CN105176889A

CN105176889A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN105176889A
Application number: CN201510702202.5A
Authority: CN
Inventors: 刘洪亮; 王慧; 于琳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2015-12-23

Abstract

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明的目的是要解决现有防治玉米大斑病中化学药剂对环境污染，病菌易产生抗药性，且对玉米增产效果不好的问题。本发明的一株解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)KB1-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年09月12日，保藏编号为CGMCC？No.9649。本发明的应用是指在抑制玉米大斑病菌的同时增加玉米产量上的应用。本发明对玉米大斑病的防效为80.8％，玉米增产率为18.26％。本发明应用于农业领域。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

玉米大斑病又称条斑病、煤纹病、枯叶病、叶斑病等。主要为害玉米的叶片、叶鞘和苞叶。叶片染病先出现水渍状青灰色斑点，然后沿叶脉向两端扩展，形成边缘暗褐色、中央淡褐色或青灰色的大斑。后期病斑常纵裂。严重时病斑融合，叶片变黄枯死。潮湿时病斑上有大量灰黑色霉层。下部叶片先发病。在单基因的抗病品种上表现为褪绿病斑，病斑较小，与叶脉平行，色泽黄绿或淡褐色，周围暗褐色，有些表现为坏死斑。

玉米大斑病的防治方法主要有种植抗病品种、加强农业防治和药剂防治。药剂防治方面主要以化学药剂为主，而化学药剂存在污染环境，持效期短，病原菌容易产生抗药性等问题，因此生防微生物的应用是植物病害综合治理的重要手段，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证。

发明内容

本发明的目的是要解决现有防治玉米大斑病中化学药剂对环境污染，对人畜不安全，病菌易产生抗药性，且对玉米增产效果不明显的问题，提供了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。

本发明的一株解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年09月12日，保藏编号为CGMCCNo.9649。

本发明的一株解淀粉芽孢杆菌的应用是指BacillusamyloliquefaciensKB1-01在抑制玉米大斑病菌的同时增加玉米产量上的应用。

本发明从黑龙江省农垦哈尔滨、红兴隆、牡丹江、九三、绥化、北安、宝泉岭七个分局采集玉米根际土壤样品中筛选出BacillusamyloliquefaciensKB1-01，菌落为乳白色不透明，质地皱纹状突起，菌落形状呈念珠状，菌落中间隆起，边缘整齐。BacillusamyloliquefaciensKB1-01的DNA提取采用CTAB法。PCR扩增16SrRNA基因，采取16SrRNA基因的通用引物。PCR扩增产物经纯化后直接进行双向测序。16SrRNA基因序列提交NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)上的BLAST程序分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，最终命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01。

本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01对环境友好，不会使病原菌产生抗药性，另外可通过(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01菌群快速繁殖占领位点，分泌多种抗生物质，可预防多种病害发生；可制备成高效、广谱、无毒、无污染的生态型生防微生物菌剂，该菌剂在玉米上的应用效果表明，通过田间药效测定，抽雄后40d对玉米大斑病的防效为80.8％，显著高于药剂(多菌灵)对照60.1％，在常规农技措施条件下，玉米喷施微生物菌剂后能够明显促进玉米植株生长和穗产量的提高，减少突尖率，与喷施空白对照相比穗长、行粒数和百粒重分别增加1.4cm、1.8、2.4g，玉米增产率为18.26％。在使用该菌剂14d，第二次14d，抽雄后20d，抽雄后40d，对玉米大斑病的防治效果良好，说明该菌剂持效期长。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株解淀粉芽孢杆菌为BacillusamyloliquefaciensKB1-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年09月12日，保藏编号为CGMCCNo.9649。

本实施方式从黑龙江省农垦哈尔滨、红兴隆、牡丹江、九三、绥化、北安、宝泉岭七个分局采集玉米根际土壤样品中筛选出解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01，菌落为乳白色不透明，质地皱纹状突起，菌落形状呈念珠状，菌落中间隆起，边缘整齐。BacillusamyloliquefaciensKB1-01的DNA提取采用CTAB法。PCR扩增16SrRNA基因，采取16SrRNA基因的通用引物。PCR扩增产物经纯化后直接进行双向测序。16SrRNA基因序列提交NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)上的BLAST程序分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，最终命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01。

本实施方式解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01通过田间药效测定，对玉米大斑病的防效为80.8％，显著高于药剂(50％多菌灵)对照60.1％，对玉米增产率为18.26％。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：该菌每1升发酵培养基的组分含量为：葡萄糖0.1％、黄豆粉0.4％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.05％、磷酸二氢钾0.12％、硫酸镁0.024％和余量的水；发酵条件为：温度32℃，pH7.0～7.2，转速170r/min，培养时间48h，接种量2％。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式的一株解淀粉芽孢杆菌的应用是指解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01在防治玉米大斑病菌的同时增加玉米产量上的应用。

本实施方式解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01对环境友好，不会使病原菌产生抗药性，另外可通过(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01菌群快速繁殖占领位点，分泌多种抗生物质，可预防多种病害发生；可制备成高效、广谱、无毒、无污染的生态型生防微生物菌剂，该菌剂在玉米上的应用效果表明，通过田间药效测定，抽雄后40d对玉米大斑病的防效为80.8％，显著高于药剂(多菌灵)对照60.1％，在常规农技措施条件下，玉米喷施微生物菌剂后能够明显促进玉米植株生长和穗产量的提高，减少突尖率，与喷施空白对照相比穗长、行粒数和百粒重分别增加1.4cm、1.8、2.4g，玉米增产率为18.26％。在使用该菌剂14d，第二次14d，抽雄后20d，抽雄后40d，对玉米大斑病的防治效果良好，说明该菌剂持效期长。

