CN106689211A - 一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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陈露
王学娟
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Abstract

本发明公开了一种能够防治多种土传病害且效果稳定、能够适应不同环境的含有哈茨木霉的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，包括载体和复合微生物菌，所述的复合微生物菌包含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4，上述三种生防菌的单独发酵液分别与载体按照按质量比为0.3‑1：2‑7进行吸附后所得的粉末再分别按照质量比为3‑4：3‑3.5：2.5‑3.5均匀混合，均匀混合后的粉末内复合微生物菌的活菌数量为5.8‑6.7×108个/克，水分保持在30％以内。本发明还公开了上述含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的制备方法。本发明具有防治多种土传病害，促进植物生长，诱导植物产生抗逆性和提高植物抗病害的能力。

Description

一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于植物病害防治领域，具体涉及一种含有哈茨木霉的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
我国植物病害生物防治研究经过多年的发展，在国家主管部门的扶持下，发展步伐逐年加快，在特异微生物选育技术、菌株遗传改造、生防农药作用机理以及代谢调控机理等方面取得了一定的研究进展。通过建立新的筛选体系，获得了一批高效的生防微生物资源。
生防菌木霉已广泛应用于防治蔬菜根腐病等土传病害，木霉除了已明确的重寄生、竞争、抗性作用生防机理外，还发现木霉可定殖在植物根系组织内，与植物形成共生体，在互作区产生生物活性分子，诱导植物发生局部的系统抗病性。还能诱导植物蛋白质组变化，促进作物营养吸收和生长，提高作物产量。
枯草芽孢杆菌通过定植在植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。枯草芽孢杆菌对稻瘟病菌Magnaporthe grisea、芋疫病菌Phytophthora colocasia、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.niveum、辣椒枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum、瓜果腐霉Pythiumaphaniderm atum等病原菌具有较强的抑制作用。
放线菌产生的抗生素在植物病害生物防治方面发挥着重要作用。由放线菌制成的活细胞制剂，具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容性好、防病持效期长等优点。生防链霉菌可产多种抗生素、胞外酶等活性物质，且孢子抗逆性强，在土传病害防治方面具有较好的应用前景。
尽管枯草芽孢杆菌、生防性链霉菌和生防菌木霉作为生物杀菌剂在植物病害的生物防治中取得了一些成效，但还是存在不少问题。
首先，作为生物杀菌剂，上述菌种在田间效果表现不稳定，经发明人研究发现可能是由于菌株在室内传代培养，与野生菌株活性有所差异。并且室内盆栽试验与不同地区田间环境不同，造成盆栽试验结果与田间应用效果有较大差异。其次，微生物菌剂也可能引起病原菌抗性。最后，微生物菌剂的防治成本一般高于化学药剂。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够防治多种土传病害且效果稳定、能够适应不同环境的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，包括载体和复合微生物菌，所述的复合微生物菌包含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4，上述三种生防菌的单独发酵液分别与载体按照按质量比为0.3-1：2-7进行吸附后所得的粉末再分别按照质量比为3-4：3-3.5：2.5-3.5均匀混合，均匀混合后的粉末内复合微生物菌的活菌数量为5.8-6.7×108个/克，水分保持在30％以内。
进一步，所述的载体是氨基酸生产过程中产生的水解渣，所述的水解渣pH范围为5.5-8.5。
进一步，所述的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的细度为60-80目。
本发明还提供了上述含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备水解渣，将水解渣敲碎成粉末或小颗粒，再与粉状石灰混合按照质量比为4：1混合均匀，再将混合均匀的粉末粉碎后堆放8-12小时，让其充分反应，最后调节其pH达到5.5-8.5；
