CN113549570B - 罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂、微生物菌肥及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂，其中，拮抗细菌包括贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisTYX‑2，保藏号为CGMCC NO.22553；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisTYX‑3，保藏号为CGMCC NO.22554；解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensTYX‑4，保藏号为CGMCC NO.22552。本发明还公开了所述罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的应用及应用方法，以及包含所述土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥及其应用方法。所述罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂，对罗汉果根腐病和白绢病的防治效果十分明显。

Description

罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂、微生物菌肥及应用

技术领域

本发明涉及微生物组合物及其应用，尤其涉及罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂及其应用。本发明还涉及包含该土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥。

背景技术

罗汉果(Siraitiagrosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)为葫芦科罗汉果属多年生草质藤本宿根植物，是广西著名特产，2003年被广西确定为优势农产品得以重点发展。近年来罗汉果在广东、湖南、江西、福建、贵州、云南、浙江等省的种植面积也在迅速扩大，成为一项很有发展前景的产业。随着罗汉果产业的迅速发展，罗汉果种植面积不断扩大，因而从原来以山地种植为主发展为大面积平地种植。但在平地种植后，一些在山地果园发生危害轻的土传病害如罗汉果白绢病、根腐病和青枯病等发生危害不断加重，对平地罗汉果生产构成严重威胁。目前，对于土传病害主要采用轮作倒茬方法和化学农药进行防治。但由于土地资源有限以及化学农药防效不理想，容易造成环境污染，不符合农业可持续健康发展的要求。而且化学农药的使用容易造成罗汉果产品特别是罗汉果甜苷中农药残留超标，对罗汉果甜苷的出口创汇造成极大风险。利用拮抗微生物防治作物土传病害，不仅从源头上能有效防治土传病害，也是一种符合微生态原理的安全可靠的方法。利用拮抗微生物防治作物土传病害，还有防治成本低、环境友好和无农药残留等优点，已成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点，具有广阔的应用前景。因此，开展利用生防菌防治罗汉果土传病害的研究，对促进罗汉果产业的健康可持续发展具有深远意义。

发明内容

本发明目的之一是提供罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂，所述拮抗细菌包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TYX-2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TYX-4。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TYX-2的保藏号为CGMCC NO.22553。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3的保藏号为CGMCC NO.22554。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TYX-4的保藏号为CGMCCNO.22552。

所述土壤拮抗细菌制剂中含拮抗细菌总数>1×10⁹个/g。

作为本发明的一个实施例，所述土壤拮抗细菌制剂由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)TYX-2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TYX-4按1:1:1比例混合后进行固体发酵而得。

本发明另一目的是提供所述罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的应用。

具体地，提供所述罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂在制备微生物菌肥中的应用。

本发明另一目的是提供所述罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的应用方法。

具体地，所述罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的应用方法，取土壤拮抗细菌制剂稀释后在罗汉果土传病害发生前15天进行灌根处理。

本发明的另一个目的是提供包含所述土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥。

具体地，所述包含所述土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥，拮抗细菌有效活菌数>3×10⁷个/g。

进一步地，所述微生物菌肥中，以干基计，有机质质量分数>60％，总养分质量分数>5％。

所述总养分包括氮、五氧化二磷和氧化钾。

本发明另一目的是提供所述包含所述土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥的应用方法。

具体地，所述包含所述土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥的应用方法，在罗汉果苗移栽时，先在定植坑中施入混合微生物菌肥0.5kg，与土混合均匀，然后将罗汉果苗定植于混有微生物菌肥的定植坑中。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TYX-2已于2021年5月18日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22553，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis TYX-2，地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3已于2021年5月18日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22554，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TYX-3，地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TYX-4已于2021年5月18日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22552，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens TYX-4，地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了3株拮抗细菌菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TYX-2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TYX-4，构成罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂，对罗汉果根腐病和白绢病的防治效果十分明显，接种15d后处理组叶片依然呈翠绿色，而对照组叶片都已发黄。对罗汉果根腐病的防效为82.95％，对罗汉果白绢病的防效为79.61％。

附图说明

图1是5株土壤拮抗细菌对罗汉果病原真菌的拮抗作用；

A-E分别为TYX-4、TYX-2、TYX-3、TYX-7和TYX-8对根腐病菌的抑制效果；G～K分别为TYX-4、TYX-2、TYX-3、TYX-7和TYX-8对白绢病菌的抑制效果；F为根腐病菌对照，L为白绢病菌对照。

