CN102001869B - 用沼液制备生物药肥的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用沼液制备生物药肥的方法，以沼液为主体原料，其特征在于：将沼液过120目筛，加入拮抗芽孢细菌制备的复合微生物菌剂，制成生物药肥，所述的生物药肥中，拮抗芽孢细菌的数量达到5～6×107CFU/毫升，所述的拮抗芽孢细菌为：土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

Description

用沼液制备生物药肥的方法
技术领域
本发明涉及一种用沼液制备生物药肥的方法。属于农业废弃物综合利用领域。
背景技术
据统计，截至2005年底，我国共有沼气池1700万个，年产沼气65亿m3，到2010年，全国规模化养殖场大中型沼气工程总数达4700处左右，而截至2008年，仅江苏省规模化养殖场已达14万个，其中大型养殖场4700多个，养殖场的沼气工程有1000多处，池容在100m3以上的工程有300多处，且80％建在养猪场。畜禽粪便经沼气工程实现能源化的同时产生了体积庞大的沼液，如此大量沼液的安全、合理、高效利用必将成为全社会密切关注和亟待解决的问题。
在高效农业发展中，病虫害发生日趋严重，常规的物理、化学防治效果不断降低，且化学防治也因环境污染和食品安全问题逐渐受到限制。因此，亟待寻找安全、高效防治病虫害的途径。国内外的研究和应用表明，沼液作为一种营养丰富的液体肥料，具有“药肥”合一的功效：对许多植物病原真菌有明显的生长抑制作用，使用沼液替代化肥和农药，可减少20％以上的化肥和农药施用量，并显著降低进某些病害的发生率，可以发展成一种替代化学农药防治某些植物病害的有效手段。
大量的文献提及沼液含有丰富的有效矿质养分、氨基酸、维生素和激素等活性物质，并且把沼液对病虫害的防治作用归结于其促进作物生长从而间接提高了作物的抗病性或者归结为沼液中的抗菌物质起到防病作用，但在广泛的应用后发现沼液对病害防治效果稳定性、重复性差。因此，为了提高沼液的肥料及对病虫害防治效果，前人通过在沼液中添加化学肥料、农药、或与其他有机、无机物质复配等方法开展了许多研究。管莉菠等研究报道将沼液分别与5种化学农药复配后对小麦叶枯病菌的抑制作用显著增强。Liu等研究报道在沼液中强化氨基酸后施用于莴笋明显降低了莴笋中硝酸盐的含量。
国内以沼液为原料制备肥料或农药的专利有：专利申请号为200510084342.7的专利文献记载的是：在沼液中添加硫酸钾、磷酸二铵、尿素等基本肥料成分和微量元素制备防治病虫害的叶面肥；而专利申请号为200810033989.0的专利文献记载的是：在沼液中加入煤油0.16％～0.3％，洗衣粉0.04％～0.1％制备无公害沼液杀虫液；专利申请号为200610106682.X的专利文献记载的是：在沼液中添加萃取的中草药中的有效毒素制成有防病效果的叶面肥。而专利申请号为200610031565.1的专利文献记载的是：在沼液中复配复合氨基酸粉、乳酸制成一种多效植物防病营养液；还有专利是利用沼液、酒精废水、味精废水制备发酵培养基，以灰色链霉菌或乳黄色细菌为菌种，经过发酵及过滤、浓缩、提纯制得生物农药，(包括专利申请号：200610053322.8)；申请专利号为200810060161.4的专利文献记载的是：在沼液中加入广谱性杀菌剂及辅料，生产的药肥能有效防治多种农作物病害；专利申请号为200810058461.9的专利文献记载的是：将硅藻土与沼液中混合均匀后得到具有杀虫效果的液体有机肥。
总观以上材料可以看出；所有的公开专利文献都是在沼液中添加化学肥料、农药或其他营养成分或杀菌物质来生产获得具有促生长、防病虫作用的液体肥料或生物农药，还没有通过在沼液中强化来源于沼液、对常见多种作物病害具有较好防治效果的广谱拮抗微生物制备生物药肥的专利和文献报道。
虽有不少应用表明施用沼液可以减轻许多作物病虫害的发生，也有文章报道沼液对许多植物病原菌有生长抑制作用，但对沼液中含有的拮抗微生物的研究鲜见报道，而这些微生物可能在沼液的抑菌、防病功效中发挥着重要作用。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前沼气工程大量建设、沼液产生量不断增加，而沼液作为一种营养丰富的生物药肥，在农业生产上应用效果不稳定、对病害防治效果较低以及防病范围窄等问题，提出通过添加复合、广谱拮抗芽孢细菌，制备防病功能增强的生物药肥。
