CN116210524A - 一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种点柄乳牛肝菌[Suillus granulatus(L.)Roussel]仿野生栽培方法，属于食用菌栽培技术领域。包括以下流程：菌种分离与培养；液体菌剂及固体菌剂的制备；黑松育苗；幼苗期接种及栽培管理或大苗大树期接种及栽培管理。本发明筛选出摇菌时间7天的菌种，通过幼苗期接种、大苗大树期接种和栽培管理，实现了幼苗期、大苗大树期产生点柄乳牛肝菌子实体(出菇)，达到了产业化生产的目的。
Description
技术领域
本发明属于一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培技术领域，更具体地说，特别涉及一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法。
背景技术
点柄乳牛肝菌[Suillus granulatus(L.)Roussel]是一种与植物根系形成共生关系才能完成生活史、形成子实体的外生菌根菌。点柄乳牛肝菌在我国分布广泛，其子实体营养丰富、味道鲜美，是我国北方市场需求较大菌根性食用菌资源。据报道，点柄乳牛肝菌含有多糖、麦角固醇、人体必需氨基酸、微量元素等多种生物活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种药用活性，并具有治疗大骨节病的疗效。
由于点柄乳牛肝菌具有以上作用，近年来，其销售价格逐年飙升，导致子实体被过度采挖、野生菌群被严重破坏，致使野生菌的产量已呈逐年减少趋势，不仅制约了菌的商业发展，还影响了松树林的自然生态环境。点柄乳牛肝菌常见于油松林地，主要分布于海拔400-1100米，对以松树为主的森林有重要的生态作用。菌根在土壤结构、植物养分吸收与生长、生物多样性及农业和自然生态系统的生产力等方面具有重要作用。
综上，点柄乳牛肝菌不仅美味、营养丰富，而且具有良好的药用活性，更能与宿主形成菌根结构，促进宿主的生长、减少宿主的病虫害，而且对于维护生态平衡具有重要作用。目前国内对点柄乳牛肝菌的研究主要集中在营养成分、生理活性物质等方面，而关于人工驯化的报道较少，点柄乳牛肝菌菌丝体及子实体生长期的生理活动除与营养条件有关外，还受温度、水分、空气、光线、酸碱度等各种理化因素的影响，目前点柄乳牛肝菌出菇栽培主要存在以下问题：
(1)作为一种外生菌根菌，菌丝离体培养较困难，特别是液体菌种培养时间长、产量低，难以大量生产；
(2)菌根合成的成功率低、菌根侵染率低；
基于以上原因，目前尚无人工成功栽培出菇的先例，随着野生点柄乳牛肝菌的减少，其驯化研究具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明筛选出适合做液体菌种的菌株，摇菌培养时间仅7天；选用高效的培养基配方和固、液联合接种的方式，提高菌根合成的成功率；并通过幼苗期接种、大苗大树期接种和栽培管理，实现了幼苗期、大苗大树期产生点柄乳牛肝菌子实体(出菇)，达到了产业化生产的目的。
一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，包含有以下步骤：
(1)菌种分离与培养
采集点柄乳牛肝菌的新鲜子实体，无菌环境下切取菌柄与菌盖连接处组织，接种到母种培养基进行分离培养，培养好的菌株在液体培养基(中经过继代培养筛选优化后，接入母种培养基，培养后得到母种；
(2)液体菌剂和固体菌剂制备
在上述培养好的母种上切取菌块，接入含有液体培养基的容器内，经过培养即得液体菌种；液体菌种经过滤、粉碎和无菌水稀释制成液体菌剂；
将液体菌剂与固体载体按照质量比1:1混合均匀，制备成固体菌剂，固体载体由活性炭与蛭石按质量比1:1.5混合均匀制成；
(3)接种及栽培管理
黑松幼苗采用先用液体菌剂蘸根，然后栽植时在每棵幼苗根部再接种5g固体菌剂的方法；大树直接采取在树周围挖坑接种固体菌剂的方法接种；接种完成后，做好水肥管理，培养出菇。
所述母种培养基配方为：马铃薯100g，葡萄糖10g，氯化铵0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.02g，三氯化铁0.01g，维生素B1 0.001g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，PH值5-6；
所述液体培养基配方为：葡萄糖10g，马铃薯浸粉6g，氯化铵0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.02g，三氯化铁0.01g，维生素B1 0.001g，蒸馏水1000mL，PH值5-6。
