CN105936880A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，该菌株被命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HH‑1，保藏编号为CCTCC M2015640。本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌的菌剂及其制备方法，该解淀粉芽孢杆菌菌剂对水稻稻瘟病、立枯病有稳定、高效的防治效果。该解淀粉芽孢杆菌具有广谱抑菌活性，能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域：本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640及其在水稻立枯病、稻瘟病防治方面的应用。
背景技术：
水稻是我国主要粮食作物之一，我国大部分地区均有水稻种植，水稻种植农户超过1亿户，以水稻作为主食的人口占60％以上，大约有19个省(市)以水稻作为主要的食品。水稻生产在我国粮食生产上具有重要的地位。但是农业用地随着世界人口的增加而减少，环境也因经济的快速发展而遭到破坏，导致粮食安全问题日益严重。因此，提高水稻的产量是保证国家粮食生产的重要措施之一。
世界性水稻病害—稻瘟病[Magnaporthe grisea(Hebert)Barr.]是由子囊菌引起的植物真菌病害，根据发病时期和发病部位的不同可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗瘟、谷粒瘟等，其中以叶瘟、穗颈瘟最为常见，危害较大。由于它分布广泛，凡种植地区都有发生的情况，严重时可造成绝产，它已成为影响我国水稻生产的最主要病害之一，因而对稻瘟病进行防治具有十分重要的意义。
水稻立枯病是水稻旱育秧最主要的病害之一，从出苗到插秧的整个育秧阶段均可发生，但离乳期发病最重。病苗叶无露珠，新叶或上叶片打绺，根少暗黄无新根，茎基部逐渐黄枯，软化至腐烂，苗提取时与种子分离。一旦发病很难防治，近几年，东北寒地稻区旱育苗发生较重，轻者成撮成片发生，重者幼苗全部死亡。
目前，化学防治作为水稻病害最主要的防治措施之一，具有见效快、成本低、使用方便、多病兼治等优点，缺点在于长期以来对其大量、不合理的使用，会导致防效降低，其高毒、高残留的特性不仅对人、畜的健康造成危害，而且对土壤、水、大气造成严重污染，破坏生态平衡。
随着国家和社会对国民健康、食品安全、环境污染的日益关注，有机磷农药的使用在各国都受到了不同程度的限制，高效、低毒、低残留的生物农药成为农药产业的主要发展方向。与化学农药相比，生 物农药具有安全、高效、不杀害天敌、环境友好等优点，其不仅可以替代传统化肥，为植物提供养分，而且具有促生、提高植物抵御不良环境、拮抗病原微生物从而减少化肥农药使用量等作用，其不可估量的应用价值体现在促进作物增产、预防作物生物灾害、控制生态可持续、生产无污染无公害的绿色食品及减轻农民负担等方面。生物农药有着难以替代的优势，拥有巨大的发展空间，是绿色和有机食品生产不可或缺的生产资料，对促进农业增效和农民增收发挥着不可替代的作用。因此，发展生物农药产业对保障我国粮食和食品安全、提升我国农产品的国际竞争力具有重要意义。
目前，防治水稻稻瘟病、立枯病的有益微生物类群主要有放线菌、真菌、细菌等，目前用于生物防治的细菌主要有芽孢杆菌和假单胞菌，芽孢杆菌是近年来科研工作者研究的热点。
芽孢杆菌中用于防治水稻稻瘟病、青枯病的种类已经报道的主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。彭化贤等利用水稻根际分离获得的蜡样芽孢杆菌Ma-32和枯草芽孢杆菌Xi-55，进行田间防效试验，连续两年防效均为50％以上。穆常青等研究发现，芽孢杆菌浓度在1×108cfu/mL时，对穗颈瘟的防效达57.2％，增产率达9.6％。高学文等研究发现，枯草芽孢杆菌B2菌株产生的胞外物质，对小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长均具有抑制作用。朱桂梅，陈宏州等，利用短小芽孢杆菌TW-2菌株对水稻穗颈瘟进行防治，结果表明：TW-2不仅对稻瘟病菌具有强烈的抑制作用，对穗颈瘟的防效也达到80％以上。
目前，国内利用解淀粉芽孢杆菌防治稻瘟病、立枯病的研究较少。陈成等研究发现，解淀粉芽孢杆菌HN-06的代谢产物经分离纯化后，对稻瘟病菌具有显著的抑菌作用。在已报道的解淀粉芽孢杆菌防治稻瘟病的研究中，对于实验室抑菌效果的研究较多，但对于田间防治效果、实际生产应用的研究较少。所以，出于本领域中还仍旧存在对水稻稻瘟病、立枯病具有广谱且高效的防效、能够有效增产的新的解淀粉芽孢杆菌菌株的需要。需要改进筛选方式，获得大量有益菌，并对菌株的田间防治效果进行充分验证，对其实际生产应用潜力进行准确评估与大力开发。
发明内容：
本发明在于克服背景技术中存在的问题，而提供一种解淀粉芽孢杆菌。该解淀粉芽孢杆菌，能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用。
本发明解决其问题可通过如下技术方案来达到：一种解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HH-1，保藏编号为CCTCC M2015640。
一种包含解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HH-1的菌剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌体及其代谢产物。
一种解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种的分离：采集水稻根际土壤，从中筛分出一种解淀粉芽孢杆菌HH-1；
(2)种子液的制备：用接菌环挑取HH-1菌株接入装有LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养36h至培养液中有效活菌数1-2亿/ml。
(3)固体发酵培养基制备：配制好的固体发酵基与水混合均匀，配制成固体发酵培养基，将其分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min，冷却备用。
(4)固体菌剂培养：按10％接种量接入预先培养好的HH-1种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置于37℃培养箱中培养2天。
(5)干燥、粉碎及包装：将上述发酵完的固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于10％，粉碎过筛后，制备成固体粉末状菌剂。
本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用。
本发明菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HH-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015640，保藏日期为2015年10月26日。保藏地址在中国武汉，武汉大学。
本发明解淀粉芽孢杆菌株HH-1形态特征是：菌落淡黄色、形状为规则圆形、表面隆起、干燥；细胞为杆状、产芽孢。
本发明解淀粉芽孢杆(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640生化特性是：可利用葡萄糖，蔗糖、L-阿拉伯胶、D-木糖、 淀粉、乳糖、柠檬酸三钠；不能利用甘油。
