CN103952329B

CN103952329B - 一种死谷芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN103952329B
Application number: CN201410045778.4A
Authority: CN
Inventors: 杨利民; 孙卓; 韩梅; 韩忠明
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2014-02-08
Filing date: 2014-02-08
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-02-08
Also published as: CN103952329A

Abstract

本发明提供一种死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）SZ‑4，其保藏号为CGMCC No.8273。所述菌株在牛肉膏蛋白胨（NB）培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落圆形、乳白色、中心稍隆起、表面湿润、透明；镜检呈杆状，具鞭毛，大小为0.7～0.82×1.6～2.2μm，G+，有芽孢；在含有2%～5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨（NB）培养基上均能生长；所述的牛肉膏蛋白胨（NB）培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂17g，水1000ml，pH6.8～7.2。死谷芽孢杆菌SZ‑4对引起人参根腐病、疫病、菌核病和灰霉病的病原菌均具有显著拮抗作用。本发明还提供死谷芽孢杆菌SZ‑4在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。

Description

一种死谷芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种死谷芽孢杆菌及其应用。

背景技术

人参(Panax ginsengC.A.Mey)为五加科人参属多年生宿根阴性双子叶药用植物，是我国的名贵药材，有“百草之王”的美誉。人参在中国、韩国、朝鲜、俄罗斯等国家有大面积种植，其中，中国东北是人参的主产区，已成为当地的重要支柱产业之一。人参的长期人工种植和品种选育难度大导致人参种质退化、病害严重、质量差、产量低。化学农药的大量使用，导致农药残留和环境污染，降低了人参药材的安全性和商品价值。病害防控问题已成为制约人参产业可持续发展的重大问题之一。

人参病害约有20～40种，其中，以下4类病原菌是导致人参常见病并限制人参产业发展的主要病原菌：由腐皮镰孢菌(Fusarium solani)引起的人参根腐病一般发病率在30％左右，严重时六年生人参根腐病造成的死亡率可达50％-80％，主要危害幼苗根部和根茎部(地表以下茎部)，腐烂的参根呈黑褐色湿腐状，后期糟朽状，仅存中空的根皮；由恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)引起的人参疫病发病率可达70％，其症状为发病轻时叶片上产生不规则的暗绿色斑，重者茎叶枯萎，根部腐烂，植株成片枯死，减产严重；由人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)引起的人参菌核病主要危害3年生以上参根，发病部位为芽苞、根和根茎，参根被害后，初期在表面生少许白色绒状菌丝体，以后，内部迅速腐败、软化，细胞全部被消解殆尽，只留下坏死的外表皮，表皮内外形成许多鼠粪状的菌核；由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的人参灰霉病发病初期在参根的芽胞上出现褐色斑点，从参根主根的外表上看不出异常现象，但用手掐时，参根内部的组织已变软，发病后期芽孢和主根都表现为软腐症状，并在病部产生灰色的绒毛状霉层，有时可在病根上形成黑色的菌核。

化学农药防治病虫害对农业生产起到了十分重要的作用。但长期连续地使用化学农药，已造成一系列严重后果，如杀伤害虫天敌，并造成病菌、害虫产生抗药性，环境严重污染，人类健康受到威胁。而生物防治以生态学为基础控制有害生物，避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害，并促进农业的可持续发展。利用人参根际土筛选出的大量有益微生物可调节改善土壤微环境，具有拮抗效果的微生物亦可对人参土传病害进行生物防治。近年来，以拮抗细菌防治植物病害取得了较大的进展。在国外用放射土壤杆菌k84菌系防治果树的根癌病是最成功的例子，并且已商品化。美国报道，用草生欧氏杆菌防治梨火疫病的效果与链霉素相当。江苏省农科院植保所利用枯草芽孢杆菌，成功地开发出防治水稻纹枯病和稻曲病的生物杀菌剂，该项产品已进入农药市场，推广面积累计超过5000万亩。其他报道的细菌杀菌剂还有用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治棉花枯萎病、甘蓝黑腐病的枯草芽孢杆菌，以及防治水稻纹枯病的假单孢菌等。由于细菌的种类多、数量大、繁殖速度快，且易于人工培养和控制，因此，细菌生防杀菌剂的研究和开发具有较大的前景。

