CN103074287B

CN103074287B - 一种促生抑菌解淀粉芽孢杆菌、调理剂制备方法及应用

Info

Publication number: CN103074287B
Application number: CN201310032838.4A
Authority: CN
Inventors: 庞金梅; 焦晓燕; 武爱莲; 梁改梅; 郭珺
Original assignee: INSTITUTE OF AGRICULTURAL ENVIRONMENT AND RESOURCE SHANXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: Shanxi Nongyi Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-01-28
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2033-01-28
Also published as: CN103074287A

Abstract

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens sp.)Pb-4(T4,4)、调理剂制备方法及应用。菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7155，保藏日期为2013年1月18日；该菌株对番茄等作物有明显促生抑菌防病作用；该菌能在土壤和植株体内定殖。该调理剂制作方法是用豆制品废水等液体培养，大豆荚皮粉等固体发酵，培养物活菌高达4ⅹ10⁹cfu/ml和5ⅹ10⁹cfu/g，且含抗菌蛋白、酶和抗菌素3类促生抑菌物质。本发明使豆制品废水的废弃物资源化，成本低，适宜工厂化生产；减少或替代化学农药，安全无毒，符合生态农业和可持续农业发展的需求。

Description

一种促生抑菌解淀粉芽孢杆菌、调理剂制备方法及应用

技术领域

本发明属于微生物在农业方面应用技术，主要涉及解淀粉芽孢杆菌调理剂制备方法及其应用。

背景技术

随着设施农业的快速发展，连作和大量使用化肥农药，使设施土壤养分失衡，土壤酸化，土传病害频繁发生，严重制约了设施生产的可持续发展。

目前，针对设施生产中土壤修复、植病防控已有多种应用微生物生产的制剂，如：CN100999667公开了一种设施菜地土壤改良剂及其制备方法与应用，强调作为土壤改良剂，菌剂中菌种的配比和固体菌剂载体的配比，菌剂单独发酵活菌数仅为10亿/ml。CN101948771A公开了防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用，强调在NYD培养液中可获得菌数20～40亿/ml发酵液，有2种抗菌物质，菌液稀释50倍，处理水稻种子，对水稻恶苗病温室防效达到84.6％以上。上述两种制剂中，前者发酵液菌数偏低，用量和成本必然加大；后者处理种子用浓度也较高，用量和成本也不低。如果能将发酵菌液的活菌数和活性提高，减少使用量，降低生产成本，将大大节约能源和资源，利国利民。

发明内容

本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌制备的促生抑菌调理剂，该调理剂制备所用材料成本低廉，发酵产物效价高；并且产生多种促生抑菌物质。该调理剂可以在土壤和植物体内定殖；对多种植物土传真菌性病害具有良好的防控效果和明显的促生长作用。该调理剂的生产使废弃物资源化，生产工艺简单，无“三废”排出；减少或替代化学农药的使用，安全无毒，属环境友好型制剂，符合生态农业和可持续农业发展的需求。

为实现上述本发明的目的，本发明的技术方案是：

1.本发明为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens.sp)Pb-4(T4,4),菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCCN0.7155，保藏日期为2013年1月18日。

解淀粉芽孢杆菌的获得过程与特征

解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)获得过程：该菌株是本发明人从太原市小店区永昌乳业奶牛养殖场的牛粪中分离获得的。其分离过程：采集新鲜牛粪，称取粪样10g，放置在装有玻璃珠的90ml无菌水中，剧烈振荡10分钟，静置5分钟。吸取牛粪稀释液20ul,滴入马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂平板上，距离平板中央2.3cm处，3个直径4mm无菌滤纸片上。然后在平板中央接种番茄枯萎病病原真菌。置28℃恒温培养5d，逐日观察记载抑菌效果。挑选抑菌明显的滤纸周围单菌落若干。按上述步骤，逐个验证其抑菌效果。选抑菌效果最佳的菌株，反复纯化后，保存于液体石蜡斜面试管中。

菌体形态特征：解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)为革兰氏阳性菌，好氧生长，杆状，长为3.0μm～3.3μm，宽为1.0μm～1.2μm，内生芽孢，有鞭毛；在肉汁琼脂培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐。经16SrDNA同源性系列分析：在GenBank数据库中比对结果显示，PB-4(T4,4)菌株属于芽孢杆菌属；与解淀粉芽孢杆菌聚为一群，具有98％、99％的相似性，确定PB-4(T4,4)菌株为解淀粉芽孢杆菌。

