CN101985608B

CN101985608B - 一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN101985608B
Application number: CN2010105180341A
Authority: CN
Inventors: 陈志谊; 刘永峰; 张荣胜
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: CN101985608A

Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3789，该菌株的16S rRNA登录在GenBank上，登录号为HQ179100。本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌菌株用于防治水稻细菌性条斑病。其优点在于：本发明涉及的菌株对水稻细菌性条斑病有良好的防治效果，无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境；将制成生防菌剂或与叶枯唑复配形成复配生防菌剂稀释后喷施，能操纵管理水稻根叶周围生态环境中微生物群落的合理分布，恶化病原菌的生存环境，形成一个生物多样化的水稻生态系统，从而有效地、持久地控制水稻细菌性条斑病的流行。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lx-11菌株，以及利用该菌株制备的生防菌剂和该菌剂的应用。属于利用有益微生物对水稻细菌性条斑病进行生物防治的领域。

背景技术

水稻细菌性条斑病是我国特别是南方地区水稻生产上的一类重要病害，也是保障我国水稻生产安全的重要限制因素之一。目前，该病害常年发生面积在2000万亩以上，造成水稻产量损失达5-10％，严重时达30％以上。

上世纪七、八十年代，随着杂交水稻在全国的大面积推广和应用，水稻细菌性病害曾席卷神州大地，使水稻产量常年损失达到20％以上，成为我国水稻生产上的第一大病害。进入90年代，随着抗病品种(主要是含Xa-4基因)的应用以及水稻品种的粳质化，近年来水稻细菌性病害主要在我国南方和长江中下游地区发生和为害。进入21世纪，由于水稻轻(简)型种植模式推广、种质资源和品种交换频繁、病原菌致病性变异、病菌抗药性产生以及防治措施单一等原因，病害发生和流行条件发生了重大变化，水稻细菌性条斑病不仅继续在南方籼稻区为害，并在部分地区爆发成灾，而且正在向我国长江以北水稻种植区迅速扩展蔓延。根据近年来对我国长江中下游地区水稻细菌性条斑病发生趋势预测，水稻条斑病在粳稻上已处于爆发的临界期，预计未来几年该病害在我国的发生面积将进一步扩大，并将再次成为我国水稻生产安全的重要隐患之一。

近年来，以拮抗细菌生物防治植物病害取得了较大的进展。在国外用放射土壤杆菌k84菌系防治果树的根癌病是最成功的例子，并且已商品化。美国报道，用草生欧氏杆菌防治梨火疫病的效果与链霉素相当。江苏省农科院植保所利用枯草芽孢杆菌，成功地开发出防治水稻纹枯病和稻曲病的生物杀菌剂，该项产品已进入农药市场，推广面积累计超过5000万亩。其他报道的细菌杀菌剂还有：用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治棉花枯萎病、甘蓝黑腐病的枯草芽孢杆菌，以及防治水稻纹枯病的假单孢菌等。由于细菌的种类多、数量大、繁殖速度快，且易于人工培养和控制，因此，细菌杀菌剂的研究和开发具有较大的前景。

用于生防的细菌以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B.pumilis)等。由于芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受关注。国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药/百抗(10亿个/g活芽孢枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)获得农业部登记注册，已在多个省推广使用，推广面积约4 667hm²，主要防治水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908，百抗对水稻纹枯病防效70％以上，其抑菌机制为营养竞争、位点占领等。南京农业大学研发的麦丰宁是由枯草芽孢杆菌菌株B3制成的活体生物杀菌剂，对小麦纹枯病田间防效达50％-80％，其防病机制主要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发的抗菌物质。

芽孢杆菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其种类多分布广，是土壤和植物微生态的优势种群。该类微生物通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用，大量研究发现一些芽孢杆菌可以产生对植物病原真菌有抑菌活性的抗菌物质，这些抗菌物质主要有低分子量的抗生素如肽类、脂肽类、细菌素以及高分子量蛋白类抗菌物质等。目前利用解淀粉芽孢杆菌防治水稻细菌性病害未见报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对水稻生产上细菌性病害，尤其是水稻细菌性条斑病发生面积日益扩大，化学药剂防治除易造成环境污染外，防效也不理想的实际情况，提出一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株Lx-11及其在水稻细菌性条斑病防治上的应用。

