CN106867943A

CN106867943A - 一种用于芽孢杆菌的培养液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106867943A
Application number: CN201710161910.1A
Authority: CN
Inventors: 黄亦存; 尹春林; 罗江龙
Original assignee: Anhui Kang Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Anhui Kang Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2017-06-20

Abstract

本发明公开了一种用于芽孢杆菌的培养液，包括以下质量百分比的组分：碳源1.50‑3.00％、氮源0.30‑1.00％、酵母抽提物或玉米浆粉或蛋白胨0.10‑0.50％、K₂HPO₄或KH₂PO₄ 0.10‑0.30％、MgSO₄·7H₂O 0.02‑0.05％、MnSO₄·H₂O 0.01‑0.02％、NaOH 0.05‑0.10％、消泡剂1.00‑2.00‰、芽孢杆菌种子0.10％‑1.00％、余下为水。本发明还公开了该培养液的制备方法以及防治植物病虫害上的应用。的应用。本发明在非无菌密闭条件下，可实现现场小规模的扩大培养，既提高了使用效果，也降低了生产成本。

Description

一种用于芽孢杆菌的培养液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物肥料与微生物农药技术领域，具体涉及一种用于芽孢杆菌类微生物菌剂的培养液，本发明还涉及该芽孢杆菌培养液的制备方法及其植物病虫害防治上的应用。

背景技术

化学农药大量使用导致食品的农药残留和已经由此造成的环境污染问题，严重威胁人类健康，另外，大量化学农药的使用，容易使害虫和植物病原菌产生抗药性而降低了防效。生物农药因环境友好、无公害、不产生抗性等特点被认为是化学农药较好的替代品。

芽孢杆菌是植物叶表和根际有益微生物，同时还是植物体内常见的内生细菌。芽孢杆菌通过拮抗作用、竞争作用、诱导抗性等机制达到植物病虫害防治、促进植物生长的作用。

当前芽孢杆菌菌剂的使用普遍采用发酵后回收芽孢，制备成各种剂型使用，一方面丢弃了发酵液中产生的对病虫害有效的生物活性物质，而且芽孢的萌发需要一定时间，与现场发酵的微生物菌剂相比，使用效果大大降低；且在加工、储藏及使用过程中有效活菌数也有所降低，后处理过程增加了生产成本。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可实现现场小规模扩大培养的芽孢杆菌培养液及其制备方法和应用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种用于芽孢杆菌的培养液，所述培养液包括以下质量百分比的组分：

碳源1.50-3.00％、氮源0.30-1.00％、酵母抽提物或玉米浆粉或蛋白胨0.10-0.50％、K₂HPO₄或KH₂PO₄ 0.10-0.30％、MgSO₄·7H₂O 0.02-0.05％、MnSO₄·H₂O 0.01-0.02％、NaOH 0.05-0.10％、消泡剂1.00-2.00‰、芽孢杆菌种子0.10％-1.00％、余下为水。

在上述技术方案的基础上，上述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌的一种或多种。

上述碳源为玉米淀粉、可溶性淀粉、蔗糖以及葡萄糖的一种或多种。

上述氮源为豆粕粉、黄豆粉、棉籽粉、鱼粉以及花生粉的一种或多种。

本发明用于芽孢杆菌的培养液的制备方法，包括如下步骤：

1)基础培养液的制备及灭菌处理

称取如下质量百分比的组分：碳源1.50-3.00％、氮源0.30-1.00％、酵母抽提物或玉米浆粉或蛋白胨0.10-0.50％、K₂HPO₄或KH₂PO₄ 0.10-0.30％、MgSO₄·7H₂O 0.02-0.05％、MnSO₄·H₂O 0.01-0.02％、NaOH 0.05-0.10％，将其中的颗粒、粉状料过60目筛，再加入发酵设备中与纯净水混匀后得到基础培养液；然后将1.00-2.00‰消泡剂加入发酵设备中，加热培养液至100℃后，保温30min，降温至80℃备用；

2)芽孢杆菌种子热处理

将0.10％-1.00％的芽孢杆菌种子加到上述冷却到80℃的培养液中，加热处理5-30min后，再通气降温至30℃-42℃；

3)现场培养

对步骤2)所得液体通压缩空气进行培养，培养条件为通气量0.4-1.5vvm，温度30-42℃，培养时间24-28h，得培养液后直接稀释应用或在4℃温度下储藏，即得到芽孢杆菌培养液。

本发明芽孢杆菌培养液在应用于水稻稻瘟病、豇豆立枯病和西瓜枯萎病的防治时，将现场培养得到的芽孢杆菌培养液以自来水稀释100-300倍后，按每亩50-100kg量喷雾或灌溉，在植物的生长期每隔7-15天使用一次。