拮抗细菌是否发挥其生防作用，主要取决于是否能有效的定殖。

芽孢杆菌由于具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受关注。目前，已应用的生防细菌芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药百抗(10亿个/g活芽孢枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)获得农业部登记注册，已在多个省推广使用，推广面积约4667hm²，主要防治水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908，百抗对水稻纹枯病防效70％以上，其抑菌机制为营养竞争、位点占领等。南京农业大学研发的麦丰宁是由枯草芽孢杆菌菌株B3制成的活体生物杀菌剂，对小麦纹枯病田间防效达50％～80％，其防病机制主要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发的抗菌物质。

芽孢杆菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其种类多分布广，是土壤和植物微生态系统中的优势种群。该类微生物通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用。目前尚未见利用死谷芽孢杆菌防治人参真菌性病害专利报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对人参生产上的主要真菌性病害，尤其是人参土传病害发生面积日益扩大，化学药剂防治除易造成环境污染和农药残留外，防效也不理想的实际情况，提出一种死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株SZ-4及其在防控人参根腐病(由腐皮镰孢菌Fusarium solani引起)、人参疫病(由恶疫霉菌Phytophthora cactorum引起)、人参菌核病(由人参核盘菌Sclerotinia schinseng引起)和人参灰霉病(由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起)上的应用。

本发明提供了一种防控上述人参根腐病、疫病、菌核病和灰霉病的死谷芽孢杆菌SZ-4，该菌株的保藏名称为死谷芽孢杆菌SZ-4，分类命名为Bacillus vallismortis SZ-4，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年9月25日，保藏编号：CGMCC No.8273，其16SrDNA序列长度为1454bp，具体如SEQ ID No:l所示。应用BLAST软件和DNAMAN软件等进行分析，将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与SZ-4菌株相似性最高的是Bacillus vallismortis，同源性达到99％。根据MEGA5.10Beta2软件以UPGMA法构建系统发育树发现，SZ-4与Bacillus vallismortis同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近，亲源性达到了99％。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认本发明的菌株SZ-4为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。