图2是5株土壤拮抗细菌的菌落形态和菌体革兰氏染色；

由A～E依次为：TYX-2、TYX-3、TYX-4、TYX-7、TYX-8。

图3是5株土壤拮抗细菌间拮抗反应；

图中第一排从左到右两两对抗的菌株分别为TYX-2与TYX-3，TYX-2与TYX-4，TYX-2与TYX-7，TYX-2与TYX-8；第二排从左到右两两对抗的菌株分别为TYX-3与TYX-4，TYX-3与TYX-7，TYX-3与TYX-8；第三排从左到右两两对抗的菌株分别为TYX-4与TYX-7，TYX-4与TYX-8，TYX-7与TYX-8。

图4是3株土壤拮抗细菌(TYX-2、TYX-3、TYX-4)对罗汉果根腐病和白绢病的盆栽防效；

A：接病原菌前；B：施药15d后；C：施药15d后CK组；D：施药15d后处理组。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明。

1.土壤拮抗细菌菌株的分离和筛选

(1)拮抗细菌菌株的分离

将10g采自患病果园健康罗汉果植株根区的土壤样品放入250mL灭菌三角瓶中，加入90mL无菌水，将三角瓶置于200r/min、37℃摇床上震荡20min，制成土壤悬浮液。然后用无菌水将土壤悬浮液稀释成10^-3、10^-4、10^-5和10^-64个系列浓度。分别吸取100μL土壤悬浮液稀释液用涂布法接种于牛肉膏平板培养基上，每个浓度重复3次。接种平板置于30℃培养箱中培养24h-48h，挑取不同单菌落进行平板划线纯化。纯化后的菌株保存于4℃冰箱备用。

通过采用稀释涂布法和划线法对土壤拮抗细菌进行分离纯化，从罗汉果根区土壤中共分离出144株细菌。

(2)拮抗细菌菌株的活性筛选

采用平板对峙法进行拮抗活性测定。在无菌操作台内用直径为4mm的打孔器在培养3d的病原真菌菌落边缘打取菌饼，用无菌接种针将菌饼接种于PDA平板中央(使有菌丝的一面贴在培养基平板上)，同时在病原真菌菌饼两侧2.5cm处用接种环取拮抗细菌菌液划2条平行线。对照组只接种病原真菌。每个处理重复3次。28℃培养7d，测量病原真菌菌落的短直径，按下式计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落短直径)÷(对照菌落直径-0.4)×100

以罗汉果根腐病菌和白绢病菌为供试病原菌，采用平板对峙法对分离出的土壤细菌菌株进行抗菌活性测定，结果见表1和图1。从144株细菌中共筛选出有拮抗活性的细菌22株，其中5株细菌对2种病原真菌均有明显拮抗作用，分别为TYX-2、TYX-3、TYX-4、TYX-7和TYX-8菌株，他们对罗汉果根腐病菌的抑制率分别为67.53％、57.50％、64.17％、60％和66.67％，对罗汉果白绢病菌的抑制率分别为83.03％、87.58％、53.31％、82.27％和86.67％。

表1 22株土壤细菌对2种罗汉果病原真菌的拮抗作用

2.土壤拮抗细菌菌株的鉴定

(1)拮抗细菌的菌落形态特征和生理生化特性

将活化好的菌株用无菌水稀释后，采用划线法接种至LB琼脂平板培养基上，37℃培养48h，观察菌落的生长情况、形态和颜色等特征。生理生化检测方法参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏系统细菌学手册第八版》。

结果见表2与图2。格兰氏染色结果显示5株拮抗细菌均为革兰氏阳性菌。在平板上观察到菌株TYX-2、TYX-7和TYX-8的菌落在LB培养基上为乳白色，形状呈圆形或椭圆形，菌落中间光滑但边缘呈褶皱状。菌株TYX-3在LB培养基上菌落为白色，形状呈不规则圆形，边缘不整齐。菌株TYX-4在LB培养基上菌落为白色，形状呈不规则圆形，菌落中间有明显突起。结合表3生理生化特性测试结果，初步判断5株拮抗细菌均为芽孢杆菌属。

