CN107142211B - 一种杀根结线虫的桔绿木霉Snef1910及代谢产物及应用 - Google Patents

一种杀根结线虫的桔绿木霉Snef1910及代谢产物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有杀根结线虫活性的桔绿木霉Snef1910及代谢产物及应用，所述桔绿木霉Snef 1910的分类命名为桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13569，保藏日期为2017年3月10日。该桔绿木霉Snef1910可以制成用于杀死根结线虫的生防菌剂，可以有效防治农作物的根结线虫伤害，效果显著，且能够改善土壤微环境，同时能够促进植物生长，在防治农作物根结线虫伤害方面具有良好的应用前景。

Description

一种杀根结线虫的桔绿木霉Snef1910及代谢产物及应用
技术领域
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种杀根结线虫的桔绿木霉Snef1910及代谢产物及应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。由于设施农业生产中连作障碍、致害成灾现象较为普遍，根结线虫病害为害的问题日益严重，对农作物造成很大的产量损失，严重时甚至绝收。
根结线虫的防治方法主要有化学药剂防治法和微生物防治法，化学药剂防治法主要是采用阿维菌素、福气多等化学农药，这种方法虽然有效，但是对土壤和农作物伤害较大，不利于长期使用。微生物防治法主要是利用微生物对根结线虫的毒杀作用，对植物和环境的影响较小，是现代农药的主要发展方向。
然而目前市面上缺少既可以防治这种病害、又对环境没有危害的生防菌剂。再者，现有技术实施的本质是微生物以及对土壤微生物成分的持续改善作用，这种生物农药市面上则更加稀少，亟待研发。
为了在防治根结线虫病害的同时改善土壤微环境，我们有必要开发一种可以有效防治根结线虫的新功能菌株及生防菌剂，旨在减少根结线虫病害给农业生产带来的损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种杀根结线虫的桔绿木霉Snef1910及代谢产物及应用，该桔绿木霉Snef1910经发酵培养后的代谢产物对农作物进行灌根处理后，能够抑制农作物根结线虫的危害，在制备杀死根结线虫的生防菌剂中具有良好的应用前景。
本发明的第一个目的是提供一种具有杀根结线虫活性的桔绿木霉Snef1910，所述桔绿木霉Snef 1910的分类命名为桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13569，保藏日期为2017年3月10日。
本发明的第二个目的是提供一种由所述的桔绿木霉Snef1910在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种由所述的桔绿木霉Snef1910制备成的杀根结线虫的代谢产物。
本发明的第四个目的是提供一种由所述的杀根结线虫代谢产物在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种所述的杀根结线虫代谢产物的制备方法，将桔绿木霉Snef1910的试管菌种活化后，接种至PD液体发酵培养基中进行种子培养，然后将得到的种子液接种于PD液体发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养5d后，得到杀根结线虫真菌代谢产物；
每升所述PD液体发酵培养基的配方为：马铃薯洗净去皮，切成1cm×1cm×1cm小块，称取200g，煮沸半小时，四层纱布过滤取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌30min，自然pH。
优选的，上述制备方法中，所述种子培养的条件为：25～28℃，120～150r/min摇床发酵5d。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种具有杀根结线虫活性的桔绿木霉Snef1910，可以制成用于杀死根结线虫的生物防治菌剂，可以有效防治农作物的根结线虫伤害，效果显著，且能够改善土壤微环境，同时能够促进植物生长，在防治农作物根结线虫伤害方面具有良好的应用前景。
生物材料保藏信息说明
1、桔绿木霉Snef1910，已于2017年3月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.13569，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)。
附图说明