SEQ ID No:l如下：

CGGGGGCTGC GTGCTAATAA TGCAAGTCGA GCGGACAGAT

GGGAGCTTGC TCCCTGATGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA

ACACGTGGGT AACCTGCCTG TAAGACTGGG ATAACTCCGG

GAAACCGGGG CTAATACCGG ATGGTTGTTT GAACCGCATG

GTTCAGACAT AAAAGGTGGC TTCGGCTACC ACTTACAGAT

GGACCCGCGG CGCATTAGCT AGTTGGTGAG GTAACGGCTC

ACCAAGGCGA CGATGCGTAG CCGACCTGAG AGGGTGATCG

GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA

GGCAGCAGTA GGGAATCTTC CGCAATGGAC GAAAGTCTGA

CGGAGCAACG CCGCGTGAGT GATGAAGGTT TTCGGATCGT

AAAGCTCTGT TGTTAGGGAA GAACAAGTGC CGTTCAAATA

GGGCGGCACC TTGACGGTAC CTAACCAGAA AGCCACGGCT

AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT AGGTGGCAAG

CGTTGTCCGG AATTATTGGG CGTAAAGGGC TCGCAGGCGG

TTTCTTAAGT CTGATGTGAA AGCCCCCGGC TCAACCGGGG

AGGGTCATTG GAAACTGGGG AACTTGAGTG CAGAAGAGGA

GAGTGGAATT CCACGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGAGATG

TGGAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACTCT CTGGTCTGTA

ACTGACGCTG AGGAGCGAAA GCGTGGGGAG CGAACAGGAT

TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGAGTGCTA

AGTGTTAGGG GGTTTCCGCC CCTTAGTGCT GCAGCTAACG

CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGGTC GCAAGACTGA

AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG

CATGTGGTTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAG

GTCTTGACAT CCTCTGACAA TCCTAGAGAT AGGACGTCCC

CTTCGGGGGC AGAGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA

GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC

GCAACCCTTG ATCTTAGTTG CCAGCATTCA GTTGGGCACT

CTAAGGTGAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA

TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC

ACGTGCTACA ATGGACAGAA CAAAGGGCAG CGAAACCGCG

AGGTTAAGCC AATCCCACAA ATCTGTTCTC AGTTCGGATC

GCAGTCTGCA ACTCGACTGC GTGAAGCTGG AATCGCTAGT

AATCGCGGAT CAGCATGCCG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC

CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA

CCCGAAGTCG GTGAGGTAAC CTTTTAGGAG CCAGCCGCTA

GTAAGCTGCA TCAC

本发明的死谷芽孢杆菌SZ-4在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落圆形、乳白色、中心稍隆起、表面湿润、透明；镜检呈杆状，具鞭毛，大小为0.7～0.82×1.6～2.2μm，G+，有芽孢；能在25℃～40℃的温度下生长，最适生长温度为32℃；其生长pH范围为6.5～7.5，最适生长pH为6.8；需氧生长；硝酸盐还原反应生成红色化合物；接触酶测定、脂肪酶反应为阴性；酪蛋白、酪氨酸反应呈阳性；能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解试验镜检有糊精生成；明胶液化试验呈阳性；柠檬酸盐利用试验培养基呈碱性(蓝色)；V-P(pH7.0)测定生成红色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇检测呈阳性；在含有2％～5％的NaCl的牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上均能生长。所述的牛肉膏蛋白胨(NB)培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。

本发明还涉及死谷芽孢杆菌SZ-4在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用，所述植物优选为人参，所述真菌优选为引起人参根腐病的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、引起人参疫病的恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)、引起人参菌核病的人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)和引起人参灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中的一种或多种。本发明的死谷芽孢杆菌SZ-4对人参还具有促生长的作用。

本发明还涉及一种微生物制剂，含有死谷芽孢杆菌SZ-4的全培养液培养物和死谷芽孢杆菌SZ-4的孢子，其可通过以下制备方法制备得到：

(1)将死谷芽孢杆菌SZ-4试管种接种于用1000mL三角瓶装的300mL肉膏蛋白胨酵母膏(BPY)培养液中，在180r/min，32℃下培养24小时，获得发酵菌液；

(2)将发酵菌液在以种子罐体积15％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为18～20％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度30～34℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为12～16小时；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的BPY培养液中发酵培养，溶氧量为18～20％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度30～34℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐中的发酵液进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于90％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-4微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为24～36小时。

BPY培养液的配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸馏水l000mL，pH6.8～7.0；制备方法为：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL蒸馏水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.0，1000mL三角瓶中装量为300mL，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。发酵培养液的配方以重量百分比计为：豆饼粉2.0％，淀粉1.5％，酵母浸膏0.5％，玉米浆0.5％，NaCl0.5％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O0.2％，MgSO₄·H₂O0.5％，Ca(HCO₃)₂0.2％，余量为水，pH6.5～7.0；制备方法为在种子罐中加入所需的水，按比例加入豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、玉米浆、NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、MgSO₄·H₂O、Ca(HCO₃)₂，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.5～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

在种子罐与发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，可以加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐中发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。本发明的微生物制剂可以以稀释液的形式在人参真菌性病害发病初期均匀地施加到土壤中，微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。另外，稀释液中还可以添加助剂有机硅，有机硅与稀释液的体积比为1:5000。

本发明的优点在于，保藏号为CGMCC No.8273的死谷芽孢杆菌SZ-4对分别由腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的人参根腐病、疫病、菌核病和灰霉病均具有良好的防治效果，对人参具有促生长作用，无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境；同时，生防菌剂稀释后直接施加到土壤中对植物进行灌根处理即可发挥其杀菌作用，能显著改善人参根际环境中微生物群落的合理结构，形成一个生物多样化的人参根际土壤微生态环境，从而有效地、持久地控制人参真菌性病害的流行。