S2：制备发酵液，将生防性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259，生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04，生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4的三种菌种分别转入单独的种子罐、发酵罐进行单独发酵，得到三种菌的发酵液；
S3：将S2中单独发酵后的菌液与S1中制备的水解渣按质量比为0.3-1：2-7的量进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为3-4：3-3.5：2.5-3.5的比例混合均匀。
S4：粉碎，将S2中混合均匀的粉状菌剂粉碎，使其达到60-80目，且复合菌剂的有效活菌数量达5.8～6.7×108个/克以上，水分保持在30％以内，即得到成品复合微生物菌剂。
进一步，S1中是通过加入石灰调节pH值。
进一步，所述的生防性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4通过斜面培养/摇瓶培养制备。
一种用于制备含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259发酵液的方法，包括以下步骤：
S1：在发酵培养基中，以1-2％接种量至种子罐；
S2：在种子罐内发酵液以3-5％接种量接种到发酵罐；
S3：所述的种子罐和发酵罐的在28±1℃的温度内培养24-48h，其通气量为1:0.5-1:1.6，并加入消沫剂，以200-400rpm的速度进行搅拌。
进一步，S1中所述培养基由以下组分按质量比：豆饼粉5～5.6％，玉米粉6.5～7.2％，Na2HPO4 0.5～0.8％，(NH4)2SO4 0.2～0.4％，NH4Cl 0.10～0.13％，CaCl20.10～0.13％构成。
进一步，S3中消沫剂为的植物油或有机硅油。
优选地，所述的消沫剂加入量与培养基按质量比为植物油1％或有机硅油0.04％。
进一步，所述的种子罐容积为30-50L，发酵罐容积为800-1000L。
一种用于制备含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04发酵液的方法，包括如下步骤：
S1：在发酵培养基中，以1-2％接种量至种子罐；
S2：种子罐内发酵液以3-5％接种量接种到发酵罐；
S3：所述的种子罐和发酵罐在28±1℃的温度内培养48-72h，其通气量为1:0.5-1:1.6，并加入消沫剂，以180-200rpm的速度进行搅拌。
进一步,S1中所述培养基由以下组分按质量比：大豆粉1～2％、(NH4)2SO45～6％、蛋白胨0.2～0.3％、葡萄糖3～4％、酵母粉0.4～0.6％、NaCl0.1～0.2％、K2HPO4 0.04～0.06％、CaCO3 0.1～0.2％构成。
进一步，S3中消沫剂为的植物油或有机硅油。
优选地，所述的消沫剂加入量与培养基按质量比为植物油1％或有机硅油0.04％。
一种用于制备含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4发酵液的方法，包括如下步骤：
S1：在发酵培养基中，以温度28～32℃、种子接种量5％～7％、种子浓度105～106个/mL、通气量为1:2-2:1，罐压0.03～0.05MPa的条件下发酵72～96小时，获得木霉菌发酵液。
进一步，S1中所述培养基由以下组分按质量比：0.3～0.5％的麸皮，0.1～0.3％的(NH4)2·SO4，0.1～0.2％的KH2PO4，0.1～0.2％的CaCO3，1～3％的葡萄糖，0.2～0.5％的大豆油构成，且其pH为5.5～6.0。
本发明的有益效果是：本发明的复合微生物菌剂可用于防治多种土传病害，促进植物生长，诱导植物产生抗逆性和抗病害的能力。复合微生物菌剂生产的吸附剂采用氨基酸生产过程中产生的水解渣为原料，不仅废物利用，为氨基酸厂解决了一条处理途径，环保的资源化处置，减少了对环境的污染，降低了生物防治的成本，作为产品本身，氨基酸本来就能作为菌剂培养的培养基，利用其吸附菌剂能延长菌剂的存活时间，更有利于其在土壤当中的定殖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例一：
一种含有哈茨木霉的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备水解渣，取自河南莲花味精股份有限责任公司制备的水解渣，将颗粒状或粉状水解渣与粉状石灰按质量比为：4：1混合，再用链条粉碎机粉碎后堆放8-12小时，让其充分反应，调节其pH至6；
S2：制备发酵液，将经过斜面培养、摇瓶培养的生防性枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4三种菌种转入种子罐、发酵罐进行单独发酵，得到三种菌的发酵液；
S3：混合均匀，单独发酵后的菌液与水解渣按质量比为1：10的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为3：3.5：3.5的比例混合均匀。
S4：粉碎，将得到的固体菌剂粉碎，使其达到60-80目，且复合菌剂的有效活菌数量达5.8×108个/克以上，水分保持在20％左右。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于：