本发明的目的是这样实现的：一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3789，该菌株的16S rRNA登录在GenBank上，登录号为HQ179100。

在本发明中，该菌株在YPGA培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为园形，四周光滑，乳白色；细胞形状为杆状，细胞直径大于1μm；形成芽孢，不形成伴孢晶体；需氧生长；接触酶、氧化酶反应为阳性；精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、色氨酸脱羧酶反应为阴性；VP试验和硝酸盐还原为阳性；能利用葡萄糖，木糖，L-阿拉伯糖，甘露糖，乳糖，蔗糖，山梨糖，苦杏仁苷；不能利用蜜二糖，鼠李糖，肌醇；

所述的YPGA培养基的配方为：酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，琼脂17.0g，水1000ml，pH6.8～7.2。

一种上述菌株的应用，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌菌株用于防治水稻细菌性条斑病。

在所述菌株的应用中：所述的将解淀粉芽孢杆菌菌株用于防治水稻细菌性病害是指：用解淀粉芽孢杆菌菌株制备生防菌剂，在水稻细菌性条斑病发病初期，将生防菌剂的稀释液均匀地喷在水稻叶面防治水稻细菌性病害；所述的稀释液中生防菌剂与水的稀释的体积比为1∶100。

在所述菌株的应用中：所述的将解淀粉芽孢杆菌菌株用于防治水稻细菌性病害是指：用解淀粉芽孢杆菌菌株制备生防菌剂，将生防菌剂与叶枯唑复配，在水稻细菌性条斑病发病初期，将生防菌剂与叶枯唑的复配剂稀释液均匀地喷在水稻叶面防治水稻细菌性病害；所述的生防菌剂与叶枯唑复配是指：用100ml生防菌剂与1g叶枯唑复配；所述的稀释液中复配剂与水的稀释的体积比为1∶100。

在所述菌株的应用中：所述的稀释液中还添加了助剂有机硅，所述助剂有机硅与稀释液的体积比为1∶5000。

在所述菌株的应用中：所述的生防菌剂是将解淀粉芽孢杆菌菌株在YPGA斜面培养基上活化、移入YPG培养液中培养、通过发酵培养基发酵培养获得的，生防菌剂的含菌量至少为10⁹pfu/mL；获得生防菌剂的具体步骤是：

a)将解淀粉芽孢杆菌菌株移植到含有YPGA培养基的试管进行一环活化；

b)取一环活化后的菌移入用1000ml三角瓶装的300mlYPG培养液中，在120转/min、28℃下培养48小时，获得菌液；

c)将培养好的菌液按接种量1∶300倍的比例接种于种子罐中的发酵培养基中发酵培养，种子罐的温度28～32℃，接种菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为12～16小时；

d)将发酵菌种按接种量1∶10-20倍的比例接种于发酵罐中的发酵培养基中发酵培养，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵液菌体4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量、测定发酵液的酸碱度，当发酵罐中发酵液中的芽孢含量大于或等于90％后，立即将发酵液出罐，进行分装，获得生防菌剂；发酵罐中发酵时间为24～36小时。

在所述菌株的应用中：制备生防菌剂涉及的YPGA培养基的配方为：所述的YPGA培养基的配方为：酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，琼脂17.0g，水1000ml，pH6.8～7.2；所述的YPG培养液的配方为：胰蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，水1000ml，pH6.8～7.2；所述的发酵培养基配方为：大豆粉1.0％，豆饼粉2.0％淀粉0.5％，酵母膏0.2％，玉米浆0.22％，NaCl 0.1％，CaHCO₃ 0.18％，余量为水，pH7.0～7.2。

在所述菌株的应用中：制备生防菌剂涉及的YPGA培养基是这样配制的：称取标准量的酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖和琼脂放入1000ml水中，加热溶化、充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管中的装量为试管的1/5～1/6，用塞子塞好试管口，121℃湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；涉及的PYG培养液是这样配制的：称取标准量的胰蛋白胨、酵母膏、葡萄糖放入1000ml中，充分混匀后将pH调整至6.8-7.2，1000ml三角瓶中装量为1/3～1/4，用塞子塞好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用；涉及的发酵培养液是这样配制的：在种子罐或发酵罐中加入所需的水，按比例加入大豆粉、豆饼粉、淀粉、酵母膏、玉米浆、NaCl、CaHCO₃后放入种子罐或发酵罐，充分搅拌，将发酵培养基pH调整到7.0～7.2，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