当上述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌时，现场培养得到的解淀粉芽孢杆菌以自来水稀释100-300倍后，按每亩50-100kg量喷雾，在植物的生长期每隔10-15天使用一次。

当上述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌时，现场培养得到的枯草芽孢杆菌培养液以自来水稀释100-200倍后，按每亩60-80kg量喷雾或灌溉，在植物的生长期每隔10-15天使用一次。

当上述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌时，现场培养得到的地衣芽孢杆菌以自来水稀释200-300倍后喷雾或灌溉，在植物的生长期每隔10-15天使用一次。

本发明的积极效果是：

1、培养条件简单：对培养设备要求不高，只需具有加热功能的简易移动发酵设备和通气装置，便可实现繁殖培养，方便现场使用。

2、本发明无需预先对培养用的芽孢杆菌种子进行活化及对种子较为严格的无菌保存；对液体培养基、种子处理方式可杀灭培养系统中的非芽孢杂菌，同时提高了芽孢萌发率及芽孢活力。

3、本发明优化的芽孢杆菌培养基可将实现芽孢杆菌生物量提升近100-500倍高达1×10¹⁰CFU/ml，且为芽孢杆菌营养体和芽孢的混合状态，发酵液中产生的活性物质和微生物菌体同时使用，使用效果得到显著提升。

与传统技术相比，本发明的优点在于在非无菌密闭条件下，可实现现场小规模的扩大培养，既提高了使用效果，也降低了生产成本。在农业微生物菌剂、微生物农药、环保微生物菌剂的现场培养方面具广阔的应用前景。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练入员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。除非另外说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其应用

1、制备方法如下：

培养前清洗设备，用自来水清洗发酵罐及其配件至无培养物残留。取2.00％可溶性淀粉，1.00％大豆蛋白粉，0.50％酵母粉，0.30％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.02％MnSO₄·H₂O，0.08％NaOH加入到扩培罐中配制基础培养液，再加入1.00‰消泡剂，补水至140L。将培养液加热至100℃后热处理30-60分钟，然后降温至80℃后，将1.00％解淀粉芽孢杆菌种子加到培养液中热处理30min后，通气降温至35℃。

对上述所得液体通空气进行培养，培养条件为通气量约0.8-1.0vvm，温度32℃，培养时间36-48h，得培养液在4℃温度下储藏备用，所述培养液处于芽孢和营养体混合状态，发酵液中无致病菌和其他污染菌检出，生物量增加近100倍达1.0×10⁹CFU/ml。

本实施例使用的解淀粉芽孢杆菌种子为陕西先农生物科技有限公司生产，登记证号：D20160356，有效成分为解淀粉芽孢杆菌B7900，含量为1.0×10⁹CFU/g的可湿性粉剂。

2、解淀粉芽孢杆菌培养液在防治水稻稻瘟病的应用

使用时兑自来水稀释200倍，按照每亩80kg量喷雾。每隔10天喷雾一次，共处理3次。分别于施药前调查病情基数，每次施药后10天调查叶瘟病情指数。病情指数调查参照GBT 15790-2009稻瘟病测报调查规范。

根据平均病情指数计算防治效果，本实施例的培养液与对照培养液的防效比较如下表所示：

实施例2

枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其应用

1、制备方法如下：

扩培前清洗设备，用自来水清洗热水桶及其配件至无培养物残留。将玉米淀粉、黄豆粉过60目筛，取1.50％玉米淀粉，0.50％黄豆粉，0.50％玉米浆粉，0.20％KH₂PO₄，0.03％MgSO₄·7H₂O，0.01％MnSO₄·H₂O，0.10％NaOH，加入到扩培罐中配制基础培养液，再加入1.00‰消泡剂，补水至140L。将培养液加热至沸腾，将1.00wt‰枯草芽孢杆菌种子加到培养液中热处理30min后，通气降温至42℃。

对上述所得液体通空气进行培养，培养条件为通气量约1.0vvm，温度30-37℃，培养时间36h，所述培养液处于芽孢和营养体混合状态，发酵液中无致病菌和污染菌检出，生物量达1×10¹⁰CFU/ml。

本实施例使用的枯草芽孢杆菌菌剂为德强生物股份有限公司生产，登记证号：PD20110973，有效成分为枯草芽孢杆菌，含量为1.0×10¹¹CFU/g。

2、枯草芽孢杆菌培养液在防治豇豆立枯病的应用

选取发病初期的地块，将本实施例的枯草芽孢杆菌培养液兑自来水稀释300倍，按照每穴300ml的量每星期灌根一次，共处理3次，分别于施药前调查死亡率，每次施药后7天进行调查。防效计算方法为，防效＝[1-(处理区药后死亡率-处理区药前死亡率)/(对照区药后死亡率-对照区药前死亡率)]*100％。