为了实现上述目的，江苏省农科院通过对江苏省运行稳定的20多个沼气工程采样、分析、研究发现，所有沼液对草莓枯萎病菌的菌丝生长都有不同程度的抑制作用，但沼液的无菌滤液或沼液经辐照灭菌后对草莓枯萎病菌没有生长抑制效果，由此初步推断，沼液中的微生物是沼液抑菌防病的主要因子。随后，从多个以牛粪或猪粪为原料的沼液中分别分离到了多株数量上占优势的芽孢细菌，并将这些芽孢细菌分别与生产上常见的十多种病原菌进行了平板对峙培养实验，结果表明：分离到的多株芽孢细菌对病原菌的生长抑制效果与相应沼液的生长抑制效果相一致，说明分离到的芽孢细菌在沼液的抑菌功能中发挥主要作用。
根据我们研究的初步结果，可以在沼液中强化来源于沼液并对常见植物病原菌有生长抑制作用并对作物病害有良好防效的微生物，从而提高沼液抑菌防病的效果并拓宽其杀菌防病的范围，不但解决了沼液的高端利用问题，而且对全国沼气工程的进一步扩大推进、实现农业废弃物的循环利用以及保护和改善农村生态环境具有重大意义。
本发明的目的是这样实现的：一种用沼液制备生物药肥的方法，以沼液为主体原料，其特征在于：将沼液过120目筛，加入拮抗芽孢细菌制备的复合微生物菌剂，制成生物药肥，所述的生物药肥中，拮抗芽孢细菌的数量达到5～6×107CFU/毫升，所述的拮抗芽孢细菌为：土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
在本发明的制备方法中，土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌在复合微生物菌剂中的数量分别为4～8×109CFU/克、2～4×109CFU/克和2～4×109CFU/克。
在本发明的制备方法中，所述的土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌是由大型沼气工程的沼液中分离获得。
在本发明的制备方法中，沼液中N∶P2O5∶K2O的养分含量质量比，为1∶0.5～0.8∶0.8～1.2。
在本发明的制备方法中，用45％的硫酸钾复合肥或45％的氯化钾复合肥或尿素或它们的组合，将沼液中N∶P2O5∶K2O的养分含量质量比调节到1∶0.5～0.8∶0.8～1.2。
在本发明的制备方法中，所述复合微生物菌剂的制备方法为：
分别对土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌进行纯培养，获得三种独立的液体纯培养物；
将所述的各液体纯培养物分别与过60目筛的沸石混合，各液体纯培养物与沸石的体积/重量比均为20～30％；
将混合后的混合物自然风干或30℃烘干后过40目筛，即获得三种分别吸附不同芽孢细菌的固体微生物菌剂，每个固体微生物菌剂中的含菌量为1～2×109-10CFU/g；
将吸附有土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的固体微生物菌剂按2∶1∶1的重量比混合均匀，形成复合微生物菌剂。
在本发明的制备方法中，分别对土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌进行纯培养，获得三种独立的液体纯培养物是指：分别将三种芽孢细菌接种到各自的试管斜面培养基中进行活化培养，再将斜面培养好的三个菌株分别接种到对应的容量为250ml且装有80ml液体种子培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转速180r/min、温度为28±2℃的摇床上培养24～36小时，然后再以体积比5～10％的接种量分别接入到容量为2000ml且装有800ml液体生产培养基的大三角瓶中，将大三角瓶置于转速160r/min、温度为28±2℃的摇床上培养72～96小时，显微镜检查芽孢形成率大于95％时即可结束培养，获得三种含有不同芽孢细菌的液体纯培养物。
在本发明的制备方法中，所述的试管斜面培养基为：牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6，琼脂15～20克；
所述的液体种子培养基为：牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6；
