CN104928192A - 一株绿色木霉菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株绿色木霉菌株及其应用，属于微生物生防防治技术领域。本发明的绿色木霉 (Trichoderma viride)210NKNMM菌株，于2014年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9779。本发明的木霉(Trichoderma viride)210NKNMM菌株在制备防治植物根结线虫制剂中的应用。本发明有益效果在于：绿色木霉(Trichoderma viride)210NKNMM菌株能有效防治植物寄生线虫，能在制备防治植物根结线虫制剂中应用，菌株的培养物对植物根结线虫的防治效果大于60%。
Description
技术领域
本发明涉及一株绿色木霉菌株及其应用，属于微生物生防防治技术领域。
背景技术
植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类就达70多种，为害3000多种植物，每年造成巨大的损失。我国植物寄生线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等经济作物，造成的损失十分惊人。据全国烟草病虫害防治信息中心不完全统计，2000年全国仅烟草根结线虫发病面积已达50万公顷，直接经济损失5亿多元。仅云南省发病面积就达2.7万公顷，直接经济损失约1亿元，间接损失更为严重。黑龙江省仅大豆胞囊线虫每年造成的损失达8亿元之多。松材线虫被称为无烟森林火灾，在江苏、浙江、广东、山东、安徽、湖北、上海、台湾、香港等部份地区严重发生，有向全国漫延的趋势。在山东、广东、海南和云南等蔬菜主产区，蔬菜根结线虫呈上升趋势。贵州省西洋参因严重发生根结线虫而只好停产。更严重的是由于根结线虫侵染后造成作物伤口，致使作物根部病害严重发生。据不完全统计，线虫病害使我国各种作物年平均产量损失达10-15％，全球每年因线虫造成的损失达1000亿美元（Weischer，1994）。
目前线虫的防治主要依靠化学杀线虫剂，但化学杀线虫剂多为灭生性巨毒农药，不仅产生抗药性，更造成环境污染，危害人体健康。相继有不少被禁用或即将禁用。美国溴甲烷于2000年、二溴甲烷于2005年分别停止使用。目前生产上大量使用的铁灭克虽然对线虫有很好的防效，但毒性高，破坏土壤微生物区系。化学杀线虫剂在防治线虫危害，保障农业生产的同时，给人类健康和环境带来了严重的负面影响。由于农药残留超标，我国对外出口的茶叶、三七、鸭梨、哈密瓜、果汁、花卉、蜂蜜及多种畜禽产品屡屡发生商品退赔事件，直接影响农产品出口。同时目前国内使用的化学杀线虫剂主要为国外进口产品，价格过于昂贵。因此，研制开发线虫生防制剂显得尤为重要。
线虫生防制剂早在上个世纪70年代就已上市。但经过几十年的发展，到今天其使用和推广仍不广泛，包括中国在内的很多国家仍未使用。许多在室内试验中对线虫表现出很强侵染能力的菌株在实际应用中的效果不理想。在田间试验中，生防菌的防治效果会受各种因素的影响。土壤环境(有机质含量、湿度、温度等)对生防菌剂在土壤中的存活、定殖、扩散等有重要的影响。此外，土壤中残留的化学农药，土壤中存在的一些金属离子都会影响生防菌剂在土壤中的存活、定殖以及对线虫的防治效果。
生防菌株是研究生防菌剂的一个重要前提。不同菌株的生物学特性，对线虫的防治效果差异较大。自然界中，线虫的天敌是很多的，主要有：真菌、细菌、螨、捕食性线虫等。其中最多的是真菌，目前研究最多且成为产品上市的也主要是真菌。根据其侵染线虫的特性主要分为：
1、捕食菌物：通过营养菌丝特化形成的捕食器捕捉线虫；
2、寄生菌物：通过寄生线虫的卵、雌虫、胞囊等的菌物；
3、产毒菌物：能够产生毒素毒杀线虫的菌物。
目前成为产品进入市场的主要是食线虫菌物，包括捕食菌物和寄生菌物。迄今国内外已报道的的食线虫菌物约有400种，其中捕食线虫菌物约有12个属，常见的有轮虫霉属、节丛孢属、单顶孢属和隔孢属等。内寄生线虫菌物有关属约有13个，常见的有毒虫霉属、钩丝孢属和被毛孢等。机会菌物约200种，确定的属大约有71个，研究较多的的有节丛孢属、隔指孢属、绿僵菌属、拟青霉属、普可尼亚属和木霉属等。产毒菌物主要有丝霉属和侧耳属。
木霉菌是一种广谱性拮抗菌，能够拮抗多种病原真菌。据不完全资料统计，木霉菌至少对18个属29个种病原真菌在体外或体内表现有拮抗作用(徐同，1993)。木霉菌对土传真菌有显著的拮抗效果，研究比较多的是利用木霉菌防治立枯丝核菌(Rhizoczonia solai)、腐霉菌(Pythium spp.)、疫霉菌(Phytophthora)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、镰刀菌(Fusarium spp.)。此外，木霉菌还可以用于叶面、花器和果实的保护，木霉菌也可用于防治蔬菜病害。国外还有木霉菌防治线虫的报道，如windham等(1989)用哈茨木霉T-12和康氏木霉T-8处理土壤，土壤中根结线虫的卵减少了47%和53%。Siddiqul(2001)等用绿色木霉、哈茨木霉、哈氏木霉、康氏木霉和拟康氏木霉防治爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)，张树武(2013)用长枝木霉防治南方根结线虫(Meloidogyne incoginta)，发现木霉的发酵液能明显地降低卵的孵化率，木霉孢子能寄生卵和二龄幼虫。迄今为止，木霉对根结线虫的作用主要表现为对卵和二龄幼虫的寄生以及对二龄幼虫的抑制作用，能直接杀灭根结虫的木霉菌株还未见公开文献的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有生防技术菌株之不足，提供一株能杀灭植物根结线虫的绿色木霉菌株及其应用。
