CN107118978B - 一株植物内生真菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株植物内生真菌，属微生物农药技术领域。本发明通过常规的方法从自然界水生植物中进行菌株分离、培养，获得一株能使土壤植物寄生线虫致死的黑曲霉(Aspergillus niger)E34菌株，E34菌株已于2016年7月保藏于武汉中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC11339。
Description
技术领域
本发明涉及一株能防治植物寄生线虫的水生植物内生真菌菌株，属微生物农药技术领域。
背景技术
植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类就达70多种，为害3000多种植物，每年造成巨大的损失。我国植物寄生线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等经济作物，造成的损失十分惊人。据全国烟草病虫害防治信息中心不完全统计，2000年全国仅烟草根结线虫发病面积已达50万公顷，直接经济损失5亿多元。仅云南省发病面积就达2.7万公顷，直接经济损失约1亿元，间接损失更为严重。黑龙江省仅大豆胞囊线虫每年造成的损失达8亿元之多。松材线虫被称为无烟森林火灾，在江苏、浙江、广东、山东、安徽、湖北、上海、台湾、香港等部份地区严重发生，有向全国漫延的趋势。在山东、广东、海南和云南等蔬菜主产区，蔬菜根结线虫呈上升趋势。贵州省西洋参因严重发生根结线虫而只好停产。更严重的是由于根结线虫侵染后造成作物伤口，致使作物根部病害严重发生。据不完全统计，线虫病害使我国各种作物年平均产量损失达10-15％，全球每年因线虫造成的损失达1000亿美元（Weischer,1994）。
目前线虫的防治主要依靠化学杀线虫剂，但化学杀线虫剂多为灭生性巨毒农药，不仅产生抗药性，更造成环境污染，危害人体健康。相继有不少被禁用或即将禁用。美国溴甲烷于2000年、二溴甲烷于2005年分别停止使用。目前生产上大量使用的铁灭克虽然对线虫有很好的防效，但毒性高，破坏土壤微生物区系。化学杀线虫剂在防治线虫危害，保障农业生产的同时，给人类健康和环境带来了严重的负面影响。由于农药残留超标，我国对外出口的茶叶、三七、鸭梨、哈密瓜、果汁、花卉、蜂蜜及多种畜禽产品屡屡发生商品退赔事件，直接影响农产品出口。同时目前国内使用的化学杀线虫剂主要为国外进口产品，价格过于昂贵。因此，研制开发线虫生防制剂显得尤为重要。
线虫生防制剂早在上个世纪70年代就已上市。但经过几十年的发展，到今天其使用和推广仍不广泛，包括中国在内的很多国家仍未使用。许多在室内试验中对线虫表现出很强侵染能力的菌株在实际应用中的效果不理想。在田间试验中，生防菌的防治效果会受各种因素的影响。土壤环境(有机质含量、湿度、温度等)对生防菌剂在土壤中的存活、定殖、扩散等有重要的影响。此外，土壤中残留的化学农药，土壤中存在的一些金属离子都会影响生防菌剂在土壤中的存活、定殖以及对线虫的防治效果。
生防菌株是研究生防菌剂的一个重要前提。不同菌株的生物学特性，对线虫的防治效果差异较大。自然界中，线虫的天敌是很多的，主要有：真菌、细菌、螨、捕食性线虫等。其中最多的是真菌，目前研究最多且成为产品上市的也主要是真菌。根据其侵染线虫的特性主要分为：
1、捕食菌物：通过营养菌丝特化形成的捕食器捕捉线虫；
2、寄生菌物：通过寄生线虫的卵、雌虫、胞囊等的菌物；
3、产毒菌物：能够产生毒素毒杀线虫的菌物。
目前成为产品进入市场的主要是食线虫菌物，包括捕食菌物和寄生菌物。迄今国内外已报道的的食线虫菌物约有400种，其中捕食线虫菌物约有12个属，常见的有轮虫霉属、节丛孢属、单顶孢属和隔孢属等。内寄生线虫菌物有关属约有13个，常见的有毒虫霉属、钩丝孢属和被毛孢等。机会菌物约200种，确定的属大约有71个，研究较多的的有节丛孢属、隔指孢属、绿僵菌属、拟青霉属、普可尼亚属和木霉属等。产毒菌物主要有丝霉属和侧耳属。迄今为止，能杀灭植物寄生线虫的水生黑曲霉菌株还未见文献报到。
微生物菌株对植物寄生线虫的作用，一方面通过菌株自身生长对线虫直接发生作用，这就是简称的“一代产品”，作用的主体是微生物菌体或细胞，没有菌体或细胞的参与，就不表现出微生物对线虫的抑制或杀灭作用；另一面通过菌株生长产生的代谢产物对植物寄生线虫发生作用，这就是简称的“二代产品”，作用的主体是微生物产生的代谢产物，通过代谢产物间接抑制或杀死线虫。代谢产物具有抗环境能力强、使用方便、作用快速等“一代产品”不具备的优势。由黑曲霉产生、能作用植物寄生线虫的代谢产物目前发现的多为草酸、柠檬酸等有机酸和曲霉毒素，而黑曲霉不产生曲霉毒素，通过草酸、柠檬酸对植物寄生线虫的作用多为抑制作用，作用的对象是二龄幼虫或虫卵，同时对两者起作用的黑曲霉菌株代谢产物较少或作用不强，能同时作用于线虫的卵、幼虫并能有效杀死线虫的黑曲霉菌株代谢产物和菌株，特别是水生环境的菌株除了发明人申请的专利还未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有生防技术菌株之不足，提供一株能杀灭植物根结线虫的生防菌株。本发明的菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：黑曲霉（Aspergillusniger）E34，保藏编号为：CGMCC No.11339，保藏日期为2015年9月10日。
本发明的菌株来源于自然土壤环境，其培养物对植物根结线虫的杀灭作用超过60%，对植物根结线虫的防治效果大于60%。
本发明的菌株与发明人申请的其它黑曲霉专利的菌株不同，属于分类学上的同种但是不同的菌株。
