CN103013853A - 防治魔芋软腐病的生防菌株kmxu22及其生防菌剂 - Google Patents
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Abstract
防治魔芋软腐病的生防菌株KMXU22及其生防菌剂，属生物农药技术领域。本发明的菌株KMXU22的保藏号为CGMCC NO. 6597。菌剂经如下步骤得到：菌株KMXY22移植到试管一环活化，32 ℃ 培养48小时，试管中的LB液体培养基为：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0；活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方同a.的LB培养液中，120转/min、32 ℃下培养72小时，获得发酵菌液； 将发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中的LB培养液中，温度32℃，发酵18-20小时后获得发酵种子菌种； 将发酵种子菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中，温度为32℃，发酵72-96小时，当菌含量大于2×1010～2×1011 CFU/ml以上，酸碱度为7.0～7.6时，储存作为生防菌剂。本发明成本低，无毒害及污染，生防效果佳。
Description
技术领域：
本发明涉及一种防治魔芋软腐病的生防菌株KMXY22及其生防菌剂，属生物农药技术领域。
背景技术：
魔芋（Amorphophallus konjac）是多年生草本植物，也是世界上迄今为止发现的唯一高含葡苷聚糖（konjac glucomannan，KGM）的特种经济作物（刘佩英，2004）。因其具有独特理化性质和凝胶复配等功能，目前魔芋产品被广泛用于食品、保健、化工、医药、环保等领域，并被WHO评为十大保健食品之一。此外，魔芋还能作为再生性资源，能有效替代其他植物胶，缓解资源压力。 全球魔芋适种地区主要分布在亚洲和非洲，人工规模化种植主要是日本和中国。日本因土地、劳动力资源有限等原因，近年来魔芋产业开始严重萎缩，而中国已成为世界魔芋原料生产与供给中心，占全球的60%，且种植规模有进一步扩大趋势。目前我国魔芋种植面积约为150万亩，根据中国园艺学会魔芋协会预计，我国魔芋最适种植面积在300万亩以上，产业发展潜力巨大。
细菌性软腐病(BSR)是魔芋生产上极易发生的重要病害，时常给魔芋种植业带来毁灭性的灾害，从种植到储藏都易发病，我国以云南、四川、重庆、湖北等魔芋主产地危害较为严重，国外，以日本发病比较严重。同时，该病还能危害多种蔬菜如白菜、生菜等，常造成重大的经济损失。魔芋种植基地平均病株率25%以上，减产达30-80%。严重时部分田块基本绝收，严重挫伤了农民种植魔芋的积极性。目前在魔芋生产上尚未培育出有效的抗病品种，也无防治该病的特效药剂，导致该病近几年频繁暴发，严重制约着魔芋产业的发展 (崔鸣等，2009)。已有报道表明，引起我国魔芋软腐病菌魔芋的病原为胡萝卜软腐果胶杆菌 (欧文氏菌) 胡萝卜软腐亚种Pectobacterium（Erwinia） carotovora subsp.carotovora（Pcc，又称Ecc）和菊欧文氏菌Erwinia chrysantherni（Ech），以Pcc 为优势种群，占80%以上（修建华等，2006；李晓红，2009）。众多研究结果表明软腐病菌不能直接侵染魔芋球茎，但会侵染芽鞘、根和伤口；扫描电镜观察发现球茎表面无气孔也无皮孔，另外，感病芽鞘气孔周围没有病原菌聚集，表明魔芋软腐病菌侵染途径与马铃薯软腐病从皮孔侵入不同，且不能从气孔侵入（吴金平，2010）。
化学农业对农田生态系统的严重破坏，病原菌对药剂的抗性也越来越明显，同时化 学农药不易降解，高残留，对人畜不安全等都严重限制了将来在农业生产上的应用，特别是魔芋这一类高附加值的特种经济作物，目前魔芋产品已经被广泛用于食品、保健、化工、医药、环保等领域。因此，非化学类防治措施目前逐渐成为防治魔芋软腐病及土传病害的核心方式，而生物防治则为最有前途的方法。荧光假单胞菌（Psdeuomnoda fluorescens) 在植物病害防治方面，国内外均有一些报道，其一方面能够作物植物促生长菌剂，增强作物抗病性；另一方面能够作为生防菌剂，防治作物病害。本发明利用健康魔芋内生的荧光假单胞菌（P. fluorescens) 防治魔芋软腐病，国内外尚未见报道与利用。
参考文献：
[1] 刘佩英. 魔芋学[M]. 中国农业出版社, 2004.