图1为本发明中桔绿木霉Snef1910的菌落形态图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。
本发明提供了一种具有杀根结线虫的桔绿木霉Snef1910，下面结合相关实验数据，说明本发明桔绿木霉Snef1910的菌落形态、基因结构特征以及其杀线虫活性。
一、菌落形态特征
桔绿木霉Snef1910的菌落形态如图1所示。
在PDA固体培养基上黑暗条件下培养72h，菌落半径为82～90mm。在PDA上，大多数菌株的菌落表面产生分生孢子处没有游离的气生菌丝，多数情况下菌落边缘部位会形成宽的分生孢子带，分生孢子黄绿色至深绿色，有时候产生黄色色素。
所述桔绿木霉Snef1910的培养条件如下：
斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基(1L)配方：马铃薯洗净去皮，切成1cm×1cm×1cm小丁，称取200g，煮沸半小时，四层纱布过滤取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，再加入17-20g琼脂，最后蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌30min，自然pH。
斜面培养方法：27℃培养4d。
二、基因结构特征
对所述桔绿木霉Snef1910的ITS序列进行PCR扩增及测序，结果如下：CGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCTAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA。
将测得的上述ITS序列于NCBI中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行同源性搜索比对，并使用BLASTN 2.2.31系统在GenBank中进行同源性搜索，发现序列相似度最高的为Trichoderma citrinoviride菌株，序列相似度为100％，表明该菌株属于桔绿木霉。
三、本发明还提供了一种利用桔绿木霉Snef1910制备杀根结线虫代谢产物的方法。
该方法具体如下：将桔绿木霉Snef1910的试管菌种活化后，接种至250mL三角瓶(每瓶装150mLPD液体发酵培养基)中进行种子培养，所述种子培养的条件为：25～28℃，120～150r/min摇床发酵5d；然后将得到的种子液接种于30L发酵罐的PD液体发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养5d后，得到杀根结线虫代谢产物。
每升所述马铃薯葡萄糖(PD)液体发酵培养基的配方为：马铃薯洗净去皮，切成1cm×1cm×1cm小块，称取200g，煮沸半小时，四层纱布过滤取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌30min，自然pH。
四、桔绿木霉Snef1910制备成的代谢产物的杀根结线虫活性实验
1、制备试验制剂
将上述“三”中制备的杀根结线虫代谢产物，通过12000r/min离心15min除去孢子与菌丝体，收集上清液，得到处理后发酵液，备用。
2、供试根结线虫
采自辽宁省铁岭市李千户镇营盘村大棚发病严重的番茄根系，经鉴定为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，用镊子挑取饱满成熟的卵囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5％NaClO消毒3min，并无菌水冲洗3次，从中挑取完整且饱满的卵囊，置入盛有适量无菌水的灭菌培养皿中，将其放入28℃的恒温箱中培养，3d后将孵化出的二龄幼虫J2接种到温室内易感病的番茄根部进行扩繁。将扩繁获得的卵囊采用浅盘法孵化出J2，制备成根结线虫悬浮液50条/50μL。
3、室内杀根结线虫活性实验
将950μL的处理后发酵液分别加入到不同的1mL贝式小皿中，并且每个里加入50条J2(50μL线虫悬浮液)，以PD液体培养基、清水分别作为对照，重复3次试验。分别在24h、48h、96h观察根结线虫死亡情况，计算校正死亡率，采用NaClO刺激法来判断根结线虫的死活。实验结果如表1所示：
由表1可知，本发明在室内杀线虫活性试验中，桔绿木霉Snef 1910的处理后发酵液在24h、48h、72h的校正死亡率分别达到了86.0％、96.0％和100％；而PD液体培养基对照在24h、48h、72h的校正死亡率只有0、0.7％和0.8％，相对于清水对照来讲，差异不显著；但相对桔绿木霉Snef 1910来讲，桔绿木霉Snef 1910的校正死亡率高，具有显著性差异。
表1室内杀根结线虫活性试验
Figure BDA0001291753870000071
4、抑制南方根结线虫卵囊孵化试验