所述的液体生产培养基包括：土芽孢细菌的液体生产培养基和解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的液体生产培养基，所述土芽孢细菌的液体生产培养基为：酵母粉4.5～5.5克，豆粕4～5克，K2HPO4为8～9克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6，琼脂15～20克；所述解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的液体生产培养基为：酵母粉6克，蛋白胨6克，NaCl 3克，K2HPO40.2克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.0～7.6。
本发明的优点在于：本发明以大量廉价易得的沼液为原料，制备的生物药肥除了含有多种作物生长所必须的氮、磷、钾、氨基酸、有机酸及其他其他矿物元素外，还含有三种外源加入的对常规作物病害有显著防治效果的拮抗芽孢细菌，制备的生物药肥功能更加明确，靶标性更强，效果更加稳定；另外，这三种芽孢细菌均分离自沼液，菌株本身已经适应了沼液中的物理(如氧化还原电位)、化学(高COD)和营养环境(如高氨态氮含量)，添加到沼液中不会由于沼液的特殊环境引起菌株的死亡和功能退化，并且在施用到田间后与沼液有更好的协同增效作用；整个制备过程设备、工艺简单，易于操作；施用后能显著改良土壤质量、平衡土壤养分及丰富土壤微生物的种群结构，发挥对作物促生、防病的效果，从而减少化肥、农药的使用量，为资源循环利用、环境保护及农产品的安全生产开辟新的思路。
本发明的优点还在于：这三个菌株在液体纯培养状态下，均能分泌多种抗菌物质，如抗菌蛋白、小分子抗生素等；而且分泌的小分子抗生素经100℃处理30分钟仍然有生物活性，具有极好的温度稳定性；试验证明：三种芽孢细菌制备的复合微生物菌剂对生产中常见的枯萎病菌、疫霉病菌、立枯病菌、黄萎病菌、菌核病菌、灰霉病菌等十多种病原真菌和青枯病菌、溃疡病菌、根肿病菌等病原细菌有强烈的生长抑制作用，为广谱拮抗细菌。
具体实施方式
实施例1
三个芽孢细菌菌株的获得及菌株特性：
沼液取自南京山田奶牛场沼气工程。采集沼液8～10毫升于25毫升试管中，将试管放在80℃水浴中加热15分钟后取出冷却至室温，在无菌状态下，吸取200微升沼液加到直径9厘米的培养皿中，再迅速加入20毫升、55-60℃的PDA培养基，二者充分混合后放置等到培养基完全凝固，再向培养皿中加入15毫升、55～60℃的PDA培养基，水平轻轻摇匀后水平放置，再等到培养基完全凝固，在培养基上均匀接种5个直径为7毫米、新鲜的草莓枯萎病菌菌丝块，将培养皿置于28±2℃培养4～5天，用接种环挑取产生抑菌圈的菌落2环接种在250毫升、盛有80毫升NB液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转速160r/min、温度为28±2℃的摇床上培养20～24小时，将培养物在转速为6000r/min下离心15分钟，去掉上清液，收集菌体，采用OMIGA公司生产的专门用于细菌DNA提取的试剂盒Bacterial DNA Kit，提取获得细菌16SrDNA，再采用细菌通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rDNA的PCR扩增，将PCR产物进行碱基序列测定，获得16S rDNA的碱基序列，然后即可登陆GENBANK，输入碱基序列进行BLAST查询，获得序列号分别为NC013406、NC009725、ABQN01000001的菌株就分别是本发明中的土芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
该实施例中的PDA培养基配制方法为：马铃薯200克，葡萄糖或蔗糖20克，琼脂15-20克，水1000毫升，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000毫升，121℃高压灭菌20min。
该实施例中的NB培养基配制方法为：牛肉膏3克，蛋白胨10，氯化钠5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6，然后分装，装液量为80/250ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌25min，冷却后备用。
草莓枯萎病菌可以从中国科学院微生物菌种保藏中心自行引进。
实施例2
三个芽孢细菌培养基的配制