菌株生理生化反应：解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)葡萄糖发酵实验阳性、淀粉水解实验阳性、明胶液化实验阳性、V.P反应阳性、接触酶反应阳性、甲基红反应阳性、硝酸盐还原实验阳性、柠檬酸盐利用阳性；可在pH值为6.0～9.0生长，适宜生长温度为25～39℃。PB-4(T4,4)培养物，经121℃高压灭菌10min和100℃恒温水浴10min,相对未经热处理的培养物，仍有80％以上的抑菌活性。

2.本发明提供解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂的制备方法

(1)菌种活化：取液体石蜡中冷藏保存的解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)，划线接种于蛋白胨15g、酵母膏5g、葡萄糖5g、琼脂斜面培养基(PYJ)上，28～36℃培养30～48h，连续转管2次使菌种得到活化。备用。

(2)种子液培养：将活化菌种接种于装有100mlPYJ培养液的250ml三角瓶中，30～35℃，150～200r/min，恒温培养15～20h作为种子液。备用。

(3)液体调理剂的制备用豆制品废水“黄浆水”做水相：将种子液2～5ml接入“黄浆水”液体(HYW)发酵培养基中。培养基组分：“黄浆水”100ml，加入1～4g玉米粉、硫酸铵0.5～2g，碳酸钙1～1.5g，硫酸亚铁0.2～0.3g。150～200r/min，30～36℃发酵24～48h，可获得活菌数达2～5*10⁹cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)培养物。即为液体调理剂。

(3)固体调理剂的制备用各种廉价易得的农副产品做发酵料：将种子液3～10mL接入固体发酵料中。发酵料组分：豆皮粉:30～33℃g，麸皮25～30g，谷壳5～10g，豆饼粉5～10g，玉米粉12～20g，含水量20～30％；30～36℃静止培养50～72h，可获得活菌数≥4*10⁹cfu/g.干基培养物。即为固体调理剂。

3.本发明提供解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂的应用效果

(1)浸种解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)液体调理剂，浸泡番茄种子试验表明，10,000倍液可使种子发芽率达92.2％，比清水对照高7个百分点，且芽长、健壮。

(2)盆栽解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)液体调理剂T4-1(100倍液)，用于番茄连作枯萎病严重的病土。栽培60天时调查，调理剂T4-1和化学农药(D)的防控效果分别是85.72％和83.33％；在生产实践中，调理剂T4-1(100倍液)，即可明显控制番茄枯萎病发病，可以替代化学农药；若苗期再灌根一次，防控率会更高。

(3)穴施灌根解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂，当番茄苗高20～25cm移栽定植时,每穴施入PB-4(T4,4)10倍稀释剂2g；定植后45天，用PB-4(T4,4)调理剂500倍液20ml灌根。使大棚番茄枯萎病发病株率控制在8％以下。

(4)喷施当番茄生长高达180cm以上晚疫病严重发生时，每株喷施PB-4(T4,4)液体调理剂100倍液15ml，3天喷一次，连续喷施3次，番茄晚疫病的防控率高达97％，比化学农药代森锰锌+叶面肥防治率为80％高出17个百分点。从植株生长和构成产量的相关因素看，调理剂有明显的促生长效果。

本发明的实质性特点和显著效果是：

1、本发明促生抑菌防病解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)，是从牛粪中分离获得的革兰氏阳性菌。具有在种植番茄的土壤和番茄根、茎部定殖的能力，是一株极具有开发应用价值的生防菌株。

2、本发明解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)，同时产生抗菌蛋白、酶和抗菌素3类促生、抑菌物质，具有促生防病、抑菌谱广等多重功效；

3、本发明解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂，用豆制品废水和农副产品下脚料生产，原料易得，成本低廉，无“三废排出”，可批量生产和推广应用；

4、本发明解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂，可用于番茄育苗基质中，移栽时穴施、苗期灌根，番茄枯萎病防效达到92％以上；对温室番茄晚疫病的防控率也高达97.8％；对黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌等多种植物病原真菌具有较高抑菌防病效果；可减少或替代化学农药，有利于保护农田生态环境，适合于我国无公害农产品生产的要求。

具体实施方式：

一、本实施方式中解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)菌株特征

1.本发明为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens.sp)Pb-4(T4,4)，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCC N0.7155，保藏日期为2013年1月18日。