附图说明

图1:本发明的死谷芽孢杆菌SZ-4菌株对恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)菌丝的生长平板抑制作用。

图2:本发明的死谷芽孢杆菌SZ-4菌株对腐皮镰孢菌(Fusarium solani)菌丝的生长平板抑制作用。

图3:本发明的死谷芽孢杆菌SZ-4菌株对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)菌丝的生长平板抑制作用。

图4:本发明的死谷芽孢杆菌SZ-4菌株对人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)菌丝的生长平板抑制作用。

图5：SZ-4对人参的促生长作用(A：空白，B：浇注SZ-4菌悬液)。

图6：SZ-4对腐皮镰孢菌引起的人参根腐病的防治效果(A：空白，B：浇注SZ-4菌悬液)。

图7：SZ-4对恶疫霉菌引起的人参疫病的防治效果(A：空白，B：浇注SZ-4菌悬液)。

图8：SZ-4对人参核盘菌引起的人参菌核病的防治效果(A：空白，B：浇注SZ-4菌悬液)。

图9：SZ-4对灰葡萄孢菌引起的人参灰霉病的防治效果(A：空白，B：浇注SZ-4菌悬液)。

具体实施方式

实施例1

死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)SZ-4菌株的分离和保藏

该菌株自吉林省抚松县万良镇人参栽培基地多年生人参根际周围30cm以内的土壤分离得到。采集上述土壤样品，风干后过筛。称取样品10g，放入装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡10-30min，使样品与无菌水混合均匀，制得样品悬液，静置5min。在无菌条件下取1mL上清液，加入9mL0.05％SDS水溶液(十二烷基硫酸钠水溶液)，40℃保温20min，取1mL，加入9mL无菌水，按梯度依次制成10^-3、10^-4、10^-5的稀释液。分别吸取100μL各稀释液加入到牛肉膏蛋白胨(NB)平板上，采用平板稀释法均匀涂布，每处理3次重复，34℃培养箱培养1～2天。挑选单菌落转接到NB平板培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存。牛肉膏蛋白胨(NB)培养基的配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。

该菌株在NB培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形、乳白色、中心稍隆起、表面湿润、透明；镜检呈杆状，具鞭毛，大小为0.7～0.82×1.6～2.2μm，G+，有芽孢；能在25℃～40℃的温度下生长，最适生长温度为32℃；生长pH范围为6.5～7.5，最适生长pH为6.8。需氧生长；硝酸盐还原反应生成红色化合物；接触酶测定、脂肪酶反应为阴性；酪蛋白、酪氨酸反应呈阳性；能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解试验镜检有糊精生成；明胶液化试验呈阳性；柠檬酸盐利用试验培养基呈碱性(蓝色)；V-P(pH7.0)测定生成红色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇检测呈阳性；在含有2％～5％的NaCl的牛肉膏蛋白(NB)胨培养基上均能生长。

该菌株于2013年9月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8273。

该菌株我们命名SZ-4，分类命名为：死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。

实施例2

死谷芽孢杆菌SZ-4菌株对人参真菌病害病原真菌生长的抑制作用

采用滤纸片法测定菌株SZ-4对人参真菌病害病菌的拮抗作用：用直径8mm的打孔器将活化好的人参病原菌菌落制成相应尺寸的菌饼，无菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板(直径90mm)的正中央，同时将4片直径为1cm的灭菌滤纸圆片粘于距平板中心25mm处的4个角点上。将菌株SZ-4制成菌悬液(浓度约为10⁸cfu/mL)，其中3片滤纸圆片每片点接20μL菌悬液，1片滤纸圆片点接20μL无菌水，作为处理组，每个处理重复3次；另在一块平板的4个角点的4片滤纸圆片上均分别点接20μL无菌水，作为对照组，均置于28℃培养箱培养6～7天，待对照组病原菌菌落长满平板，测量处理组病原菌菌落直径(单位：mm)，并按照如下公式计算抑菌率。每种病原菌重复3次，结果取平均值。