试管斜面培养基的配制：称取牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6，加入琼脂15～20克，加热煮沸至琼脂溶化，补足体积至1000毫升，适当冷却后分装到试管中，装量为试管高度的1/5～1/6，用试管塞塞好试管口，121℃高压灭菌25min，趁热取出后摆斜面至冷却备用，斜面高度不超过试管高度的1/3。
液体种子培养基的配制：牛肉膏3克，蛋白胨10，氯化钠5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6，然后分装，装液量为80/250ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌25min，冷却后备用。
土芽孢细菌液体生产培养基的配制：酵母粉20克，豆粕18克，K2HPO4为34克，溶解在4000毫升水中，调节pH 7.4～7.6，然后分装，装液量为800ml/2000ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌25min，冷却后备用。
所述的解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的液体生产培养基的配制：酵母粉24克，蛋白胨24克，NaCl 12克，K2HPO40.8克，溶解在4000毫升水中，调节pH 7.0～7.6。然后分装，装液量为800ml/2000ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌25min，冷却后备用。
实施例3：
复合微生物菌剂的制备
分别将实施例1中的三种芽孢细菌的保藏菌种接种到试管斜面培养基中进行试管斜面活化，然后，用接种环将活化好的菌种接种到装有80ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，将三角瓶置于摇床培养24小时，摇床的转速160r/min，培养温度为28±2℃；结束后以5％接种量(V/V)接入装有800ml液体生产培养基的2000ml三角瓶中，将三角瓶置于摇床培养，摇床的转速160r/min，培养温度为28±2℃，培养3～4天后显微镜检查芽孢的形成率在95％以上时即可结束培养；将各个芽孢细菌的液体培养物以20～30％的体积/重量比均匀喷洒在过60目筛的沸石中，自然风干或30℃烘干，过40目筛，即获得三种分别吸附不同芽孢细菌的固体微生物菌剂，每种固体菌剂中的含菌量为1～2×109-10CFU/g；再根据三种微生物菌剂的实际含菌量，将三种菌剂按一定比例混合，最后使得复合菌剂中土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的数量分别为4～8×109CFU/克、2～4×109CFU/克、2～4×109CFU/克。
实施例4
复合微生物菌剂对病原真菌和病原细菌的生长抑制作用
所有参加试验的病原真菌和病原细菌都可以从中科院微生物菌种保藏中心获得。将所有参加试验的病原真菌接种到PDA平板中，28-30℃培养5天后用打孔器打孔获得直径4毫米的菌丝块备用。将所有参加试验的病原细菌接种到试管斜面培养基中进行试管斜面活化后用无菌水做成2×107CFU/毫升的菌悬液备用。
对病原真菌的抑制作用：分别将实施例1中的三种芽孢细菌的保藏菌种接种到试管斜面培养基中进行试管斜面活化，然后，用接种环将活化好的三个菌株分别接种在直径9厘米的PDA平板培养基一侧的中间，菌斑直径5毫米左右，在平板的另一侧的中间分别接种新鲜培养的直径4毫米的病原真菌的菌丝块，28-30℃培养5天-7天，观察抑菌带的有无或抑菌带的宽度。
对病原细菌的抑制作用：用接种环将活化好的三个芽孢细菌菌株分别接种在直径9厘米的PDA平板培养基正中间，菌斑直径5毫米左右，在平板的其余部分用涂棒分别涂上病原细菌的菌悬液，28～30℃培养2～3天，观察抑菌带的有无或抑菌带的宽度。
表1复合微生物菌剂对病原真菌和病原细菌的生长抑制作用
(表中数据为抑菌带宽度，单位：毫米)
Figure BSA00000310215300071
由表1可见，虽然三种芽孢细菌各自的抗菌谱不完全相同，但彼此有互补性；复配后使得抗菌谱拓宽，防病范围扩大，对农业生产上常见的枯萎病菌、疫霉病菌、立枯病菌、黄萎病菌、菌核病菌、灰霉病菌等多种病原真菌和青枯病菌、根肿病菌等病原细菌都有强烈的生长抑制作用，为广谱拮抗微生物菌剂。
实施例5
以牛粪沼液或以猪粪沼液为原料，制备富含三种芽孢细菌的生物药肥的制备方法