本发明解淀粉芽孢杆(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640生长特性是：在LB平板上划线接种，分别在37℃至45℃下培养均生长良好，在50℃下能够生长。
本发明菌株是直接依据实验室离体叶片防效测定结果筛选获得，并经过连续2年不同地点不同水稻品种的田间防效验证，其田间防效稳定，具有较高的实际应用潜力。
本发明与上述背景技术相比较可具有如下有益效果：该解淀粉芽孢杆菌，其菌株是从水稻根际土壤筛选获得，为革兰氏阳性菌，具有广谱抑菌活性，能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。本发明的解淀粉芽孢杆菌菌剂对水稻稻瘟病、立枯病具有更高效的防治作用，且持效期较长，增产效果明显。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例将对本发明作进一步说明：
实施例1：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株的分离
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株的分离：从哈尔滨市方正林业局采集水稻农田土壤样品，称取土壤5g放入装有200mL无菌水的三角烧瓶中，加入玻璃珠，置于30℃摇床中250rpm震荡摇晃30min，使土样与水充分混合。静置待上层澄清后，取10mL上清液，进行10、100、1000倍稀释，取最后三支土样稀释液，置于80℃水浴5-7min后，灭活营养细胞，保留芽孢。然后取稀释液0.1mL涂布于LB固体培养基平板上，每个梯度浓度涂布3个平板，在37℃培养2d后，依据解淀粉芽孢杆菌的主要生物学特征挑取菌落进行个别单独纯化培养。最终获得一株对稻瘟病菌、立枯丝核菌拮抗能力较好的菌株，即解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
该菌株于2015年10月26日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2015640。
上述LB固体培养基的配方为，每升蒸馏水含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为2％的琼脂粉，121℃条件下灭菌20分钟。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株的鉴定
上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640菌株16S rDNA基因的提取。
培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml培养物，6000转/每分钟离心2分钟；沉淀物加入565μl的TE缓冲液，TE缓冲液配方如下：10mmol/l的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/l的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μl质量体积比为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时；加入100μl，5mol/l NaCl，充分混匀，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，所述CTAB/NaCl溶液配方如下：质量体积比为10％的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/l的NaCl中，混匀，于65℃温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000转/每分钟离心5分钟，将上清液转入一个新管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000转/每分钟离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，用一个封口的离心管将沉淀转移至1ml的70％乙醇中洗涤；12000转/每分钟离心5分钟，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于50μl的TE缓冲液。以提取的基因组DNA为模板，利用购自上海博尚生物技术有限公司的真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增，在50μl反应体系依次混匀下列试剂：35μl H2O，5μl 10倍浓度的PCR反应缓冲液，10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下：500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，4μl 25mmol/l MgCl2，1μl 4种dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的基因组DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。加入50μl矿物油再离心5秒钟；将混合物在94℃加热5分钟。94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，总共30个循环。最后一个循环后，于72℃下保温10分钟，使反应混合物扩增充分，得到解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640的16S rDNA的PCR 扩增产物，将产物测序，将测得的菌的基因序列提交到GenBank数据库中，用Blsat进行相关序列搜索，与GenBank数据库中现有的近缘菌株的ITS序列进行对比，并从数据库中获得相关序列。
测序结果：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC M2015640 16S rDNA基因序列长度为1441bp。
解淀粉芽孢杆菌株的生理生化实验测定，结果见表1。根据16S rDNA序列分析结果和生理生化实验测定结果，可判断CCTCC M2015640菌为解淀粉芽孢杆菌。
表1解淀粉芽孢杆菌株HH-1的生理生化实验结果
测定项目 结果 测定项目 结果
接触酶 + 葡萄糖 +
厌氧生长 - 木糖 +
甲基红试验 + 阿拉伯糖 +
硝酸盐还原 + 甘露醇 +
50℃生长 + 乳糖 +
pH5.7生长 + 甘油 -
7％NaCl生长 + 蔗糖 +
淀粉水解 + 发酵葡萄糖产气 -
分解酪素 + 利用柠檬酸盐 +
该菌株已于2015年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015640，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌株固态菌剂的制备方法
按如下步骤进行：
(1)菌种活化：用接种环挑取CCTCC M2015640菌种，将其接种到LB斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养。
(2)种子液的制备：挑取活化后的CCTCC M2015640菌株接入装有100mL的LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用.