抑菌率(％)＝[(A－B)/(A－8)]×100％

注：A为对照组病原菌菌落直径，即90mm；B为处理组病原菌菌落直径。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的制备方法：称取去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加入水1000mL，调节pH为7.0。在沸水浴上加热20min，纱布过滤后定容到1000mL，加琼脂22g熔化后分装湿热灭菌(121℃，30min)。

上述菌悬液的制备方法：保藏的菌株SZ-4通过平板划线方式活化2天后，用接种环取3～4块直径1cm的细菌菌落，接入到200mL含50mL牛肉膏蛋白胨(NB)培养液的三角锥形瓶中，摇床32℃，180r/min培养48h后制成浓度约为10⁸cfu/mL的细菌菌悬液。NB培养液的配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2。

结果如表1所示，菌株SZ-4对分别引起人参根腐病、人参疫病、人参菌核病和人参灰霉病的腐皮镰孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和灰葡萄孢菌均具有明显的抑制作用，抑菌率达到63.0％～89.3％，对灰葡萄孢菌、恶疫霉菌和人参核盘菌的抑菌率均在80％以上，反映出菌株SZ-4对人参4种主要病原菌的防治作用具有广谱性。

表1菌株SZ-4对人参病原真菌的抑制作用

实施例3

死谷芽孢杆菌SZ-4对人参病原菌的平板对峙实验

采用牛津杯法测定菌株SZ-4对人参真菌病害病菌的拮抗活性：将SZ-4菌株制成菌悬液后收集(制备方法同实例2)，在4℃条件下，12000r/min离心20min，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液4℃保存备用。无菌条件下在PDA平板(直径90mm)中央接种直径为8mm的人参病菌菌饼，然后将4个无菌牛津杯放于距平板中心约25mm的4个对称角点，每杯内滴加100μl滤液，每处理3次重复，28℃培养5天后测量抑菌带宽度。结果表明，SZ-4对人参恶疫霉菌、腐皮镰孢菌、灰葡萄孢菌和人参核盘菌的抑菌带分别为9.4mm、7.8mm、11.5mm、4.2mm，说明SZ-4菌悬液的上清液除对人参核盘菌的抑菌带宽度小于5mm外，对其余3种病原菌的抑菌带宽度均大于5mm，其中对灰葡萄孢菌的抑菌带宽度大于10mm，说明SZ-菌悬液的上清液对4种人参病原菌具有不同程度的拮抗活性(表2)。

表2死谷芽孢杆菌SZ-4对人参病原真菌的拮抗活性

注：参考Vestberg法，“+”、“++”、“+++”分别表示抑菌带半径为<5mm、5-10mm、>10mm。

实施例4

死谷芽孢杆菌SZ-4菌株对人参的促生作用

制备SZ-4菌株菌悬液(32℃、180r/m、48h，浓度约为10⁸cfu/mL，制备方法同实施例2)。将人参新林土：蛭石按照2:1比例配制基质，灭菌后填装于同体积花盆中。应用取于抚松县万良镇的3年生人参苗，小心抖落附着于根部的土壤，随机分组。将处理组人参苗浸泡于预先配置好的SZ-4菌悬液中，25-30min后取出，分别移栽于装有灭菌土的花盆中，每盆5株。每盆用SZ-4菌悬液(含菌量约为10⁸cfu/mL)的200倍无菌水稀释液50mL灌根，每处理3盆，随机排列，温室保湿培养；对照组用无菌牛肉膏蛋白胨(NB)培养液浸苗，处理方式同上，每处理3盆，随机排列，温室保湿培养，分别浇灌30mL的无菌培养液(除不含有SZ-4外，其余成分与处理组相同)。待人参苗长至30天后，分别随机选取处理组和对照组各5株人参苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株高、根长、整株鲜重和根鲜重指标。然后180℃烘干至恒重，测整株干重和根干重。