2.解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)是从太原市小店区永昌乳业奶牛养殖场的牛粪中分离获得的。解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)为革兰氏阳性菌，好氧生长，杆状，长为3.0μm～3.3μm，宽为1.0μm～1.2μm，内生芽孢，有鞭毛；在肉汁琼脂培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐。经16SrDNA同源性系列分析：在GenBank数据库中比对结果显示，PB-4(T4,4)菌株属于芽孢杆菌属；与解淀粉芽孢杆菌聚为一群，具有98％、99％的相似性，确定PB-4(T4,4)菌株为解淀粉芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)葡萄糖发酵实验阳性、淀粉水解实验阳性、明胶液化实验阳性、V.P反应阳性、接触酶反应阳性、甲基红反应阳性、硝酸盐还原实验阳性、柠檬酸盐利用阳性；可在pH值为6.0～9.0生长，适宜生长温度为25～39℃。PB-4(T4,4)培养物，经121℃高压灭菌10min和100℃恒温水浴10min,相对未经热处理的培养物，仍有80％以上的抑菌活性。

二、本实施方式中解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂的制备方法

1.菌种活化取液体石蜡中冷藏保存的解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)，划线接种于蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、琼脂斜面培养基(PYJ)上，28～35℃培养30～48h，连续转管2次使菌种得到活化。

2.种子液制备将活化的菌种，接种于装有100mlPYJ培养液的250ml三角瓶中，30～35℃，150～200r/min，恒温培养15～20h作为种子液。

3.液体调理剂制备采用太原市知名企业“六味斋”豆制品加工厂的废水---黄浆水，做液体调理剂发酵的水相，其主要的化学性质见表1

表1 太原市“六味斋”豆制品厂黄浆水测定结果

项目	pH	COD(mg/L)	N(mg/L)	P(mg/L)	K(mg/L)	Ca(mg/L)	Mg(mg/L)	S(mg/L)
									测定值	4.62	20000	1173	137	2850	0	500	149

将黄浆水煮沸，添加1～4g玉米粉、硫酸铵0.5～2g，碳酸钙1～1.5g，硫酸亚铁0.2～0.3g，组成HYW发酵培养基，调pH为中性；分装于500ml三角瓶中，装液量为20～40％；121高压灭菌25～30min。冷却至45℃左右时，接入2～5％的种子液；150～200r/min，30～35℃发酵24～48h，可获得活菌数达2～5*10⁹cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)培养物。即为液体调理剂。

该调理剂生产的独到之处：利用豆制品废水加玉米粉，减少了蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖等常规培养基用精料，廉价、环保，工艺简单，生产过程无“三废”排出。

(3)固体调理剂的制备用各种廉价易得的农副产品做发酵料：发酵料组分：豆皮粉:30～33g，麸皮25～30g，谷壳5～10g，豆饼粉5～10g，玉米粉12～20g，含水量20～30％；调pH为中性；121℃高压灭菌1h。待冷却至45℃左右时，将3～10％种子液接入固体发酵料中。30～35℃静止培养50～72h，可获得活菌数≥4*10⁹cfu/g.干基培养物。即为固体调理剂。

该调理剂生产的特点是，利用大豆收获期间废弃的豆荚皮、豆秸、谷壳等农副产品下脚料，同样价廉、环保，发酵产物效价高，无“三废”排出。

三、本实施方式中解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)抑菌谱

采用对峙培养方法确定菌株抑菌谱，供试病原菌有5种，为Fusariumoxysporum(番茄枯萎病菌)Fusarium.oxysporum cucumber(黄瓜枯萎病菌)、Fusarium oxysporum niveum(西瓜枯萎病菌)、Fusarium oxysporum(青椒枯萎病菌)、Phytophthora capsici Leonian(辣椒疫霉病菌)。在土豆、葡萄糖、琼脂培养基(PDA)平板中央，接种上述5种病原菌，吸取PB-4(T4,4)液体调理剂10ul,注入放置在距离病原菌3cm处￠4mm的无菌滤纸片上，20～29℃培养5～7d，测量抑菌带宽度，试验结果如表2所示.表中看到，PB-4(T4,4)对上述病原菌的抑菌带宽度均在16mm以上，表明PB-4(T4,4)不仅抑菌谱广，抑菌作用也较强。

表2 解淀粉芽孢杆菌PB--4(T4,4)对5种病原菌的抑菌效果

病原菌株	抑菌带宽(mm)
		F.oxysporum tomato(番茄枯萎病菌)	16.07±0.96
F.oxysporum cucumber(黄瓜枯萎病菌)	16.70±0.90
		F.oxysporum watermelon(西瓜枯萎病菌)	18.60±0.70
F.oxysporum green pepper(青椒枯萎病菌)	16.27±0.96
		Phytophthora capsici Leonian(辣椒疫霉病菌)	19.40±0.60