a)牛粪沼液取自南京山田奶牛场沼气工程。
将从沼气池放出的牛粪沼液敞口放置48小时，然后过120目筛，收集过滤好的沼液100公斤，根据沼液中N∶P2O5∶K2O的养分含量，用45％的硫酸钾复合肥或45％的氯化钾复合肥或尿素调节到N∶P2O5∶K2O＝1∶0.5～0.8∶0.8～1.2，然后加入复合芽孢细菌固体菌剂1公斤(实施例3提供)，搅拌30分钟，制备富含三种芽孢细菌的液体生物药肥，其中土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的数量分别为4～8×107CFU/毫升、2～4×107CFU/毫升、2～4×107CFU/毫升。
b)猪粪沼液取自江苏省农科院六合基地沼气工程。
将从沼气池放出的猪粪沼液敞口放置48小时，然后过120目筛，收集过滤好的沼液100公斤，根据沼液中N∶P2O5∶K2O的养分含量，用45％的硫酸钾复合肥或45％的氯化钾复合肥或尿素调节到N∶P2O5∶K2O＝1∶0.5-0.8∶0.8-1.2，然后加入复合芽孢细菌固体菌剂1公斤(实施例3提供)，搅拌30分钟，制备富含三种芽孢细菌的液体生物药肥，其中土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的数量分别为4～8×107CFU/毫升、2～4×107CFU/毫升、2～4×107CFU/毫升。
实施例6
生物药肥(实施例5中a提供)对草莓两种病原菌的平板生长抑制作用。
试验方法：采用平板菌丝生长抑制法：将1ml生物药肥或无菌水或沼液与溶化的50～60℃的PDA培养基混合倒平板，凝固后在平板中央接种1个直径为4mm的病原菌菌丝块，28℃培养，72h后测量立枯病菌的菌落直径，120h小时后测量枯萎病菌的菌落直径，每处理5个重复。
实验组为实施例5中a提供的生物药肥，即用1ml生物药肥与溶化的50～60℃的PDA培养基混合倒平板；对照1为空白对照，即用1ml无菌水与溶化的50～60℃的PDA培养基混合倒平板；对照2为正常牛粪沼液1ml(取自南京山田奶牛场沼气工程)与溶化的50～60℃的PDA培养基混合倒平板
试验结果如表2。由表2可见，与两个对照相比，在沼液中添加了微生物菌剂后制备的生物药肥对草莓两种植物病原真菌的抑制生长作用显著提高，对枯萎病菌的抑制率提高了37.2％；对立枯病菌的抑制率提高了27.5％。
表2：生物药肥对草莓两种植物病原真菌的生长抑制
Figure BSA00000310215300081
实施例7
生物药肥的土壤浇施使用
以黄瓜为例：
实验组：生物药肥由实施例5中b提供。
对照组：猪粪沼液取自江苏省农科院六合基地沼气工程。
实验组和对照组进行平行试验。
育苗期间使用：
生物药肥对种子进行浸种处理后播种，以后每隔15～20天定期浇灌，有效防治苗期土传病害，而且显著提高发芽率和齐苗率。
将黄瓜种子分别用生物药肥和猪粪沼液浸泡30分钟，捞出自然晾干后播种，出苗后每隔15～20天定期分别用生物药肥和猪粪沼液浇施，实验组的黄瓜苗整齐度明显提高，实验组的黄瓜猝倒病发病率为10～15％，对照组的黄瓜猝倒病发病率为80～85％，实验组的黄瓜猝倒病发病率降低了82％以上。
移栽时或追肥使用：
在黄瓜苗移栽时，每穴浇施200～400毫升生物药肥或猪粪沼液，缓苗后每隔15～20天，再与浇水相结合进行土壤冲施生物药肥或猪粪沼液，用量为400～600公斤/亩，实验组的黄瓜枯萎病发病率为20～25％，亩产量为5000公斤；对照组的黄瓜枯萎病发病率为85％，亩产量为3800公斤。可见，实验组的黄瓜枯萎病率降低了70％以上，且增产24％以上。
实施例8
生物药肥在草莓栽培上的滴灌使用
以草莓为例：
实验组：生物药肥由实施例5中b提供。
对照组：猪粪沼液取自江苏省农科院六合基地沼气工程。
实验组和对照组进行平行试验。
将生物药肥或猪粪沼液分别通过水泵输送到各自滴灌用的专用设施中，配合浇水时间进行定期滴灌使用，每亩每次用量50～80公斤，整个生育期施用5～7次，特别在盛果期施用2～3次。实验组的草莓根腐病发病率为10～12％，草莓畸形果率为8～9％，VC含量为53.6～54.1mg/100g，亩产量为2600公斤；对照组的草莓根腐病发病率为35～40％，草莓畸形果率为10～12％，VC含量为50.6～51.3mg/100g，亩产量为2200公斤。可见，施用生物药肥使得草莓根腐病的发病率降低70％以上，草莓畸形果降低10～33.3％，草莓品质显著改善。

Claims (7)