(3)固体发酵培养基制备：固体发酵基(玉米粉20％、麸皮20％，米糠40％，菜籽粕20％，按料：水＝1:1混合均匀，配制成固体发酵培养基，将其分装于耐高温的塑料方盒中，120℃灭菌30min，冷却 备用。
(4)固态菌剂培养：按10％接种量接入预先培养好的CCTCC M2015640种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置于37℃培养箱中培养2天，每隔12h搅拌一次。
(5)干燥、粉碎及包装：将上述发酵完的固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于10％，用粉碎机将其粉碎。过筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置于干燥、阴凉处保藏。
(6)采用稀释平板测数法检测样品中芽孢杆菌的活菌数的浓度在2.0×108cfu/mL，符合农用微生物菌剂的要求。
实施例4：解淀粉芽孢杆菌株M2015640菌剂促进植物生长抗病田间效果试验
1.试验地点：试验在黑龙江省大庆市进行，选择地势平坦，肥力一致的田块。
2.供试作物：水稻(垦稻12)
3.供试肥料：本发明实施例3中制备的微生物菌剂，含有效活菌数2.0×108cfu/mL。
4.试验设计：试验设两组处理，每组设有1个对照组(1组加入CCTCC M2015640菌剂，用M2015640表示；第2组加入相同量的未接菌株的培养基，用CK表示)，每个处理三次重复。小区随机排列，小区面积24m2(4m×6m)，行株距25cm×15cm，每亩1.8万穴，每穴4株，基本苗7.2万苗，小区四周打埂，埂宽50cm，上覆薄膜，防止窜水窜肥，区组间挖沟，沟宽1m，试验四周设保护行。各处理组设计如下：
处理一：在育苗期间水稻1叶1心时撒施本菌剂，并接种立枯病菌；CK组只接种立枯病菌。药后7d、15d、25d采用5点取样法调查各小区的病株数，每小区调查500株，计算病株率及防病效果。
处理二：用常规的栽培方式进行肥水管理，水稻剑叶抽出前7天接种稻瘟病菌，随后立即进行第一次撒施本菌剂。到水稻剑叶抽出裂口期是进行第二次撒施。CK组只接种稻瘟病菌。一次施药前调查，一次施药后二次施药前调查，二次施药后调查，田间测产及室内考种。调查方法为每小区取5点，每点定1穴，做好标记，防治叶瘟，施药前调查发病基数，二次施药前和二次施药后10天调查防效；二次施 药后10天及田间测产调查穗颈瘟发病指数。
试验结果表明，施撒本菌剂对水稻立枯病有较好的防效，且持效期较长。试验结果参见表2。
表2M2015640菌剂对水稻立枯病防效效果
经药后定期观察，各处理药剂对旱育秧无药害出现。
试验结果表明，施撒本菌剂对水稻稻瘟病有较好的防效，每亩施用10g该产品，对水稻叶瘟防治效果一般，对水稻穗颈瘟防效达94.9％，较对照空白增产69％，其产量指标穗实粒数、千粒数和结实率明显高于空白，表现为防效好、增产效果明显。试验结果参见表3、表4。
表3本发明菌剂对水稻稻瘟病防效效果
表4测产考种表
该药剂对作物无明显药害症状，对水稻生长安全。在水稻剑叶抽出前7天和剑叶抽出裂口期进行茎叶喷雾，可有效预防水稻穗颈瘟，可作为预防类药剂大面积推广。

Claims (7)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HH-1，保藏编号为CCTCC M2015640。
2.一种包含如权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂，其特征在于：其活性成分为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌体及其代谢产物。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂，其特征在于：所述的菌剂为固态菌剂。
4.一种如权利要求2或3所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）菌种的分离：采集水稻根际土壤，从中筛分出一种解淀粉芽孢杆菌HH-1；
（2）种子液的制备：用接菌环挑取HH-1菌株接入装有LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养36h至培养液中有效活菌数1-2亿/ml；
（3）固体发酵培养基制备：配制好的固体发酵基与水混合均匀，配制成固体发酵培养基，将其分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min，冷却备用；
（4）固体菌剂培养：按10%接种量接入预先培养好的HH-1种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置于37℃培养箱中培养2天；
（5）干燥、粉碎及包装：将上述发酵完的固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于10%，粉碎过筛后，制备成固体粉末状菌剂。
5.根据权利要求4所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制备方法，其特征在于：所述的固体发酵基为玉米粉20%、麸皮20%，米糠40%，菜籽粕20%。
6.一种如权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用。
7.根据权利要求6所述解淀粉芽孢杆菌在防治水稻病害中的应用，其特征在于：所述的水稻病害包括水稻立枯病、稻瘟病。
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