CN103060234A - 防治重楼根腐病的生防菌株kmxu28及其生防菌剂 - Google Patents
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Abstract
防治重楼根腐病的生防菌株KMXU28及其生防菌剂，属生物农药技术领域。菌株KMXU28的保藏号为CGMCC NO.6594。菌剂经如下步骤得到：菌株KMXU28移植到试管中进行一环活化，28℃ 培养48小时；活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml LB培养液中，在120转/min、28 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度30-32℃，发酵16-18小时后，获得发酵用菌种；发酵用菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中发酵培养，发酵罐的温度为30-32℃，发酵72-96小时储存作为生防菌液；生防菌液5000rpm离心6 min，与保藏液按1：50 (g/ml) 配成活性菌剂。本发明成本低，无毒害及污染，并能有效防止滇重楼土传病害的连作障碍，提高滇重楼产量。
Description
技术领域：
本发明涉及防治重楼根腐病的生防菌株KMXU28及其生防菌剂，属生物农药技术领域。
背景技术：
滇重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hara的干燥根茎，为《中国药典》2010 年版一部所收载的品种之一[1]，具有较强的抗肿瘤、止血、镇痛、镇静、免疫调节等生物活性，又是传统医学中一味功效显著的中药材，应用广泛[2]。近年来，随着重楼药用功效的不断开发，民间及企业用药需求量的大幅攀升，重楼价格持续高涨，每年的消耗远远超出了重楼的年生长量，现有药源远不能保障市场需要，供需矛盾亦日益突出，长期以来全部利用野生资源，野生资源急剧减少、破坏严重，加之资源再生周期长（平均需要10～12 年），目前已出现了较严重的资源危机，导致重楼资源面临枯竭的威胁，严重影响到以其为原料的医药工业的生存与发展[3]。因此，为了实现资源的可持续利用，近10年来云南省重楼人工栽培面积不断扩大。因滇重楼生长周期较长，在人工栽培中滇重楼病害也日趋严重，特别是具有毁灭性的重楼根腐病等土传病害，主要通过根部切块或其它原因造成的伤口侵入导致整个滇重楼植株根部腐烂死亡，已经成为栽培的关键问题。引起滇重楼根腐病的病原菌为多种病原菌协同侵染引起的土传复合病害，其病原主要包括真菌(Fusarium solani, F. oxysporum,Phytophthora cactorum，Rhizoctonia solani)等。调查发现，该病发病率通常在 20％～25％，重者可达 30％ 以上，引起滇重楼根腐死亡，造成严重损失，严重影响和制约滇重楼产业的发展[4-5]。但是近年来, 随着滇重楼规模化种植面积的不断扩大, 采集野生资源已不能满足市场需要，而人工栽培种施用化学农药又直接影响滇重楼质量和污染环境。因此，一种安全、有效的生物防治措施被赋予极大的期望。
经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
参考文献：
[1] 李恒，1998．重楼属植物[M]．北京：科学出版社.
[2] 武珊珊，高文远，段宏泉，等，2004. 重楼化学成分和药理作用研究进展[J]. 中草药，35（3）：344-346.
[3] 孟繁蕴，汪丽娅，冯成强，等，2005. 滇重楼引种驯化研究进展[J]. 中草药，36（7）：102-104.
[4] 马青. 2009. 滇重楼的病害及其防治[J].湖北林业科技,01: 234-236.