在所述菌株的应用中：当种子罐或发酵罐的发酵中出现较多泡沫时，应该加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

本发明的优点在于：本发明涉及的保藏号为CGMCC No.3789的解淀粉芽孢杆菌菌株对水稻细菌性条斑病有良好的防治效果，无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境；同时，制成生防菌剂或与叶枯唑复配形成复配生防菌剂，稀释后通过喷施，能操纵管理水稻根叶周围生态环境中微生物群落的合理分布，恶化病原菌的生存环境，形成一个生物多样化的水稻生态系统，从而有效地、持久地控制水稻细菌性条斑病的流行。

具体实施方式

实施例1

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株的分离和保藏

2009年2月，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株是在江苏省农业科学院的水旱轮作试验田中、通过梯度稀释方法分离获得。具体方法是：从江苏省农业科学院水旱轮作试验田采集的土壤称取10g，加入盛有90mL灭菌水的三角瓶中，震荡培养30min(150r/min)，制成1∶10(土壤∶水)的悬浮液，然后取悬浮液1mL置于9mL无菌水中，制成10^-2稀释悬浮液，依次类推，制成10^-5，10^-6稀释悬液；在其中各吸取200μL，加到YPGA培养基平板上，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3次。将上述培养皿，置于28℃恒温培养箱中培养1～2d。挑选单菌落转接到YPGA平板培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存。

分离、纯化获得的菌株在YPGA培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为园形，四周光滑，乳白色；细胞形状为杆状，细胞直径大于1μm；形成芽孢，不形成伴孢晶体；需氧生长；接触酶、氧化酶反应为阳性；精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、色氨酸脱羧酶反应为阴性；VP试验和硝酸盐还原为阳性；能利用葡萄糖，木糖，L-阿拉伯糖，甘露糖，乳糖，蔗糖，山梨糖，苦杏仁苷；不能利用蜜二糖，鼠李糖，肌醇等。该菌株的16S rRNA登录在GenBank上，登录号为HQ179100。

该菌株于2010年4月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3789。

该菌株我们命名Lx-11，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

实施例2

生防菌Lx-11发酵菌种的制备

1、菌种活化：将冻干保藏的Lx-11菌种移植到YPGA斜面，28℃下培养48小时。

YPGA斜面的配制：称取酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g；葡萄糖5.0g，琼脂17.0g；放入1000ml水中，加热、充分混匀后将pH调整至6.8-7.2，适当冷却后封装到试管中，装量为试管的1/5-1/6，用塞子塞好试管口，121℃湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用。

2、发酵菌种的制备：取一环活化后的Lx-11菌移入用1000ml三角瓶装的300mlYPG培养液中，在120转/min、28℃下培养48小时后，培养液中的菌含量可达到10^9-10cfu/ml。

YPG培养液的配制：称取胰蛋白胨5g、酵母膏5g、葡萄糖5g，放入1000ml中，充分混匀后将pH调整至6.8-7.2，1000三角瓶中装量为300ml培养液，用塞子塞好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

实施例3

Lx-11生防菌剂的发酵程序与质量控制

1、发酵程序：

将培养好的发酵菌种移入种子罐的发酵培养基中进行发酵培养，在种子罐中发酵时间为12～16小时，移入发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵菌液进行发酵质量检测，当发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，立即将种子罐中的发酵液转入大型发酵罐发酵培养基中进行发酵培养，在大型发酵罐中发酵时间为24～36小时，移入发酵菌液4小时后，每隔2小时对发酵菌液进行发酵质量检测，观察菌含量、测定发酵液的酸碱度，泡沫较多时可适量加入消泡剂。当大型发酵罐中发酵液中的芽孢含量大于等于90％后，立即将发酵液出罐，进行分装，获得生防菌剂，生防菌剂的含菌量至少为10⁹pfu/mL。。

上述种子罐和发酵罐中发酵培养基的配制：在种子罐或发酵罐中加入所需的吨位的水，按大豆粉1.0％，豆饼粉2.0％淀粉0.5％，酵母膏0.2％，玉米浆0.22％，NaCl 0.1％，CaHCO₃ 0.18％的比例放入发酵罐，充分搅拌，将发酵培养基pH调整到7.2，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即加入发酵菌种进行发酵。