S3：混合均匀，将生防性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4每个菌种单独发酵后的菌液与水解渣按质量比为1：7的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为4：3：3混合均匀；
S4：粉碎，将得到的固体菌剂粉碎，使其达到60-80目，且复合菌剂的有效活菌数量达6.0×108个/克以上，水分≈24％。
实施例三：
本实施例与实施例一的区别在于：
S3：混合均匀，将生防性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4每个菌种单独发酵后的菌液与水解渣按质量比为1：6的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为4：3.5：2.5混合均匀；
S4：粉碎，将得到的固体菌剂粉碎，使其达到60-80目，且复合菌剂的有效活菌数量达6.2×108个/克以上，水分≈26％。
实施例四：
本实施例与实施例一的区别在于：
S3：混合均匀，生防性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4每个菌种单独发酵后的菌液与水解渣按质量比为1：4的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为3.5：3.5：3混合均匀；
S4：粉碎，将得到的固体菌剂粉碎，使其达到60-80目，且复合菌剂的有效活菌数量达6.7×108个/克以上，水分保持在30％以内。
一种用于制备含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259发酵液的方法，包括以下步骤：
S1：在发酵培养基中，以1.5％接种量至种子罐,培养24h；
S2：在种子罐内发酵液以4％接种量接种到发酵罐培养48h；
S3：所述的种子罐和发酵罐在28℃下培养，其通气量为1:1.5，并加入1％的植物油作为消沫剂，以300rpm的速度进行搅拌。
进一步，S1中所述培养基由以下组分按质量比：豆饼粉5.5％，玉米粉7.0％，Na2HPO4 0.8％，(NH4)2SO4 0.3％，NH4Cl 0.13％，CaCl2 0.12％构成。
一种用于制备含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04发酵液的方法，包括以下步骤：
S1：在发酵培养基中，以2％接种量至种子罐,培养24h；
S2：在种子罐内发酵液以5％接种量接种到发酵罐培养72h；
S3：所述的种子罐和发酵罐在28℃下培养，其通气量为1:1.5，并加入1％的植物油作为消沫剂，以200rpm的速度进行搅拌。
进一步，S1中所述培养基由以下组分按质量比：大豆粉1.5％、(NH4)2SO45.5％、蛋白胨0.3％、葡萄糖4％、酵母粉0.5％、NaCl 0.2％、K2HPO4 0.05％、CaCO3 0.15％构成。
一种用于制备含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4发酵液的方法，包括以下步骤：
S1：在发酵培养基中，以2％接种量至种子罐,培养36h；
S2：在种子罐内发酵液以7％接种量接种到发酵罐培养96h；
S3：所述的种子罐和发酵罐在30℃下培养，其通气量为1:2，罐压0.05MPa。
进一步，S1中所述培养基由以下组分按质量比：0.4％的麸皮，0.2％的(NH4)2·SO4，0.15％的KH2PO4，0.2％的CaCO3，2％的葡萄糖，0.4的大豆油，且其pH为5.5构成。
为了摸索本发明—含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂在农作物上的应用效果，发明人进行了该复合微生物菌剂在西瓜上的田间小区试验，与灭菌微生物复合菌剂进行对比，现将试验结果总结如下：
表1 不同处理对西瓜农艺性状的影响
表2 不同处理对西瓜猝倒防病的抑制效果
由以上数据可知，含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂有促于西瓜的生长发育,同时减少作物病苗的数量，增产效果明显,值得大面积推广应用。
本发明制作的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂适用于粮食、豆类作物、油料作物、蔬菜瓜果等。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，包括载体和复合微生物菌，其特征是：所述的载体是氨基酸生产过程中产生的pH为5.5-8.5的水解渣，所述的复合微生物菌包含有生防性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259、生防性链霉菌(Streptomyces sp.)YL04和生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T4上述三种生防菌的单独发酵液分别与载体按照按质量比为0.3-1：2-7进行吸附后所得的粉末再分别按照质量比为3-4：3-3.5：2.5-3.5均匀混合，均匀混合后的粉末内复合微生物菌的活菌数量为5.8-6.7×108个/克，水分保持在30％以内。