[2] 崔鸣, 李川. 魔芋软腐病的发生规律及防治技术研究进展. 中国植保导刊, 2009, 29(6):33-35.
[3] 修建华, 姬广海, 王敏, 等. 魔芋软腐病菌分子鉴定与遗传多样性. 微生物学报, 2006, 46(4): 522-525．
[4] 李晓红. 魔芋软腐病菌致病性测定及遗传多样性分析. 华中农业大学硕士学位论文, 2009.
[5] 吴金平. 魔芋软腐病病原菌及其拮抗菌的研究. 武汉大学博士学位论文, 2010.
发明内容：
本发明的目的在于针对目前农业生产中魔芋软腐病防治难度大、成本高，不宜使用化学农药和农药残留高的问题，而提供一种防治魔芋软腐病的生防菌株KMXY22及其生防菌剂。
本发明从健康魔芋植株中分离得到了分离了一株具有防治魔芋软腐病的菌株KMXY22，对其鉴定结果表明该细菌属于荧光假单孢菌，该菌株命名为荧光假单孢菌（Psdeuomnoda fluorescens) KMXY22。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国. 北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2012年9月21日；保藏号为CGMCC NO. 6597。
本发明的菌体特征及菌落特征：菌株为杆状，大小为0.4μm~0.7μm×1.0μm ~1.2μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。在KB培养基上培养 24h后形成 1.2mm 菌落，菌落产生橙色或褐黄色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易 挑起，边缘整齐；所述的LB培养基配方为：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L， 酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L，氯化钠 (NaCl) 5g/L，pH7.0，琼脂 17g/L。
本发明的生防菌剂经过如下步骤得到：
a. 将菌株KMXY22移植到含有LB培养基的试管进行一环活化，32 ℃ 培养48小时；LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L，酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L，氯化钠 (NaCl) 5g/L，pH7.0；
b. 取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方为：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L，酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L，氯化钠 (NaCl) 5g/L，pH7.0的LB培养液中，在120转/min、32 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；
c. 将发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度32℃，发酵18小时或19小时或20小时后获得发酵种子菌种；
d. 将发酵种子菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为32℃，接种发酵菌液菌体5小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察含菌量、测定发酵液的酸碱度，发酵72-96小时，当菌含量大于2×1010～2×1011 CFU/ml以上，酸碱度为7.0～7.6时，储存作为生防菌剂。
本发明所用的设备均为市场销售的通用设备。
本发明的优点在于：
1、本发明的菌株KMXY22，分离自魔芋健康植株，为魔芋内生细菌，具有稳定的生态环境和有较好的生防作用。
2、本发明的生防菌剂制作容易且成本低，无毒、无害、及无环境污染，有利于魔芋产业的有机栽培，保护农田生态系统，实施农业的可持续发展；该菌剂还具有促生增产作用，有利于改良魔芋种植土壤，增加土壤中的微生物活性。
3、平板拮抗实验表明：KMXY22菌剂对魔芋软腐病菌和相关植物病原细菌具有明显的抑制作用。
4、温室小区试验结果显示：KMXY22菌剂能有效控制魔芋软腐病菌对魔芋植株的侵染，抑制病原菌的生长，达到控制软腐病病情发生的效果。另外，KMXY22菌剂能有效促进魔芋植株的生长并提高其抗逆和抗病性。
5、大田和温室试验结果显示：KMXY22菌剂对魔芋软腐病防效为73～84%，增产20～25%。
具体实施方式：
实施例所用的设备均为市场销售的通用设备。
实施例1：生防菌剂的制备
本发明的生防菌剂经过如下步骤得到：
a. 将菌株KMXY22移植到含有LB培养基的试管进行一环活化，32 ℃ 培养48小时；LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L，酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L，氯化钠 (NaCl) 5g/L，pH7.0；
b. 取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方为：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L，酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L，氯化钠 (NaCl) 5g/L，pH7.0的LB培养液中，在120转/min、32 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；