具体实施方式四：本实施方式解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01的筛选方法为：从黑龙江省农垦哈尔滨、红兴隆、牡丹江、九三、绥化、北安、宝泉岭七个分局采集玉米根际土壤样品15份。

将从采集的土样自然风干。每份土样称取10g，放入盛有90ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后用无菌水进行梯度稀释后涂布PDA平板，于25℃培养箱内培养24h左右，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

以玉米大斑病菌为靶标菌，采用平板对峙法筛选所分离的细菌。将供试病原真菌菌饼(7mm)移至平板中央,，在距离细菌两侧25mm处，划线接种拮抗菌，以只接病原菌为对照，每处理3皿。置于25℃培养箱培养4～6天，选出1182株对靶标菌生长有抑制作用的菌株进入复筛。每个菌株4次重复，同样的方法培养并测量抑菌圈半径(细菌菌落中心至病原菌菌丝边缘)的大小，筛选出抑菌圈半径较大，被抑病原菌丝边缘平齐且拮抗作用持久的菌株，通过复筛，得到菌株KB1-01，其平均抑菌带为12.8mm，抑菌率达到81.91％。

采用平板对峙生长法培养之后，菌株KB1-01对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、马铃薯早疫病菌、番茄枯萎病菌、禾谷镰刀菌尖孢镰刀菌和链格孢的抑制作用如表1所示，由表1可知，菌株KB1-01对不同的病原真菌表现出广谱的拮抗作用，但菌株KB1-01对不同病原菌表现出的拮抗强度有所差别，这可能是由于不同的病原真菌的菌丝体构造等有所不同所造成的。

表1

筛选得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01的细胞形态和理化实验结果如表2所示：

表2

对筛选得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01进行分子鉴定，按以下方法进行：

采用CTAB方法提取菌株KB1-01的DNA；采用通用引物对KB1-01的DNA进行扩增和测定；PCR产物纯化后进行测序，经测序，待鉴定的样品16SrDNA片段大小为1382bp(如序列表SeqIDNo：1所示)。将此序列与NCBI数据库中的数据进行序列同源性比对，发现该菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的亲缘关系最近，最终命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01。

对本实施方式的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01在抑制玉米大斑病菌的同时增加玉米产量上的功能性验证：

试验1、检测解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01的抑制玉米大斑病菌以及增加玉米产量上的能力：

以解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01的发酵液制备解淀粉芽孢杆菌剂，其中解淀粉芽孢杆菌发酵液的有效活菌数≧5亿/毫升，芽孢率≧90％，菌剂其他成分包括：0.02％硫酸锌，0.02％硼酸，0.1％吐温20。其中制备解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01发酵液的发酵培养基每1升的组分含量为：葡萄糖0.1％、黄豆粉0.4％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.05％、磷酸二氢钾0.12％、硫酸镁0.024％和余量的水；发酵条件为：温度32℃，pH7.0～7.2，转速170r/min，培养时间48h，接种量2％。

通过两年的田间药效试验测定解淀粉芽孢杆菌剂防治玉米大斑病施用剂量，测定其防治效果及对玉米产量的影响。观察不同处理对玉米出苗及出苗时间有没有影响；调查玉米的发病率，苗期调查各处理间的生长性状、长势等试验田为玉米多年重茬地块。施药时期为玉米大斑病发病初期7-8叶期，间隔10-14d，进行第二次用药，用药量1.5～1.75kg/公顷。

采用随机区组设计，试验采用大区对比法，二次重复，垄距1.1米，行长15米，5垄区，每处理面积165平方米，成熟期每处理取中间两行连继取5平方米，进行考种，实收测产。

试验地属草甸黑土，施肥比例：为N:P:K＝20:17:6,种肥磷酸二铵4kg/亩，深施肥磷酸二铵10.48kg/亩，尿素4.6kg/亩，硫酸钾6kg/亩，追肥：尿素10公斤/亩，试验品种德美亚2号，设计垧保苗9万株，田间管理：深松一次，中耕一次，化学除草，玉米苗期用550/升硝磺·莠去津悬浮剂133毫升/亩，兑水10公斤/亩茎叶处理。

KB1-01的500倍液的配制方法为解淀粉芽孢杆菌剂与水按质量比1:500的比例混合；KB1-01的1000倍液配制方法为解淀粉芽孢杆菌剂与水按质量比1:1000的比例混合；KB1-01的2000倍液配制方法为解淀粉芽孢杆菌剂与水按质量比1:2000的比例混合。

2014年田间药剂试验结果表明(表3)：通过对解淀粉芽孢杆菌剂不同剂量田间药效测定，KB1-01的500倍液对玉米大斑病防治效果最好防效为80.8％，显著高于药剂(多菌灵)对照60.1％。增产效果为18.26％。

表3

通过上述试验可知，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01对环境友好，持效期长，不会使病原菌产生抗药性，并通过田间药效测定，对玉米大斑病的防效为80.8％，显著高于药剂(多菌灵)对照60.1％，玉米增产率为18.26％。另外可通过BacillusamyloliquefaciensKB1-01菌群快速繁殖占领位点，分泌多种抗生物质，可预防多种病害发生；可以制备高效、广谱、无毒、无污染的生态型生防微生物制剂。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于它为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年09月12日，保藏编号为CGMCCNo.9649。

2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于该菌每1升发酵培养基的组分含量为：葡萄糖0.1％、黄豆粉0.4％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.05％、磷酸二氢钾0.12％、硫酸镁0.024％和余量的水；发酵条件为：温度32℃，pH7.0～7.2，转速170r/min，培养时间48h，接种量2％。

3.如权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01在防治玉米大斑病菌的同时增加玉米产量上的应用。