2.如权利要求1所述的一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，其特征是：所述的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的细度为60-80目。
3.如权利要求1所述的一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，其特征是：所述的三种生防菌的单独发酵液分别与载体按照按质量比为1：10的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为3：3.5：3.5的比例混合均匀,复合菌剂的有效活菌数量达5.8×108个/克以上，水分保持在20％左右。
4.如权利要求1所述的一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，其特征是：所述的三种生防菌的单独发酵液分别与载体按照按质量比为1：7的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为4：3：3混合均匀,所述的复合菌剂的有效活菌数量达6.0×108个/克以上，水分≈24％。
5.如权利要求1所述的一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，其特征是：所述的三种生防菌的单独发酵液分别与载体按照按质量比为1：6的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为4：3.5：2.5混合均匀,所述的复合菌剂的有效活菌数量达6.2×108个/克以上，水分≈26％。
6.如权利要求1所述的一种含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂，其特征是：所述的三种生防菌的单独发酵液分别与载体按照按质量比为1：4的比例进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为3.5：3.5：3混合均匀,所述的复合菌剂的有效活菌数量达6.7×108个/克以上，水分保持在30％以内。
7.一种制备权利要求1-6中所述的含有哈茨木霉的生防性复合微生物菌剂的方法，其特征是：包括如下步骤：
S1：制备水解渣，将水解渣敲碎成粉末或小颗粒，再与粉状石灰混合按照质量比为4：1混合均匀，再将混合均匀的粉末粉碎后堆放8-12小时，让其充分反应，最后调节其pH达到5.5-8.5；
S2：制备发酵液，将生防性枯草芽孢杆菌HL259，生防性链霉菌YL04，生防菌哈茨木霉T4的三种菌种分别转入种子罐、发酵罐进行单独发酵，得到三种菌的发酵液；
S3：将S2中单独发酵后的菌液与S1中制备的水解渣按质量比为0.3-1：2-7的量进行吸附，吸附后的三种固体粉状菌剂按照质量比为3-4：3-3.5：2.5-3.5的比例混合均匀；
S4：粉碎，将S2中混合均匀的粉状菌剂粉碎，使其达到60-80目，且复合菌剂的有效活菌数量达5.8～6.7×108个/克以上，水分保持在30％以内，即得到成品复合微生物菌剂。
8.一种制备权利要求7，S2中枯草芽孢杆菌HL259发酵液的方法，其特征是：包括以下步骤：
S1：在发酵培养基中，以1-2％接种量至种子罐；所述培养基由以下组分按质量比：豆饼粉5～5.6％，玉米粉6.5～7.2％，Na2HPO4 0.5～0.8％，(NH4)2SO40.2～0.4％，NH4Cl 0.10～0.13％，CaCl2 0.10～0.13％构成；
S2：在种子罐内发酵液以3-5％接种量接种到发酵罐；
S3：所述的种子罐和发酵罐的在28±1℃的温度内培养24-48h，其通气量为1:0.5-1:1.6，并加入消沫剂，以200-400rpm的速度进行搅拌。
9.一种制备权利要求7，S2中生防性链霉菌YL04发酵液的方法，其特征是：包括以下步骤：
S1：在发酵培养基中，以1-2％接种量至种子罐；所述培养基由以下组分按质量比：大豆粉1～2％、(NH4)2SO4 5～6％、蛋白胨0.2～0.3％、葡萄糖3～4％、酵母粉0.4～0.6％、NaCl 0.1～0.2％、K2HPO4 0.04～0.06％、CaCO3 0.1～0.2％构成。
S2：种子罐内发酵液以3-5％接种量接种到发酵罐；
S3：所述的种子罐和发酵罐在28±1℃的温度内培养48-72h，其通气量为1:0.5-1:1.6，并加入消沫剂，以180-200rpm的速度进行搅拌。
10.一种制备权利要求7，S2中生防菌哈茨木霉T4发酵液的方法，其特征是：包括以下步骤：在发酵培养基中，以温度28～32℃、种子接种量5％～7％、种子浓度105～106个/mL、通气量为1:2-2:1，罐压0.03～0.05MPa的条件下发酵72～96小时，获得木霉菌发酵液，所述培养基由以下组分按质量比：0.3～0.5％的麸皮，0.1～0.3％的(NH4)2·SO4，0.1～0.2％的KH2PO4，0.1～0.2％的CaCO3，1～3％的葡萄糖，0.2～0.5％的大豆油构成，且其pH为5.5～6.0。
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