μg、六水合氯化钴200μg、脱水氯化铜10μg、六水合氯化镍20μg、脱水钼酸钠60μg，补水至1L。经121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后每100mL培养基加入0.22μm滤膜过滤后的甲醇0.5mL。
促生长效果测试：以灭菌的草炭和细沙作为混合基质，将粤秀3号黄瓜幼苗进行温室栽培，待黄瓜幼苗长至7天、14天时，分别在黄瓜幼苗的土壤中接种15mL甲基杆菌M520菌株发酵培养物，21天后观察黄瓜幼苗的生长情况。以无菌水处理作为对照，每组处理30株黄瓜苗，黄瓜幼苗的各项生长指标见表4。
由表4可知，接种过甲基杆菌M520菌株发酵培养物的黄瓜幼苗的嫩叶生长速度、根系生长速度明显加快，促生长率分别达到23.97％和24.13％，有利于缩短植株的栽培周期，提高土地利用率。
表4黄瓜苗温室栽培的各项生长指标
黄瓜苗生长指标 无菌水对照 菌株发酵培养物
叶面展开度(mm) 10.47±0.61 12.98±0.42
鲜重(g) 2.00±0.22 2.25±0.14
根系干重(mg) 22.5±0.12 27.93±0.20
以上对本发明所提供的一种罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520及其应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，慕恩（广州）生物科技有限公司
<120> 一种罗氏甲基杆菌（Methylorubrum rhodesianum）M520及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1128
<212> DNA
<213> 罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)
<400> 1
ttcgcgtccc tctgtcaccg ccattgtagc acgtgtgtag cccatcccgt aagggccatg 60
aggacttgac gtcatccaca ccttcctcgc ggcttatcac cggcagtctc cctagagtgc 120
ccaactgaat gatggcaact aaggacgtgg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 180
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cccaaatctc tctgggtaac atgccatgtc aagggatggt aaggttctgc gcgttgcttc 300
gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagttttaat 360
cttgcgaccg tactccccag gcggaatgct taatgcgtta gcggcgccac tgacctgcaa 420
gcaggccaac ggctggcatt catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 480
ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agaaccggac cagacagccg ccttcgccac 540
tggtgttctt gcgaatatct acgaatttca cctctacact cgcagttccg ctgtcctctt 600
ccggtctcaa gccaaccagt atcgaaggca attctgtggt tgagccacag gctttcaccc 660
ccgacttaat cggccgccta cgcgcccttt acgcccagtg attccgagca acgctagccc 720
ccttcgtatt accgcggctg ctggcacgaa gttagccggg gcttattctt ccggtaccgt 780
cattatcgtc ccggacaaaa gagctttaca accctaaggc cttcatcact cacgcggcat 840
ggctggatca ggcttgcgcc cattgtccaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc 900
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggctga tcatcctctc agaccagcta ctgatcgtcg 960
ccttggtagg ccgttacccc accaacaagc taatcagacg cgggccgatc cttcggcagt 1020
caacctttcc ccataagggc gtatccggta ttagctcaag tttccctgag ttattccgaa 1080
ccgaagggca cgttcccacg tgttactcac ccgtctgcca ctgacatc 1128

Claims (9)

1.一种罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520，其特征在于，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60729。
2.包含权利要求1所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520的菌剂。
3.权利要求1所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520或权利要求2所述的菌剂在制备防治南方根结线虫制剂中的应用。
4.权利要求1所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520或权利要求2所述的菌剂在促进黄瓜生长中的应用。
5.一种防治南方根结线虫的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520或权利要求2所述的菌剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法还包括将罗氏甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum)M520发酵培养，获得发酵培养物的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养的温度为28～30℃，时间为2～4d。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法还包括在发酵培养物中加入有机溶剂提取，减压蒸馏，获得发酵粗提物的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述提取为浸泡提取或浸泡后震荡提取，浸泡时间为12～36h，震荡时间为0.5～1.5h。
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