1.一种用沼液制备生物药肥的方法，以沼液为主体原料，其特征在于：将沼液过120目筛，加入拮抗芽孢细菌制备的复合微生物菌剂，制成生物药肥，所述的生物药肥中，拮抗芽孢细菌的数量达到5～6×107CFU/毫升，所述的拮抗芽孢细菌为：土芽孢菌(Geobacillus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
2.根据权利要求1所述的用沼液制备生物药肥的方法，其特征在于：土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌在复合微生物菌剂中的数量分别为4～8×109CFU/克、2～4×109CFU/克和2～4×109CFU/克。
3.根据权利要求2所述的用沼液制备生物药肥的方法，其特征在于：所述的土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌是从大型沼气工程的沼液中分离获得。
4.根据权利要求1或2或3所述的用沼液制备生物药肥的方法，其特征在于：用45％的硫酸钾复合肥或45％的氯化钾复合肥或尿素或它们的组合，将沼液中N∶P2O5∶K2O的养分含量质量比调节到1∶0.5～0.8∶0.8～1.2。
5.根据权利要求1或2或3所述的用沼液制备生物药肥的方法，其特征在于：所述复合微生物菌剂的制备方法为：
分别对土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌进行纯培养，获得三种独立的液体纯培养物；
将所述的各液体纯培养物分别与过60目筛的沸石混合，各液体纯培养物与沸石的体积/重量比均为20～30％；
将混合后的混合物自然风干或30℃烘干后过40目筛，即获得三种分别吸附不同芽孢细菌的固体微生物菌剂，每个固体微生物菌剂中的含菌量为1～2×109-10CFU/g；
将分别吸附有土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的固体微生物菌剂按2∶1∶1的重量比混合均匀，形成复合微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的用沼液制备生物药肥的方法，其特征在于：分别对土芽孢菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌进行纯培养，获得三种独立的液体纯培养物是指：分别将三种芽孢细菌接种到各自的试管斜面培养基中进行活化培养，再将斜面培养好的三个菌株分别接种到对应的容量为250ml且装有80ml液体种子培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转速180r/min、温度为28±2℃的摇床上培养24～36小时，然后再以体积比5～10％的接种量分别接入到容量为2000ml且装有800ml液体生产培养基的大三角瓶中，将大三角瓶置于转速160r/min、温度为28±2℃的摇床上培养72～96小时，显微镜检查芽孢形成率大于95％时即可结束培养，获得三种含有不同芽孢细菌的液体纯培养物。
7.根据权利要求6所述的用沼液制备生物药肥的方法，其特征在于：
所述的试管斜面培养基为：牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6，琼脂15～20克；
所述的液体种子培养基为：牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.4～7.6；
所述的液体生产培养基包括：土芽孢细菌的液体生产培养基和解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的液体生产培养基，所述土芽孢细菌的液体生产培养基为：酵母粉4.5～5.5克，豆粕4～5克，K2HPO4为8～9克，溶解在1000毫升水中，调节pH7.4～7.6，琼脂15～20克；所述解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的液体生产培养基为：酵母粉6克，蛋白胨6克，NaCl3克，K2HPO40.2克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7.0～7.6。
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