继代培养筛选优化后的菌种的特点：其液体菌种菌球量增大3倍，摇菌培养时间由20天缩短至7天。
液体菌种经过滤、粉碎成0.1mm-0.5mm的菌丝段，用无菌水稀释至液体菌种体积的5倍即可制成液体菌剂。
黑松幼苗接种方法：完整取出黑松幼苗，无菌水清洗根，断根后立即用液体菌剂浸根20min后，栽植到土壤已消毒的苗圃地里。栽植时，在每棵幼苗根部再接种5g固体菌剂。菌根苗的栽植行距为50cm，株距为50cm。做好水肥管理，培养出菇。
大苗大树期接种方法：清理树下的枯枝、杂草，然后挖环形接种圈，其内用杀菌剂灌根，杀灭土壤及根系的杂菌，用灌过杀菌剂的土回填，20天后，再次挖开接种圈，暴露根系并截断，接入固体菌剂，回填封土，浇水，做好水肥管理，培养出菇。
在菌种分离培养后，在液体培养基中经过8代继代培养筛选优化，优化后的菌种更加稳定，优势更明显，活力更强；
固体载体成分简单易得，固体菌剂制作方法简便，在固体载体中使用活性炭，点柄乳牛肝菌的菌丝段恢复生长后，菌丝可侵入活性炭的孔隙结构中，延长了菌根菌的体外生存时间、使菌根菌保持了较高的侵染活性，继而增加了菌根菌与松树根系的接触时间和面积，提高了菌根侵染率；
同时使用固体、液体两种菌剂进行侵染，提高菌根侵染率；一般野外野种外生菌根菌2-3年甚至更长时间出菇，本技术野外大树期接种方法简单易操作、菌根侵染率高，当年可出菇。
附图说明
图1所示为黑松幼苗接种后移栽3年出菇情况；
图2、图3、图4所示为油松大苗期接种当年出菇情况。
具体实施方式：
实例1：点柄乳牛肝菌接种黑松幼苗及仿野生栽培方法
1、2017年8月30日，采集到点柄乳牛肝菌子实体，采取组织分离的方法，无菌环境下切取菌柄与菌盖连接处组织，接种到母种培养基中，26℃温度条件下培养30～35天，得到分离培养的菌株，该菌株经过在液体培养基中经过8代继代培养筛选优化后，摇菌培养时间由20天缩短至7天，将该菌株接种到母种培养基中培养，得母种，4℃保存。
母种培养基配方：马铃薯100g，葡萄糖10g，氯化铵0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.02g，三氯化铁0.01g，维生素B1 0.001g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，PH值5-6。121℃高压灭菌20min。
2、2018年3月15日，选取饱满无病虫害的黑松种子，用0.5％高锰酸钾水溶液消毒后清水浸泡24小时，然后进行种子催芽。2018年3月20日，配制育苗基质(沙子、园土、草炭土体积比为1：1：0.5)，灭菌后装入育苗盘。2018年3月22日，种子露白后播入育苗基质中培养，培育出黑松幼苗。
3、2018年3月25日，活化母种。2018年4月28日，按照配方(葡萄糖10g，马铃薯浸粉6g，氯化铵0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.02g，三氯化铁0.01g维生素B1 0.001g，蒸馏水1000mL，PH值5-6)配制液体培养基，装入500mL三角瓶，每个三角瓶装200mL液体培养基，用带砂芯的硅胶塞封口，外加牛皮纸或报纸包裹，121℃高压灭菌20min。培养基温度降至26℃及以下，接入母种，26℃静置培养2天后摇菌培养，转速为140rpm/min，温度为26℃，时间为7天，培养至其内有大量菌球，液体澄清呈黄褐色，即得液体菌种。
4、2018年5月8日，液体菌种经过滤、无菌水清洗2次后，无菌条件下粉碎成菌丝段在0.1mm-0.5mm的菌悬液，用无菌水将菌悬液稀释至液体菌种体积的5倍，制成液体菌剂。液体菌剂、固体载体按照质量比1:1混合均匀，制备成固体菌剂。固体载体配比(活性炭：蛭石按照质量比1:1.5混合均匀)。
5、2018年5月8日，菌剂制备好后紧接着做黑松幼苗接种出菇试验。
随机选取200株黑松幼苗，其中150株做处理，50株做对照，中间设置10m做隔离带。
处理组：完整取出黑松幼苗，根部用无菌水清洗断根，然后用液体菌剂浸根20min，栽植于已经消毒的苗圃地。栽植时，在每棵幼苗根部再接种5g固体菌剂，培养成菌根苗。菌根苗的栽植行距为50cm，株距为50cm。栽培管理，培养出菇。
对照组：不接种点柄乳牛肝菌菌种为对照，其余处理方法同处理组。
6、试验结果：
处理组：2020年7月8日，有少量点柄乳牛肝菌子实体从松苗下长出，2021年9月8日，长出较多子实体，平均产量为126g/m2。对照组：没有长出点柄乳牛肝菌子实体。点柄乳牛肝菌接种黑松幼苗及仿野生栽培方法成功。
实例2：点柄乳牛肝菌接种油松大苗大树及仿野生栽培方法
1、2021年5月20日-6月30日，按照上述方法制备固体菌剂。