c. 将发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度32℃，发酵18小时或19小时或20小时后获得发酵种子菌种；
d. 将发酵种子菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为32℃，接种发酵菌液菌体5小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察含菌量、测定发酵液的酸碱度，发酵发酵72小时或86小时或96小时，当菌含量大于2×1010～2×1011 CFU/ml以上，酸碱度为7.0或7.6时，储存作为生防菌剂。
实施例2：平板拮抗试验
采用打孔法对魔芋软腐病菌的抑制效果进行评价。将魔芋软腐病病原细菌悬液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上 (牛肉膏 3.0g，NaCl 5.0g，蛋白胨 10.0g，水1000ml，琼脂10.0g，pH7.0，下同)，用无菌打孔器均匀打 4 个 6mm 孔，向孔内加入50μl 的KMXY22发酵液。32℃ 培养一天后，抑菌圈直径平均达到30.2mm。说明KMXY22菌株对魔芋软腐病菌具有显著的抑制作用。
实施例3：魔芋软腐病温室防效试验
设三个处理，处理1为灭菌水对照组，处理2为 KMXY22菌剂，处理3为杀细菌剂72%农用硫酸链霉素（青岛农乐化工伟业有限公司） 2000倍液。魔芋一年生种球种植入魔芋软腐病菌病土中，种植前用KMXY22菌剂浸种30分钟，作物种植15～20天后用1 ︰40倍的KMXY22菌剂穴灌，每公斤液体穴灌8-10株作物；作物种植100天后用1︰40倍KMXY22菌剂灌根一次，每公斤液体灌根5-6株作物。其他清水对照和72%农用硫酸链霉素农药处理同上述方法和用量。每667㎡施用该制剂的量，根据作物移栽株数计算而定。结果显示，KMXY22菌剂在温室试验中对魔芋软腐病的防效达86.91%，高于农药对照组。同时该KMXY22菌剂能促进水稻植株的生长，生物量增长率为24.95%（表1所示）。2010年3月15日移栽一年生魔芋植株，在2010年11月进行调查，考察魔芋的生长和病害发生状况。
表1 KMXY22对魔芋软腐病菌的温室试验结果
实施例4：魔芋软腐病田间防效试验
设3个处理，处理1为灭菌水对照组，处理2为KMXY22菌剂，处理3为72%农用硫酸链霉素。魔芋一年生种球种植入魔芋软腐病菌病土中，种植前用该KMXY22菌剂浸种30分钟，作物种植15～20天后用1︰40倍KMXY22菌剂穴灌，每公斤液体穴灌8-10株作物；作物种植100天后用1︰40倍菌液灌根一次，每公斤液体灌根5-6株作物。其他清水对照和72%农用硫酸链霉素农药处理同上述方法和用量。每个处理设3个小区重复，每个小区面积为222㎡，各处理小区随机排列。结果显示，KMXY22菌剂在温室试验中对魔芋软腐病的防效达81.93%，高于农药对照组。同时该菌剂能促进魔芋植株的生长，生物量增长率为19.23%（表2所示）。2010年3月15日移栽一年生魔芋植株，在2010年11月进行调查，考察魔芋的生长和病害发生状况。
表2 KMXY22对魔芋软腐病菌的田间病土试验结果
以上实施例中，KMXY22菌剂稀释液应始终 ≥ 1×1010个/g以上的荧光假单孢菌数量。
实施例的试验结果均表明，本发明的KMXY22菌剂对于魔芋软腐病害的防治效果较好，明显降低了魔芋软腐病的发病率，并且对于魔芋的生长发育有较强的促进作用。KMXY22菌剂应用于云南省曲靖市富源县连作土壤中种植的魔芋，其发病率基本与农药处理的防治效果相近，其经济产量也有较大增加，经济效益和环境效益显著。
Claims (2)
1.防治魔芋软腐病的生防菌株KMXU22，为荧光假单孢菌（Psdeuomnodafluorescens)，该菌株2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO. 6597。
2.用权利要求1所述的生防菌株KMXU22制备的生防菌剂，其特征在于该生防菌剂经如下步骤得到：
a. 将菌株KMXY22移植到含有LB培养基的试管进行一环活化，32 ℃培养48小时，LB培养基的配方为：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，琼脂 17g/L；
b. 取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方为：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0的LB培养液中，在120转/min、32 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；
c. 将发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度32℃，发酵18-20小时后获得发酵种子菌种；
d. 将发酵种子菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为32℃，接种发酵菌液菌体5小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察含菌量、测定发酵液的酸碱度，发酵72-96小时，当菌含量大于2×1010～2×1011 CFU/ml以上，酸碱度为7.0～7.6时，储存作为生防菌剂。
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