室内盆栽测定结果表明(表3)，接种SZ-4菌株于灭菌土种植人参时，人参植株株高、整株鲜重、根鲜重、根长、整株干重及根干重较无菌培养液均有不同程度的增加，证明SZ-4菌株对人参生长具有极显著的促进作用(图5-9)。同时，也说明SZ-4对人参是安全的。

表3菌株SZ-4对人参生长的促进作用

实施例5

SZ-4在土壤中的定殖

将用利福平(300μg/mL)标记过的死谷芽孢杆菌SZ-4接种于NB培养液，32℃，180r/min，摇床振荡24h，制成含菌量约为10⁸cfu/mL的标记菌株菌悬液。分别把自然土及灭菌土装于花盆中，每盆1kg土，向土壤中注入100mL标记过的死谷芽孢杆菌SZ-4菌悬液拌土。室温下放置，每隔7天分离1次土壤内的细菌(土壤先经梯度稀释后，取10^-3、10^-4、10^-5的土壤稀释液进行平板涂布)，计算含菌量。结果表明，28天后自然土和灭菌土中SZ-4的定殖量均能达到10⁵cfu/g土以上。这说明SZ-4在土壤中具有较强的定殖能力。

实施例6

死谷芽孢杆菌SZ-4发酵菌液的制备

死谷芽孢杆菌SZ-4试管种接种于用1000mL三角瓶装的300mL肉膏蛋白胨酵母膏(BPY)培养液中，在180r/min，32℃下培养24小时，获得发酵菌液。

BPY培养液的配制方法：称取牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，NaCl5g，放入l000mL蒸馏水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.0，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

实施例7

死谷芽孢杆菌SZ-4微生物制剂的制备

死谷芽孢杆菌SZ-4微生物制剂含有死谷芽孢杆菌SZ-4的全培养液培养物和死谷芽孢杆菌SZ-4的孢子，制备方法如下：

(1)将实施例6中培养好的发酵菌液在以种子罐体积15％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为18～20％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度30～34℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为12～16小时；

(2)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的BPY培养液中发酵培养，溶氧量为18～20％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度30～34℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐中的发酵液进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于90％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-4微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为24～36小时。

发酵培养液的配方为(以重量百分比计)：豆饼粉2.0％，淀粉1.5％，酵母浸膏0.5％，玉米浆0.5％，NaCl0.5％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O0.2％，MgSO₄·H₂O0.5％，Ca(HCO₃)₂0.2％，余量为水，pH6.5～7.0；制备方法为：在种子罐中加入所需的水，按比例加入豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、玉米浆、NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、MgSO₄·H₂O、Ca(HCO₃)₂，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.5～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

实施例8

死谷芽孢杆菌SZ-4菌株对人参真菌病害的田间防治试验

人参根腐病防治试验于2013年在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于6月10日移栽，随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。移栽前，处理组用实施例7制备的SZ-4微生物制剂的200倍无菌水稀释液蘸根，根腐病发病初期开始灌根，每株灌上述200倍稀释液20mL，分别于6月20日和6月30日灌根两次。以10％多菌灵250倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。6月20日、7月10日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

人参疫病防治试验于2013年在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于7月5日移栽。随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。人参开始发病时对处理组人参喷施实施例7制备的SZ-4微生物制剂的200倍无菌水稀释液，分别于7月15日和7月23日喷施两次。以50％咪鲜胺锰盐可湿性粉剂的1000倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。7月15日、8月1日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

人参菌核病防治试验于2013年在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于6月10日移栽，随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。移栽前，处理组用实施例7制备的SZ-4微生物制剂的200倍无菌水稀释液蘸根，菌核病发病初期开始灌根，每株灌上述200倍稀释液20mL，分别于6月20日和6月30日灌根两次。以40％菌核净可湿性粉剂的500倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。6月20日、7月10日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

人参灰霉病防治试验于2013年在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于6月6日移栽，随机区组排列，每小区种植人参20株，4次重复。移栽7天后，处理组用实施例7制备的SZ-4微生物制剂的200倍无菌水稀释液灌根，每株20mL，人参灰霉病开始发病后，于7月9日和7月16日连续灌根两次。以70％代森锰锌粉剂的1000倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。7月9日、7月28日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