[5] 张金渝,虞泓,张时刚,邓成西. 2004. 滇重楼与华重楼的野生驯化和繁殖技术研究[J]. 西南农业学报;03:123-125
发明内容：
本发明的目的在于针对目前农业生产中滇重楼根腐病防治在栽培中难度大、成本高，不宜使用化学农药和农药残留高的问题，提供一种防治滇重楼根腐病的生防菌株KMXU28及其生防菌剂。
本发明从分离自云南省丽江市滇重楼种植基地健康滇重楼植株中，对其鉴定结果表明该细菌属于枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) KMXU28，具有显著的拮抗植物病原真菌和细菌作用，该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国. 北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2012年9月21；保藏号：CGMCC NO.6594。
本发明的菌体特征及菌落特征：单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
本发明的生防菌剂经如下步骤得到：
a. 将菌株KMXU28移植到试管中进行一环活化，28℃ 培养48小时；试管中的PSA培养基为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g蔗糖和17g琼脂，溶解后趁热纱布过滤，15磅温度为121℃的蒸气灭菌20分钟；
b. 取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方为：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0的LB培养液中，在120转/min、28 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；
c. 将发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中、在与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度为30-32℃，发酵16-18小时后，获得发酵用菌种；
d. 将发酵用菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中、在与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为30-32℃，发酵72-96小时，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85-90%，酸碱度为6.5～7.5时，储存作为生防菌液；
e. 将生防菌液5000rpm离心6 min，取离心后的菌体与保藏液按1：50 g/ml 配成活性菌剂，成品中活菌总浓度为1×1010～1×1011 CFU/ml；菌体保藏液为：0.015mol/L磷酸盐缓冲液（常用的用于生物学研究的一种缓冲溶液，组成成分：磷酸二氢钾34g，1mol/L氢氧化钠溶液175ml，蒸馏水825ml，PH7.2）。
本发明所用的设备均为市场销售的通用设备。
本发明的优点在于：
1、本发明的生防菌剂制作容易且成本低，无毒、无害、无环境污染，适用于滇重楼的大规模人工栽培，能保护农田生态系统，实施农业的可持续发展；该菌剂还具有促生增产作用，有利于改良滇重楼种植土壤，增加土壤中的微生物活性。
2、平板拮抗实验表明：KMXU28菌剂对滇重楼根腐病菌和相关植物病原真菌具有明显的抑制作用。
4、温室小区试验结果显示：KMXU28菌剂能有效控制滇重楼根腐病菌对滇重楼植株的侵染，抑制病原菌菌丝的生长，达到控制根腐病病情发生的效果。另外，KMXU28菌剂能有效促进滇重楼植株的生长并提高其抗逆和抗病性。
5、大田和温室试验结果显示：KMXU28菌剂对滇重楼根腐病防效为80～88%，增产10～25%。
具体实施方式：
实施例所用的设备均为市场销售的通用设备。
实施例1：生防菌剂的制备
a. 将菌株KMXU28移植到试管中进行一环活化，28℃ 培养48小时；试管中的PSA液体培养基为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g蔗糖和17g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟；
b. 取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方为：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0的LB培养液中，在120转/min、28 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；
c. 将发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中、在与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度29℃或30℃或31℃，发酵16或17小时或18小时后，获得发酵用菌种；
d. 将发酵用菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中、与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为29℃或30℃或31℃，发酵72或86小时或96小时，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85%或90%，酸碱度为6.5或7.5时，储存作为生防菌液；