四、本实施方式中解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)抑菌物质的确定

1.抑菌蛋白的确定取培养48h的PB-4(T4,4)菌液；15000r/min离心15min，得上清液；在上清液中加入粉状硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到80％，4℃冰箱过夜。次日，10000r/min离心15min，弃上清，用适量的Tris-HCL缓冲液(20mmol/L,pH7.5)溶解沉淀。然后用同一缓冲液透析48h(4℃)，PEG6000浓缩，制得粗提蛋白液；将粗提蛋白在沸水中保温15min，分别将上清液，蛋白粗提液及高温处理的蛋白液，进行抑制病原菌活性检测。抑菌带宽分别是：10.53mm、19.89mm、17.55mm，高温处理后的抑菌活性是未处理蛋白的88.2％。

2.非蛋白性抑菌物(抗菌素)的确定取培养48h的PB-4(T4,4)菌液；8000r/min离心15min，取上清液，分别加入等体积的乙醚、苯，封闭并剧烈振荡，静置。取有机相于三角瓶中，重复2～3次，待有机物挥发干净后，用无水乙醇溶解残留物，进行抑制病原菌活性检测。抑菌带宽分别是：乙醚提取物15.96mm、苯提取物13.30mm。

3几丁质酶和葡聚糖酶的确定

(1)几丁质酶确定：将PB-4(T4,4)菌株接种于以几丁质为唯一碳源的培养基上。3天后，菌株不仅能在几丁质培养基上迅速生长，且观察到菌落下面的区域有液化现象，则确认该菌株有分解利用几丁质的酶活性。这种酶可以分解番茄病原菌细胞壁中的几丁质。

(2)β-1，3-葡聚糖确定：将PB-4(T4,4)菌株接种于β-1，3-葡聚糖培养基上。接种后第3天，菌株将培养基茯苓粉中的β-1，3-葡聚糖与苯胺蓝结合生成的蓝色，催化水解，呈现无色的水解圈，使蓝色变浅渐消失。则确认该菌株有分解β-1，3-葡聚糖酶活性。这种酶可以分解病原菌菌丝体中的葡聚糖

五、本实施方式中解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂的应用效果

1、解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂浸种浓度试验

供试作物：番茄供试品种：华冠三号

供试调理剂：2x10⁹cuf/ml PB-4(T4,4)菌液

供试农药：50％多菌灵可湿性粉剂

设置处理：清水(对照)，50％多菌灵600倍液(对照)，调理剂原液、10倍液、100倍液、1000倍液浸种。

处理方法：选择饱满无杂质的番茄种子30粒，用清水漂洗后，置100ml小烧杯中，用上述六种液体浸泡6h，捞出放在无菌滤纸上吸去多余水分，放在铺有无菌滤纸，并用无菌水浸湿的￠9mm的培养皿中。置25℃恒温培养箱中。

试验结果调查表明，PB-4(T4,4)1000倍液浸泡番茄种子，发芽率可达92.2％，比清水对照高7个百分点；从芽长比较，可以看出调理剂明显的促生长作用。见表3

表3 解淀粉芽孢杆菌PB--4(T4,4)浸种浓度比较试验

处理	试验数(粒)	发芽数(粒)	发芽率(％)	芽长(mm)
					清水	30	25.67	85.6	15.0
50％多菌灵600倍液	30	20.00	66.7	10.7
					调理剂原液	30	4.67	15.5	5.6
调理剂10倍液	30	25.67	85.6	13.2
					调理剂100倍液	30	26.33	87.8	17.6
调理剂1000倍液	30	27.67	92.2	19.3

注：表中数据为3次重复的平均数

2、解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂用于盆栽番茄促生抑菌试验

供试作物：番茄苗(15～20cm高) 供试品种：华冠三号

试验地点：山西省农科院园艺所温室

供试土壤：采自太谷县冀村番茄枯萎病发生严重的大棚内，0～30cm土层

供试器皿：￠20x20cm塑料盆，盆底钻￠1.5cm的孔，盆底加2.5cm高的托盘。每盆装土4kg。

供试病原菌：本实验室分离自番茄枯萎病植株，并回接侵染番茄的尖孢镰刀菌(B)。用草炭稀释，每盆加入11g，使盆土中病原菌数达1.2x10⁴cuf/g。

供试农药：50％多菌灵可湿性粉剂(D)，每盆加入150mg用10.5g草炭稀释。

供试调理剂：解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂，T4-1是用草炭稀释，每盆10g，使盆土中调理剂菌数达3x10⁷cuf/g；T4-2为3x10⁸cuf/g.