表2 LB琼脂平板上各菌株菌落形态

表3拮抗细菌的生理生化特征

+代表反应为阳性，-代表反应为阴性。

(2)分子鉴定

通过对细菌菌株16S rDNA保守序列(ITS)测序进行分子鉴定。采用细菌通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增。委托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行测序。登录NCBI网站，利用Blast软件将获得的基因序列与GenBank中已知的序列进行同源性比对分析，选择同源性相近的序列进行系统进化分析。序列先进行多重比对，然后用MEGA 6软件采用邻接法(Kimura's2-parameter模型，bootstrap 1000)构建系统发育树，明确拮抗细菌株的系统发育地位。

将5株细菌的16S rDNA分子测序结果经过MEGA6.0软件对相近序列构建系统发育树后发现，菌株TYX-2(登录号MW019947)经过BLAST对比后显示与编号为MT626060.1的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezia)相似度为99.91％。菌株TYX-3(登录号MW019964)经过BLAST对比后显示与编号为KP184705.1的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相似度为99.69％。菌株TYX-4(登录号MW019964)经过BLAST对比后显示与编号为KF836523.1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)相似度为100％。TYX-7与编号为MT645702.1159-1283的贝莱斯芽孢杆菌相似度达到99.92％，TYX-8与编号为CP054714.1的贝莱斯芽孢杆菌相似度达100％。因此确定TYX-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，TYX-4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，TYX-2、TYX-8和TYX-7均为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezia)。

菌株TYX-2的16S rDNA序列系统发育树：

菌株TYX-3的16S rDNA序列系统发育树：

菌株TYX-4的16S rDNA序列系统发育树：

菌株TYX-7的16S rDNA序列系统发育树：

菌株TYX-8的16S rDNA序列系统发育树：

3.3株土壤拮抗细菌之间的拮抗作用测定

为了将几株拮抗细菌混合应用，必须首先弄清这几种拮抗细菌间是否有拮抗作用，因此需要进行拮抗细菌株间的拮抗试验。将拮抗效果明显的菌株TYX-2、TYX-3、TYX-4、TYX-7和TYX-8悬液分别两两交叉划线于牛肉膏固体培养基表面，若交叉点细菌不生长或生长较差，则说明这两株细菌有拮抗作用。若两株细菌生长良好，且菌株交叉点处无空白，则说明没有拮抗作用。培养36h，定期观察菌株生长情况。

拮抗实验结果见图3。菌株间交叉点均无空白，生长良好，菌株的共生长状态与单独生长状态无差异，说明5株细菌可以混合应用。

4.3种拮抗细菌混合菌剂的制备

方法：

(1)一级种子液的制备：将LB液体培养基装于50mL/250mL三角瓶中，高压灭菌后备用。在超净工作台中将培养好的拮抗细菌TYX-2(贝莱斯芽孢杆菌)、TYX-3(枯草芽孢杆菌)和TYX-4(解淀粉芽孢杆菌)分别用无菌水配成菌液，取2mL菌液接入高压灭菌后的LB液体培养基中。35℃、150r/min摇床中振荡培养12h，制备成一级种子液。

(2)二级种子液的制备：在超净工作台内将已灭菌的移液枪吸取生长对数期的3种一级种子液分别接种到三角瓶中的LB种子液培养基中。恒温震荡培养。最佳培养条件为：装液量为200mL/500mL，接种量为4％，培养温度为35℃，培养时间为20h。

(3)固体发酵

利用底部直径为10cm、高为8cm的圆筒形塑料盒进行固体发酵。

固体发酵培养基配方及配制：豆粕+麦麸(1:1)80％，玉米粉5％，菜籽粉5％，葡萄糖6％，蛋白胨2％，酵母粉1％，磷酸二氢钾1％。培养基含水量为80％。将培养基混合拌匀，装盒，培养基装盒厚度为2.5cm。将装料塑料盒在115℃灭菌30min，冷却后备用。

将培养好的3种细菌二级种子液按1:1:1比例混合，接种到固体培养基中，接种量为培养基重量的12.5％。在温度为40℃下发酵48h后，出曲。将固体发酵产物在40℃烘干，烘干后的样品用产热量较低的切割式研磨仪粉碎，测定总细菌数和有效活菌数，符合要求后得到3种细菌的混合菌剂，即土壤拮抗细菌制剂。

结果：采用血球板计数法测定了混合菌剂的拮抗细菌总数，采用平板涂布培养计数法测定了混合菌剂的活菌数。结果表明该混合菌剂拮抗细菌总数为2.68×10⁹个/g，活菌数为2.04×10⁸个/g。