e. 将生防菌液5000rpm离心6 min，取离心后的菌体与保藏液按1：50 （g/ml) 配成活性菌剂，成品中活菌总浓度为1×1010～1×1011 CFU/ml；菌体保藏液为： 0.015mol/L的磷酸盐缓冲液（常用的用于生物学研究的一种缓冲溶液，组成成分：磷酸二氢钾34g，1mol/L氢氧化钠溶液175ml，蒸馏水825ml，PH7.2）。
实施例2：平板拮抗试验
按照方中达《植病研究方法》中的平板对持培养试验方法，对KMXU28菌对滇重楼根腐病菌的抑制效果进行评价，同时灭菌蒸馏水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计结果如下，KMXU28对滇重楼根腐病菌生长抑制率为93.00%（表1所示）。说明KMXU28菌株对滇重楼根腐病具有显著的抑制作用。
表1 KMXU28对滇重楼根腐病菌及相关病菌的抑制作用
实施例3：滇重楼根腐病温室防效试验
设三个处理，处理1为灭菌水对照组，处理2为KMXU28菌剂稀释液，处理3为杀真菌剂多菌灵（南通润鸿生物化学有限公司）。滇重楼一年生组培苗移栽入滇重楼根腐病菌病土中，移栽时用KMXU28菌剂1：50倍液蘸根，边蘸根边移栽；作物移栽7～10天后用KMXU28菌剂1：50倍菌液灌根，每公斤液体灌根30-35株作物；作物移栽100天后用KMXU28菌剂1：50倍菌液灌根，每公斤液体灌根30-35株作物。整个生长期内每隔两个月灌根一次，其他清水对照和多菌灵农药处理同上述方法和用量。每667㎡施用该制剂的量，根据作物移栽株数计算而定。结果显示，KMXU28菌剂在温室试验中对滇重楼根腐病的防效达86.10%，高于农药对照组。同时该菌剂能促进滇重楼植株的生长，生物量增长率为18.34%（表2所示）。2010年1月15日移栽一年生滇重楼苗植株，在2010年12月进行调查，考察滇重楼的生长和病害发生的状况。
表2 KMXU28对滇重楼根腐病菌的温室试验结果
实施例4：滇重楼根腐病田间防效试验
设3个处理，处理1为灭菌水对照组，处理2为KMXU28菌剂稀释液，处理 3为杀真菌剂多菌灵（南通润鸿生物化学有限公司）。滇重楼一年生组培苗移栽入滇重楼根腐病菌田间病土中，移栽时用KMXU28菌剂1：50倍液蘸根，边蘸根边移栽；作物移栽7～10天后用KMXU28菌剂1：50倍菌液灌根，每公斤液体灌根30-35株作物；作物移栽100天后用KMXU28菌剂1：50倍菌液灌根，每公斤液体灌根30-35株作物。整个生长期内每隔两个月灌根一次，其他清水对照和多菌灵农药处理同上述方法和用量。每个处理设3个小区重复，每个小区面积为111㎡，各处理小区随机排列。结果显示，KMXU28菌剂在温室试验中对滇重楼根腐病的防效达88.09%，高于农药对照组。同时该菌剂能促进滇重楼植株的生长，生物量增长率为23.56%（表3所示）。2010年1月15日移栽一年生滇重楼苗植株，在2010年12月进行调查，考察滇重楼的生长和病害发生的状况。
表3 KMXU28对滇重楼根腐病菌的田间病土试验结果
以上所有实施例中，KMXU28菌剂稀释液应始终 ≥ 1×1010个/g以上的解淀粉芽胞杆菌数量。
实施例的试验结果均表明，本发明的KMXU28菌剂对于滇重楼根腐病害的防治效果较好，明显降低了滇重楼根腐的发病率。并且对于滇重楼的生长发育有较强的促进作用。KMXU28菌剂应用于云南省丽江市发病土壤中种植的滇重楼，其发病率基本与农药处理的防治效果相近，其经济产量也有较大增加，经济效益和环境效益显著。
Claims (2)
1.一种防治重楼根腐病的生防菌株KMXU28，为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)，2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO. 6594。
2.用权利要求1所述的生防菌株KMXU28制备的防治重楼根腐病生防菌剂，其特征在于该生防菌剂经如下步骤得到：
a. 将菌株KMXU28移植到试管中进行一环活化，28℃ 培养48小时；试管中的PSA培养基为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g蔗糖和17g琼脂，溶解后趁热纱布过滤，15磅温度为121℃的蒸气灭菌20分钟；
b. 取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方为：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0的LB培养液中，在120转/min、28 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；
c. 将发酵菌液按接种量1：200培的比例接种于种子罐中、在与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度为30-32℃，发酵16-18小时后，获得发酵用菌种；
d. 将发酵用菌种按接种量1：20倍的比例接种于发酵罐中、在与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为30-32℃，发酵72-96小时，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85-90%，酸碱度为6.5～7.5时，储存作为生防菌液；
e. 将生防菌液5000rpm离心6 min，取离心后的菌体与保藏液按1：50 g/ml 配成活性菌剂，成品中活菌总浓度为1×1010～1×1011 CFU/ml；菌体保藏液为：0.015mol/L磷酸盐缓冲液。
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