试验处理：①温室病菌土 ②病土+T4-1 ③病土+D ④病土+B ⑤病土+B+T4-1 ⑥病土+B+T4-2 ⑦病土+B+D，7个处理，8次重复，每盆3株。

试验方法：先将PB-4(T4,4)调理剂和多菌灵拌入盆土，在盆底盘中浇水200mlx2,水通过盆地的小孔渗入土中。2天后，拌入病原菌。移栽番茄后，上部浇水300ml，底盘中再浇水200ml。生育期内，只在底盘中浇水，保持盆内不干。

调查分析：番茄栽培60天时，解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂防控番茄枯萎病的效果见表4。当不另加病原菌时，调理剂T4-1和化学农药(D)的防控效果分别是85.72％和83.33％；可见，在生产实践中，调理剂T4-1(100倍液)，即可明显控制番茄枯萎病发病，可以替代化学农药；若苗期再灌根一次，防控率会更高。而人为加入病原菌(B)，使盆土中病原菌数达1.2x10⁴cuf/g后，只有加大调理剂用量T4-2，防控效果才能达到87.09％。

表4 PB--4(T4,4)防控盆栽番茄枯萎病情况

调查发现，解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂T4-1和T4-2，都对番茄生长有着显著的促生长作用。见表5。

表5 PB--4(T4,4)调理剂对番茄生物学特性的影响

3、穴施灌根解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂穴施、灌根防控番茄枯萎病效果

试验地点：曲沃县张范村番茄连作大棚

试验方法：当番茄苗高20～25cm移栽定植时,每穴施入PB-4(T4,4)10倍稀释剂2g；定植后45天，用PB-4(T4,4)液体调理剂500倍液20ml灌根。

试验结果：当番茄生长高达180cm以上时，枯萎病严重发生。调查发现，经PB-4(T4,4)调理剂穴施、灌根的番茄枯萎病的发病株率只有8％，而对照区达到12～32％。

4、喷施解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂防治番茄晚疫病效果

试验地点：曲沃县张范村番茄连作大棚

试验方法：当番茄生长高达180cm以上晚疫病严重发生时，每株喷施PB-4(T4,4)液体调理剂100倍液15ml，3天喷一次，连续喷施3次，番茄晚疫病的防控率高达97.8％，比化学农药代森锰锌+叶面肥防治率为80％高出17个百分点。解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂可以替代化学农药防治番茄晚疫病。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌Pb-4的调理剂制备方法，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens sp.)Pb-4，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCC N0.7155，保藏日期为2013年1月18日；该调理剂用于植物的促生抑菌防病；其特征在于：

一种解淀粉芽孢杆菌Pb-4的液体调理剂制备方法：

(1)菌种活化：取液体石蜡中冷藏保存的解淀粉芽孢杆菌Pb-4，划线接种于包含蛋白胨15g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖5g/L和水的琼脂斜面培养基上，28～36℃培养30～48h，连续转管2次使菌种得到活化，备用；

(2)种子液培养：将活化菌种接种于装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，30～35℃，150～200r/min，恒温培养15～20h作为种子液，备用；其中所述液体培养基由蛋白胨15g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖5g/L和水组成；

(3)液体调理剂的制备用豆制品废水“黄浆水”做水相：将种子液2～5ml接入“黄浆水”发酵培养液中；培养液组分：“黄浆水”100ml，加入玉米粉1～4g,硫酸铵0.5～2g，碳酸钙1～1.5g，硫酸亚铁0.2～0.3g；150～200r/min，30～36℃发酵24～48h，可获得活菌数达2～5×10⁹cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌Pb-4培养物，即为液体调理剂。

2.一种解淀粉芽孢杆菌Pb-4固体调理剂的制备方法：

(1)菌种活化：取液体石蜡中冷藏保存的保藏编号为CGMCC N0.7155的解淀粉芽孢杆菌Pb-4，划线接种于包含蛋白胨15g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖5g/L和水的琼脂斜面培养基上，28～36℃培养30～48h，连续转管2次使菌种得到活化，备用；

(3)用各种廉价易得的农副产品做发酵料，将种子液3～10mL接入固体发酵料中；

所述的发酵料的组分：豆皮粉:30～33g，麸皮25～30g，谷壳5～10g，豆饼粉5～10g，玉米粉12～20g，含水量20～30％；在30～36℃温度内静止培养50～72h，获得活菌数≥4×10⁹cfu/g干基培养物；即为固体调理剂。