本发明用常规方法从自然界中进行菌株分离、培养、获得绿色木霉 (Trichoderma viride) 210NKNMM，该菌株2014年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9779。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明菌株的培养物对植物根结线虫的杀灭作用超过60%，对植物根结线虫的防治效果大于60%。
本发明通过以下方式实现：
一、 菌株的获得：
本发明的菌株按微生物土壤分离的常规普通方法进行涂布分布，挑取单菌落，进行纯化培养获得，采用的培养基为PDA培养，经真菌ITS鉴定为Trichoderma viride，定名为210NKNMM；
形态： 在PDA培养基上，气生菌丝茂盛，菌落无明显的环纹出现，产孢区最终覆盖整个平板，30℃ 培养72h直径达13.2cm。分生孢子簇排列致密，不产生扩散性色素，没有明显气味。分生孢子梗直接产生瓶梗或产生二级分枝,距离顶端距离越大分枝越长。分生孢子梗主轴宽度约3μm。可育分枝的顶端为2-5个涡状排列的瓶梗。在PDA上可观察到瓶梗层出现象。瓶梗直或弯曲，窄烧瓶形或中部明显膨大，间生瓶梗不常见。瓶梗大小(5-9) μm×(2.2-4)μm。分生孢子椭圆形，深绿色，壁光滑。直径大小(4-6)μm×(3.2-4)μm。
二、210NKNMM菌株的培养：
首先，按常规平板培养方法培养210NKNMM菌株，在无菌条件下收集平板上培养已产生的孢子；然后，按常规液体培养方法培养210NKNMM菌株液体种。将孢子接种到预先灭菌并含有玻璃珠的液体PDA培养基中，28℃145rpm/min培养2-3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；最后，按常规液体发酵方法培养210NKNMM菌株。将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养4-7天，线虫生测达到最大杀虫效果是时，即为210NKNMM有效培养物，停止发酵。
三、210NKNMM对植物根结线虫的防治效果测定：
取出含有大量卵囊番茄根系，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在 0.5％次氯酸钠中消毒3 min，再用无菌水冲洗3次，把卵囊放在内有少量无菌水的培养皿里，25℃恒温箱中培养，24h后收集一次新孵化的二龄幼虫备用。
将有效培养物加入32孔的培养板中，每孔加入100μl有效培养物，分别向处理和对照中各加入新孵化的根结线虫二龄幼虫，每孔50条。放入25℃培养箱中，10min、60min后调查击倒率，12h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率。
本发明有益效果在于：绿色木霉 (Trichoderma viride) 210NKNMM菌株能有效防治植物寄生线虫，能在制备防治植物根结线虫制剂中应用，菌株的培养物对植物根结线虫的防治效果大于60%。
具体实施方式
实施例的发明内容法同发明内容部分的描述。下面通过实施例对本发明作详细的说明。
实例一：
1.用PDA平板培养210NKNMM菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养4天；
5. 线虫常规生测60min后，线虫致死率达到60%，停止发酵，即为210NKNMM有效培养物。
实例二：
1.用PDA平板培养210NKNMM菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养5天；
5. 线虫常规生测60min后，线虫致死率达到75%，停止发酵，即为210NKNMM有效培养物。
实例三：
1.用PDA平板培养210NKNMM菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养7天；
5. 线虫常规生测60min后，线虫致死率达到95%，停止发酵，即为210NKNMM有效培养物。
实例四：
1.用PDA平板培养210NKNMM菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养7天；
5. 线虫常规生测60min后，线虫致死率达到90%，停止发酵，即为210NKNMM有效培养物。
实例五：
1.用PDA平板培养210NKNMM菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养7天；
5. 线虫常规生测60min后，线虫致死率达到85%，停止发酵，即为210NKNMM有效培养物。
实例六：田间试验结果
将210NKNMM有效培养物分别在云南省陆良县大棚蕃茄和玉溪烟草种植地进行田间试验，结果如下：
210NKNMM有效培养物田间使用对根结线虫的防治效果
结果表明：210NKNMM有效培养物作用后作物的病株率/%、根结百分率/%都低于空白对照、阿魏菌素和呋喃丹，平均防效高于阿魏菌素和化学呋喃丹。用本发明在田间防治作物根结线虫，有较好的防治效果。
Claims (2)
1.一株绿色木霉 (Trichoderma viride) 210NKNMM菌株，保藏号：CGMCCNo.9779。
2.权利1所述绿色木霉 (Trichoderma viride) 210NKNMM菌株在制备防治植物根结线虫制剂中的应用。
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