(1)供试卵囊
采自辽宁省铁岭市李千户镇营盘村大棚发病严重的番茄根系，经鉴定为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，用镊子挑取饱满成熟的卵囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5％NaClO消毒3min，并无菌水冲洗3次，从中挑取完整且饱满的卵囊，置入自制孵化池中备用。
(2)试验方法
取新鲜饱满大小均一的消毒卵囊，每2个消毒卵囊放入一个消毒孵化池中，再向每个孵化池里加入处理后发酵液1mL，以PD液体培养基、清水分别作为对照，重复3次试验。将放有卵囊的培养皿置于25℃的恒温箱中，7d后计数南方根结线虫孵化总数，计算孵化相对抑制率。
(3)试验结果
本发明在室内抑制南方根结线虫卵囊孵化试验结果如表2所示，桔绿木霉Snef1910的处理后发酵液7d后对卵孵化的相对抑制率高达69％以上。而PD液体培养基对照的相对抑制率只有近2％，处理后发酵液对南方根结线虫卵囊孵化效果显著。
表2抑制南方根结线虫卵囊孵化试验7d试验观察后结果
Figure BDA0001291753870000081
5、防治南方根结线虫田间防效试验
本试验分别在辽宁省铁岭市李千户镇和辽宁省绥中县大王庙黄家村温室大棚进行田间防效试验。将制备好的菌株发酵原液，稀释50倍灌根施用，每棵番茄苗的根部灌200mL发酵液，覆土，当天禁止浇水；移苗完毕时隔20d、40d再以同样的方法进行2次菌株发酵液灌根处理即可。试验结果表明：可以促进植株生长，对根结线虫病起到很好的抑制作用；与此同时，还起到增加田间产量的作用，杀根结线虫效果比较稳定，取得很好的防治效果。
(1)制备试验制剂
按前述液体发酵培养方法制备桔绿木霉Snef 1910的杀根结线虫代谢产物，待备用。
(2)试验方法
本试验分别在辽宁省铁岭市李千户镇营盘村和辽宁省绥中县大王庙黄家村日光温室大棚进行田间防效试验，两处温室大棚根结线虫均很严重，主栽作物番茄和黄瓜等蔬菜。番茄苗为工厂化育苗，待番茄植株生长至四叶期时移栽到试验大棚中，完全随机种植。在移苗当天，将制备好的杀根结线虫代谢产物，稀释50倍灌根施用，每棵番茄苗的根部灌200mL杀根结线虫代谢产物，覆土，当天禁止浇水；移苗完毕时隔20d、40d再以同样的方法进行2次菌株发酵液灌根处理即可。以未经过灌根的番茄苗和PD液体培养基灌根的番茄苗为对照，在移栽后45d进行调查，将番茄植株连根挖出，保持根系完整，观察番茄的生长效果。
(3)试验结果
田间试验结果显示：对田间番茄具有明显的促生长作用，经过桔绿木霉Snef1910代谢产物处理的番茄苗的根系更加发达，且田间番茄根结线虫病的防效高达76％以上。
上述实验表明，本发明提供的一种的桔绿木霉Snef 1910可以有效防治农作物的根结线虫伤害，效果显著，同时能够促进植物生长，在防治农作物根结线虫伤害方面具有良好的应用前景，可以制成用于杀死根结线虫的生物防治菌剂。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Figure IDA0001354926050000011

Claims (6)

1.一种杀根结线虫的桔绿木霉（Trichoderma citrinoviride）Snef 1910，其特征在于，所述桔绿木霉Snef 1910的保藏编号为CGMCC No. 13569，保藏日期为2017年3月10日。
2.一种权利要求1所述的桔绿木霉Snef 1910在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
3.一种含有权利要求1所述桔绿木霉Snef 1910的杀根结线虫的发酵液。
4.一种权利要求3所述的发酵液在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
5.根据权利要求3所述的发酵液的制备方法，其特征在于，将桔绿木霉Snef 1910的试管菌种活化后，接种至PD液体发酵培养基中进行种子培养，然后将得到的种子液接种于PD液体发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养5d后，得到所述发酵液；
每升所述PD液体发酵培养基的配方为：马铃薯洗净去皮，切成1 cm×1 cm×1 cm小块，称取200 g，煮沸半小时，四层纱布过滤取汁，加入20.0 g 葡萄糖，完全溶解后，加蒸馏水定容至1000 mL，121℃灭菌30 min，自然pH。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养的条件为：25～28℃，120～150 r/min摇床发酵5d。
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