5.3种拮抗细菌微生物菌肥的制备

将以牛粪为主要原料制成的腐熟有机肥敲碎，过8目不绣钢筛网，以1％(1g菌剂/100有机肥)的比例添加混合菌剂，混合均匀，进行二次发酵。发酵结束后阴干至含水量为30％以下。经含菌量和活菌量检测，符合要求后进行计量、包装，得到微生物菌肥产品。

结果：采用平板涂布培养计数法测定了混合菌剂的活菌数。结果表明该微生物菌肥产品中拮抗细菌有效活菌数为3.52×10⁷个/g。

6.3种拮抗细菌混合菌剂防治罗汉果土传真菌病害的盆栽药效试验

病原菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝4mm打孔器从培养3d后的菌落边缘打取5块菌饼，放入装有PDA液体培养基的200/500mL三角瓶中，在25℃，180r/min条件下培养7d后备用。

将罗汉果苗种植在18cm×18cm大小的培养盆中，培养25天左右用于盆栽试验。采用灌根法接种拮抗细菌和病原菌，先将10g混合菌剂兑水200mL混匀，均匀倾注入植株根部，接拮抗细菌混合菌剂3天后再以同样方法接种病原菌。共施拮抗细菌2次，间隔7天施一次。以只接病原菌而不接拮抗细菌为对照。每个处理设3次重复，每个重复10株罗汉果苗。在对照罗汉果苗出现病害症状时开始调查发病植株数和病害程度，隔5d调查1次，共调查3次。

罗汉果植株病情分级标准：0级整株叶片健康，主蔓基部无病灶；1级植株下层少数叶片出现病害症状，主蔓基部无病灶；3级植株上下层均有叶片感病，主蔓基部无病灶；5级植株长势变差，叶片失绿，无落叶或有少量落叶，主蔓基部局部出现病害症状；7级植株大量落叶，主蔓基部变黑腐烂，植株枯死。计算公式：

死亡率(％)＝死亡植株数÷总株数×100

病情指数＝Σ(各病级株数×病级数)÷(最高病级×总株数)×100

防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)÷对照病情指数×100

3株拮抗细菌混合菌剂对罗汉果土传病害根腐病与白绢病的防治效果见表4和图4。接种拮抗细菌对罗汉果根腐病和白绢病的防治效果十分明显，接种15d后处理组叶片依然呈翠绿色，而对照组叶片都已发黄。30天后处理组根腐病死亡率为0％，白绢病死亡率为3.33％；对照组根腐病死亡率为70.00％，白绢病死亡率为96.67％。

根据病性指数计算出防治效果，结果表明3种细菌混合菌剂对2种罗汉果土传病害具有明显的防治效果，对罗汉果根腐病的防效为82.95％，对罗汉果白绢病的防效为79.61％。

表4 3株拮抗细菌混合菌剂对罗汉果根腐病和白绢病的盆栽防效(30天)

序列表

<110> 广西师范大学

桂林吉福思罗汉果股份有限公司

<120> 罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂、微生物菌肥及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (8)

1.罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂，其特征是，所述拮抗细菌包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TYX-2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TYX-4；其中，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TYX-2的保藏号为CGMCC NO.22553，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3的保藏号为CGMCC NO.22554，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TYX-4的保藏号为CGMCC NO.22552。

2.根据权利要求1所述的罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂，其特征是，所述拮抗细菌总数>1×10⁹个/g。

3.根据权利要求1或2所述的罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂，其特征是，由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TYX-2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TYX-3和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TYX-4按1:1:1比例混合后进行固体发酵而得。

4.权利要求1-3任一项所述罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂在制备微生物菌肥中的应用。

5.包含权利要求1-3任一项所述的罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥，其特征是，所述土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥中所述拮抗细菌有效活菌数>3×10⁷个/g。

6.根据权利要求5所述的罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥，其特征是，所述微生物菌肥中，以干基计，有机质质量分数>60％，总养分质量分数>5％。

7.根据权利要求6所述的罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥，其特征是，所述总养分包括氮、五氧化二磷和氧化钾。

8.权利要求6或7所述的罗汉果土传病原菌的土壤拮抗细菌制剂的微生物菌肥的应用方法，其特征是，在罗汉果苗移栽时，先在定植坑中施入混合微生物菌肥0.5kg，与土混合均匀，然后将罗汉果苗定植于混有微生物菌肥的定植坑中。

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