2、在泰安市岱岳区角峪镇先锋村油松种植区内做大苗大树期接种出菇试验。试验地为9年生油松，株间距2×3m。随机选取200株油松做接种试验，其中100株做处理，100株做对照，中间设置20m做隔离带。
处理组：2021年6月11日在试验区先清理树下的枯枝、杂草，然后挖环形接种圈(接种圈离树30-40cm，宽15-20cm，深15-20cm)，其内施用30％恶霉灵水剂稀释500倍灌根，杀灭土壤及根系的杂菌，用灌过杀菌剂的土回填，20天后接入固体菌剂。
2021年7月1日，在消毒区域内重新挖开接种圈，暴露根系并截断，接入固体菌剂(每棵树接入固体菌剂0.5-1.5kg，要使菌剂均匀分布在接种圈内，紧密接触根系)，回填封土，浇水，做好水肥管理培养。
对照组：不接种点柄乳牛肝菌菌种为对照，其余处理方法同处理组。
3、试验结果：2021年9月2日开始出菇，2021年9月8日统计出菇情况：处理组共采收点柄乳牛肝菌子实体240个，对照组采收16个。说明点柄乳牛肝菌接种油松大苗大树及仿野生栽培方法成功。
Claims (7)
1.一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，其特征在于，包含有以下步骤：
(1)菌种分离与培养
采集点柄乳牛肝菌的新鲜子实体，无菌环境下切取菌柄与菌盖连接处组织，接种到母种培养基进行分离培养，培养好的菌株在液体培养基中，经过继代培养筛选优化后，再接入母种培养基，培养后得到母种；
(2)液体菌剂和固体菌剂制备
在上述培养好的母种上切取菌块，接入含有液体培养基的容器内，经过培养即得液体菌种；液体菌种经过滤、粉碎和无菌水稀释制成液体菌剂；
将液体菌剂与固体载体按照质量比1:1混合均匀，制备成固体菌剂，固体载体由活性炭与蛭石按质量比1:1.5混合均匀制成；
(3)接种及栽培管理
黑松幼苗采用先用液体菌剂蘸根，然后栽植时在每棵幼苗根部再接种5g固体菌剂的方法；大树直接采取在树周围挖坑接种固体菌剂的方法接种；接种完成后，做好水肥管理，培养出菇。
2.根据权利要求1所述的一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，其特征在于，所述母种培养基配方为：马铃薯100g，葡萄糖10g，氯化铵0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.02g，三氯化铁0.01g，维生素B1 0.001g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值5-6。
3.根据权利要求1所述的一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，其特征在于，所述液体培养基配方为：葡萄糖10g，马铃薯浸粉6g，氯化铵0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.02g，三氯化铁0.01g，维生素B1 0.001g，蒸馏水1000mL，PH值5-6。
4.根据权利要求1所述的一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，其特征在于，继代培养筛选优化后的菌种的特点，其液体菌种菌球量增大3倍，摇菌培养时间由20天缩短至7天。
5.根据权利要求1所述的一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，其特征在于，液体菌种经过滤、粉碎成0.1mm-0.5mm的菌丝段，用无菌水稀释至液体菌种体积的5倍即可制成液体菌剂。
6.根据权利要求1所述的一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，其特征在于，黑松幼苗接种方法：完整取出黑松幼苗，无菌水清洗根，断根后立即用液体菌剂浸根20min，之后栽植到土壤已消毒的苗圃地里。栽植时，在每棵幼苗根部再接种5g固体菌剂。菌根苗的栽植行距为50cm，株距为50cm。做好水肥管理，培养出菇。
7.根据权利要求1所述的一种点柄乳牛肝菌的仿野生栽培方法，其特征在于，大苗大树期接种方法：清理树下的枯枝、杂草，然后挖环形接种圈，接种圈离树30-40cm，宽15-20cm，深15-20cm，其内用杀菌剂灌根，杀灭土壤及根系的杂菌，用灌过杀菌剂的土回填；20天后，再次挖开接种圈，暴露根系并截断，每棵树接入固体菌剂0.5-1.5kg，要使菌剂均匀分布在接种圈内，紧密接触根系，回填封土，浇水，做好水肥管理，培养出菇。
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