2、发酵质量控制检测方法：

通过种子罐或发酵罐的取样口获取发酵液50～100ml，用接种环挑取数环发酵液于洁净的载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。用番红染液染色2～3分钟，用缓流水冲洗，直至流出的水无红色为止，然后用滤纸吸干载玻片上的水迹。用物镜(油镜100倍)×目镜(10倍)观察。观察完后用香柏油擦干净镜头，在载玻片上注明镜检时间。镜检的玻片一直保留到发酵全过程结束时一并处理。

上述检测方法用于：1)检测发酵液是否被污染：解淀粉芽孢为杆状(刚接种阶段为由短杆状的菌体连接成线形)菌体。如镜检发现在发酵液中有小球形、椭圆形或其它形状的菌体，表明发酵液被污染了。2)观察解淀粉芽孢杆菌的生长状况：刚接种阶段(1～4小时)，解淀粉芽孢杆菌为由短杆状的菌体连接成线形菌体；在生长条件适宜、营养充足的状况下，解淀粉芽孢杆菌繁殖很快，数量迅速增加，菌体为短杆状；在发酵后期，营养条件不能满足菌体快速繁殖的需求，菌体数量增加停止，并形成着生在菌体两端的长圆形芽孢。当有芽孢的菌体超过90％，即可终止发酵，迅速将发酵液下罐，传送到储存罐中。3)估计发酵液中的菌体数量：首先用发酵液稀释平板菌落计数的方法建立显微镜(物镜100倍×目镜10倍)观察到的菌体数量和发酵液中菌体数量之间关系的标准曲线。然后根据在显微镜下观察到的菌体数量，估算出发酵液中菌体数量。

实施例4

生防菌剂Lx-11的毒性测定结果

使用健康的大鼠20只，体重180～200g，雌雄各半。试验条件：环境温度22±2℃，相对湿度40～70％。大鼠禁食过夜后，以5000mg/kg.b.wt.的剂量使用生防菌剂Lx-11经口一次灌胃，容量为10ml/kg.b.wt.，灌胃后4小时给食，观察期2周。雌雄大鼠灌胃后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。雌雄大鼠急性经口LD₅₀值均大于5000mg/kg.b.wt.。可见：生防菌剂Lx-11属微毒级。

使用健康的大鼠20只，体重200～300克，雌雄各半。试验条件：环境温度22±2℃，相对湿度40～70％。试验前24小时剪毛备皮，面积为体表面积的10％。以5000mg/kg.b.wt.的剂量使用生防菌剂Lx-11直接均匀涂于备皮区内，4小时后用温水轻轻洗去残余，观察期2周。雌雄大鼠涂皮后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。雌雄大鼠经皮LD₅₀值均大于5000mg/kg.b.wt.。可见：生防菌剂Lx-11属微毒级。

实例5

生防菌剂Lx-11防治水稻细菌性条斑病田间使用方法。

将生防菌剂Lx-11按1∶100倍用水稀释，同时加入少许专用助剂有机硅(助剂与生防菌剂稀释液的体积比为1∶5000)，充分搅拌后均匀地喷雾在水稻叶面。防治适期为水稻细菌性条斑病初发病时。生防菌剂Lx-11的推荐使用剂量为每亩使用500ml。防治间隔期：一般年份，使用生防菌剂Lx-11只要使用一次就可以有效地控制水稻细菌性条斑病的流行蔓延；在环境条件特别有利于病害发生流行的年份，在水稻细菌性条斑病初发病时防治一次以后，间隔两周再防治一次。

实例6

生防菌剂Lx-11防治水稻细菌性条斑病的防治效果

水泥池试验和田间小区试验结果表明，生防菌剂Lx-11(500ml/亩)对水稻细菌性条斑病的防治效果与常用化学药剂叶枯唑高剂量(50g/亩)的防治效果相同，显著好于叶枯唑低剂量(25g/亩)的防治效果；用一半剂量生防菌剂Lx-11(250ml/亩)与低剂量(25g/亩)的叶枯唑进行复配，其防治效果与叶枯唑高剂量(50g/亩)的防治效果相同(参见表1)。