本发明的特点：E34菌株能对线虫的卵、幼虫都有致死作用，其致死率优于其它菌株。其致死成分除菌体外还有水溶性和脂溶性成分，不同于其它曲霉菌株的草酸或柠檬酸。
本发明通过以下方式实现：
一、 菌株的获得：
本发明的菌株按微生物土壤分离的常规普通方法进行涂布分布，挑取单菌落，进行纯化培养获得，采用的培养基为PDA培养，经真菌ITS鉴定为Aspergillus niger，定名为E34；
形态： 菌丝发达，蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状,多分枝，有多核，顶囊大球形，小梗双层。菌丛呈黑褐色。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出；分生孢子头状如“菊花”。
二、E34菌株的培养：
首先，无菌收集平板上培养好已产生的孢子，将孢子接种到预先灭菌并含有玻璃珠的液体PDA培养基中，28℃145rpm/min培养2-3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子。然后，将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算。28℃145rpm/min培养4-7天，线虫生测后达到最大杀虫效果是时，即为E34有效培养物。
三、E34对植物根结线虫的防治效果测定：
取出含有大量卵囊番茄根系，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在 0.5％次氯酸钠中消毒3 min，再用无菌水冲洗3次，把卵囊放在内有少量无菌水的培养皿里，25℃恒温箱中培养，24h后收集一次新孵化的二龄幼虫备用。
将有效培养物加入32孔的培养板中，每孔加入100μl有效培养物，分别向处理和对照中各加入新孵化的根结线虫二龄幼虫，每孔50条。放入25℃培养箱中，60min、120min后调查击倒率，12h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率。
具体实施方式
实施例的发明内容法同发明内容部分的描述。下面通过实施例对本发明作详细的说明。
实例一：
1.用PDA平板培养E34菌株，待平板上长出黑色孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的黑色孢子，将黑色孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养3天；
5. 用常规线虫生测方法进行生测120min后，线虫致死率达到60%，停止发酵，即为E34有效培养物。
实例二：
1.用PDA平板培养E34菌株，待平板上长出黑色孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的黑色孢子，将黑色孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养5天；
5. 用常规线虫生测方法进行生测120min后，线虫致死率达到75%，停止发酵，即为E34有效培养物。
实例三：
1.用PDA平板培养E34菌株，待平板上长出黑色孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的黑色孢子，将黑色孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养6天；
5. 线虫常规生测120min后，线虫致死率达到87%，停止发酵，即为E34有效培养物。
实例四：
1.用PDA平板培养E34菌株，待平板上长出黑色孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的黑色孢子，将黑色孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养7天；
5. 用常规线虫生测方法进行生测120min后，线虫致死率达到94%，停止发酵，即为E34有效培养物。
实例五：
1.用PDA平板培养E34菌株，待平板上长出黑色孢子时，取出备用；
2.在无菌条件下收集平板上的黑色孢子，将黑色孢子接入含有玻璃珠的PDA液体培养中，28℃145rpm/min培养；
3. 培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为液体种子；
4. 将长好的液体种子无菌接入预先灭菌的液体PDA培养基中，接入量按新培养基装液量的10%计算，28℃145rpm/min培养7天；
5. 用常规线虫生测方法进行生测120min后，线虫致死率达到84%，停止发酵，即为E34有效培养物。
实例六：田间试验结果
将E34有效培养物分别在云南省陆良县大棚蕃茄和玉溪烟草种植地进行田间试验，结果如下：
E34有效培养物田间使用对根结线虫的防治效果
结果表明：E34有效培养物作用后作物的病株率19%、根结百分率16%都低于空白对照、阿魏菌素和呋喃丹，平均防效高于阿魏菌素和化学呋喃丹。用本发明在田间防治作物根结线虫，有较好的防治效果。
Claims (1)
1.一株植物内生真菌，其特征在于：该菌株分离自云南省大理市洱海自然生态水生环境，经分类鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)—E34，该菌株2015年9月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC11339。
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