与对照培养液的防效比较如下表所示：

实施例3

地衣芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其应用

1、制备方法如下：

扩培前清洗设备，用自来水清洗扩培罐及其配件至无培养物残留。将花生粉过60目筛，称取2.00％蔗糖，1.00％花生粉，0.30％酵母膏，0.30％KH₂PO₄，0.04％MgSO₄·7H₂O，0.02％MnSO₄·H₂O，0.07％NaOH，加入到扩培罐中配制基础培养液，再加入1.00‰消泡剂到扩培罐中，补水至400L。将培养液加热至80℃后，取0.50％的地衣芽孢杆菌菌剂加到培养液中处理20min后，通气降温至42℃。

对上述所得液体通空气进行培养，培养条件为通气量约0.5–1.0vvm，温度32℃，培养时间24h，得扩培液在4℃温度下储藏备用。所述扩培液处于营养体状态，发酵液中无常见致病菌检出，生物量增加近110倍达4×10⁹CFU/ml。

本实施例使用的地衣芽孢杆菌菌剂为河南省安阳市国丰农药有限公司生产，登记证号：PD20130411，有效成分为地衣芽孢杆菌，含量为8.0×10⁹CFU/ml。

2、枯草芽孢杆菌培养液在防治西瓜枯萎病的应用

使用时兑自来水稀释100倍，按照每亩60kg量喷雾，每隔7天喷雾一次，共处理3次。分别于施药前调查病情基数，每次施药后7天调查叶瘟病情指数。病情指数调查方法参照DB3701/T110-2007西瓜枯萎病综合防治技术规程。

尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于芽孢杆菌的培养液，其特征在于，所述培养液包括以下质量百分比的组分：

碳源 1.50-3.00％

氮源 0.30-1.00％

酵母抽提物或玉米浆粉或蛋白胨 0.10-0.50％

K₂HPO₄或KH₂PO₄ 0.10-0.30％

MgSO₄·7H₂O 0.02-0.05％

MnSO₄·H₂O 0.01-0.02％

NaOH 0.05-0.10％

消泡剂 1.00-2.00‰

芽孢杆菌种子 0.10％-1.00％

余下为水。

2.如权利要求1所述的一种用于芽孢杆菌的培养液，其特征在于：所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌的一种或多种。

3.如权利要求1所述的一种用于芽孢杆菌的培养液，其特征在于：所述碳源为玉米淀粉、可溶性淀粉、蔗糖以及葡萄糖的一种或多种。

4.如权利要求1所述的一种用于芽孢杆菌的培养液，其特征在于：所述氮源为豆粕粉、黄豆粉、棉籽粉、鱼粉以及花生粉的一种或多种。

5.一种权利要求1至4任一项所述用于芽孢杆菌培养液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)基础培养液的制备及灭菌处理

称取如下质量百分比的组分：碳源1.50-3.00％、氮源0.30-1.00％、酵母抽提物或玉米浆粉或蛋白胨0.10-0.50％、K₂HPO₄或KH₂PO₄ 0.10-0.30％、MgSO₄·7H₂O 0.02-0.05％、MnSO₄·H₂O 0.01-0.02％、NaOH 0.05-0.10％，将颗粒、粉状料过60目筛，再加入发酵设备中与纯净水混匀后得到基础培养液；然后将1.00-2.00‰消泡剂加入发酵设备中，加热培养液至100℃后，保温30min，降温至80℃备用；

2)芽孢杆菌种子热处理

3)现场培养

6.一种权利要求1至4任一项所述用于芽孢杆菌培养液在防治水稻稻瘟病、豇豆立枯病和西瓜枯萎病的应用，其特征在于：将现场培养得到的芽孢杆菌培养液以自来水稀释100-300倍后，按每亩50-100kg量喷雾或灌溉，在植物的生长期每隔7-15天使用一次。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌，现场培养得到的解淀粉芽孢杆菌以自来水稀释100-300倍后，按每亩50-100kg量喷雾，在植物的生长期每隔10-15天使用一次。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，现场培养得到的枯草芽孢杆菌培养液以自来水稀释100-200倍后，按每亩60-80kg量喷雾或灌溉，在植物的生长期每隔10-15天使用一次。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌，现场培养得到的地衣芽孢杆菌以自来水稀释200-300倍后喷雾或灌溉，在植物的生长期每隔10-15天使用一次。