表1

处理	剂量	水泥池试验防效％	田间小区试验防效％
				叶枯唑(高)	50g/667m²	55.5A	50.3A
叶枯唑(低)	25g/667m²	43.7B	36.8B
				LX-11	500ml/667m²	50.2A	52.0A
LX-11+叶枯唑	250ml+25g/667m²	52.7A	53.1A

2010年发酵生产生防菌剂Lx-11两吨，在水稻细菌性条斑病老病区泗阳县李口镇推广应用面积4000亩，水稻条斑病得到有效控制，全镇稻田没有一块田水稻条斑病为害成灾。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求限定的范围，在本专利的启示下，结合本领域的基本常识，将所述菌株用于水稻细菌性条斑病的防治中，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3789，该菌株的16S rRNA登录在GenBank上，登录号为HQ179100。

2.一种如权利要求1所述菌株的应用，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌菌株用于防治水稻细菌性条斑病。

3.根据权利要求2所述菌株的应用，其特征在于：所述的将解淀粉芽孢杆菌菌株用于防治水稻细菌性病害是指：用解淀粉芽孢杆菌菌株制备生防菌剂，在水稻细菌性条斑病发病初期，将生防菌剂的稀释液均匀地喷在水稻叶面防治水稻细菌性病害；所述的稀释液中生防菌剂与水的稀释的体积比为1∶100。

4.根据权利要求2所述菌株的应用，其特征在于：所述的将解淀粉芽孢杆菌菌株用于防治水稻细菌性病害是指：用解淀粉芽孢杆菌菌株制备生防菌剂，将生防菌剂与叶枯唑复配，在水稻细菌性条斑病发病初期，将生防菌剂与叶枯唑的复配剂稀释液均匀地喷在水稻叶面防治水稻细菌性病害；所述的生防菌剂与叶枯唑复配是指：用100ml生防菌剂与1g叶枯唑复配；所述的稀释液中复配剂与水的稀释的体积比为1∶100。

5.根据权利要求3或4所述菌株的应用，其特征在于：所述的稀释液中还添加了助剂有机硅，所述助剂有机硅与稀释液的体积比为1∶5000。

6.根据权利要求3或4所述菌株的应用，其特征在于：所述的生防菌剂是将解淀粉芽孢杆菌菌株在YPGA斜面培养基上活化、移入YPG培养液中培养、通过发酵培养基发酵培养获得生防菌剂，生防菌剂的含菌量至少为10⁹pfu/mL；获得生防菌剂的具体步骤是：

d)将发酵菌种按接种量1∶10-20倍的比例接种于发酵罐中的发酵培养基中发酵培养，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵液菌体4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量、测定发酵液的酸碱度，当发酵罐中发酵液中的芽孢含量大于或等于90％后，立即将发酵液出罐，进行分装，获得生防菌剂；发酵罐中发酵时间为24～36小时；

所述的YPGA培养基的配方为：酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，琼脂17.0g，水1000ml，pH6.8～7.2；所述的YPG培养液的配方为：胰蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，水1000ml，pH6.8～7.2；所述的发酵培养基配方为：大豆粉1.0％，豆饼粉2.0％淀粉0.5％，酵母膏0.2％，玉米浆0.22％，NaCl 0.1％，Ca(HCO₃)₂0.18％，余量为水，pH7.0～7.2。

7.根据权利要求6所述菌株的应用，其特征在于：

所述的YPGA培养基是这样配制的：称取标准量的酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖和琼脂放入1000ml水中，加热溶化、充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管中的装量为试管的1/5～1/6，用塞子塞好试管口，121℃湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；

所述的PYG培养液是这样配制的：称取标准量的胰蛋白胨、酵母膏、葡萄糖放入1000ml中，充分混匀后将pH调整至6.8-7.2，1000ml三角瓶中装量为1/3～1/4，用塞子塞好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用；

所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐或发酵罐中加入所需的水，按比例加入大豆粉、豆饼粉、淀粉、酵母膏、玉米浆、NaCl、Ca(HCO₃)₂后放入种子罐或发酵罐，充分搅拌，将发酵培养基pH调整到7.0～7.2，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

8.根据权利要求6所述菌株的应用，其特征在于：在种子罐或发酵罐的发酵中，出现较多泡沫时，应该加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。