如上防效试验计算方法：病情指数＝[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100，

相对防效(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100

如表4所示，SZ-4对上述引起人参根腐病、人参菌核病、人参疫病和人参灰霉病的病原菌均有较好的防效，防治效果与上述病害主用农药相当或略优。

表4菌株SZ-4对人参真菌性病害的防治效果试验

实施例9

应用TaKaRa MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)方法提取总DNA，自行合成的PCR引物序列为16S1F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S1R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以SZ-4菌体基因组DNA为模板，在PCR反应扩增后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条1500bp左右的特异性片段，测定该片段序列(采用TIANGEN凝胶回收试剂盒于生工生物工程(上海)股份有限公司测序)，结果表明，SZ-4菌株的DNA为1454bp，具体如SEQ ID No:1所示。将测得的16srDNA序列应用BLAST软件和DNAMAN软件以及clustalx拼接软件进行分析，发现SZ-4菌株DNA序列与死谷芽孢杆菌16srDNA部分序列同源性很高，达到99％。根据MEGA5.10Beta2软件以UPGMA法构建系统发育树发现，SZ-4与Bacillus vallismortis同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近，亲源性达到了99％。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认菌株SZ-4为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求限定的范围，在本专利的启示下，结合本领域的基本常识，将所述菌株用于人参真菌性病害的防治中，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)SZ-4，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.8273。

2.如权利要求1所述的死谷芽孢杆菌SZ-4在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用，其特征在于，所述植物为人参；所述真菌为引起人参根腐病的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、引起人参疫病的恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)、引起人参菌核病的人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)和引起人参灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中的一种或多种。

3.一种微生物制剂，其特征在于，含有如权利要求1所述的死谷芽孢杆菌SZ-4的全培养液培养物，所述全培养液培养物中含有如权利要求1所述的死谷芽孢杆菌SZ-4的孢子。

4.如权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，其是通过以下制备方法制备得到的：

(1)将如权利要求1所述的死谷芽孢杆菌SZ-4试管种接种于用1000mL三角瓶装的300mL肉膏蛋白胨酵母膏培养液中，在180r/min，32℃下培养24小时，获得发酵菌液；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的肉膏蛋白胨酵母膏培养液中发酵培养，溶氧量为18～20％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度30～34℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐中的发酵液进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中包含菌和芽孢的最终培养物生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于90％时，立即将发酵液出罐进行分装，获得SZ-4微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为24～36小时。

5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述的肉膏蛋白胨酵母膏培养液的配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水l000mL，pH6.8～7.0；所述步骤(2)的发酵培养液的配方以重量百分比计为：豆饼粉2.0％，淀粉1.5％，酵母浸膏0.5％，玉米浆0.5％，NaCl 0.5％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.2％，MgSO₄·H₂O 0.5％，Ca(HCO₃)₂0.2％，余量为水，pH6.5～7.0。

6.如权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述的肉膏蛋白胨酵母膏培养液通过如下方法配制：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL蒸馏水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.0，1000mL三角瓶中装量为300mL，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用；

所述步骤(2)的发酵培养液通过如下方法配制：在种子罐中加入所需的水，按比例加入豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、玉米浆、NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、MgSO₄·H₂O、Ca(HCO₃)₂，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.5～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

7.如权利要求3-6中任一项所述的微生物制剂，其特征在于，

在种子罐或发酵罐的发酵中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐中发酵完成后,在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

8.如权利要求3-7中任一项所述的微生物制剂在防治人参真菌病害中的应用，其特征在于，所述真菌为引起人参根腐病的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、引起人参疫病的恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、引起人参菌核病的人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)和引起人参灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中的一种或多种。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，在人参真菌性病害发病初期，将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土壤中，所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的稀释液中还添加了助剂有机硅，所述助剂有机硅与稀释液的体积比为1:5000。