CN102505010A

CN102505010A - 木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法

Info

Publication number: CN102505010A
Application number: CN2011103229536A
Authority: CN
Inventors: 王秉丽; 陈捷; 孙兴全; 李雅乾
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2012-06-20

Abstract

本发明涉及一种木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，步骤为：哈茨木霉菌株Trichoderma harzianum SH2303 CGMCCNO.4963在PDA上培养2～3d，用直径5mm的打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基5～7d后接入产孢培养基中，在300L发酵罐中优化培养条件下发酵5～7d，厚壁孢子达6～7×10⁸个/mL；将所得发酵液与载体按重量比1:1混合，常温下进行二次开放式固体发酵5～7d，木霉分生孢子和厚垣孢子达20～50亿/g。本发明制得的土壤改良剂以改良蔬菜种植土壤初生和次生盐渍化、降解有机磷农药残留土壤为主要目标，兼治土传病害，促进作物生长，提高农作物产量；由于仅利用一种木霉菌株，发酵工艺容易优化，菌剂制备成本低，易于商业化大规模推广，具有很高的田间普遍使用价值。

Description

木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物菌土壤改良剂技术领域，具体涉及一种木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法。

背景技术

据报导我国设施蔬菜面积已达5020万亩；产量1.68亿吨，占全国蔬菜总产量的25%；总产值4100多亿元，占蔬菜总产值的51%。然而土壤连作障碍长期是影响我国设施蔬菜的主要问题，目前我国连作障碍比较严重的约占蔬菜种植面积的20～25％，由于连作障碍引发生的当季作物造成的损失在20～80％，严重的几乎绝产。引起连作障碍的主要原因：①蔬菜的化感作用以及根系分泌物的自毒作用。连作蔬菜产生毒素在土壤中积累响根系的呼吸作用。②复种指数过高。过度消耗土壤营养、修复时间不足。③病原过度积累。连作过度或轮作不足，导致病残体分解不充分、病原大量积累，一旦条件适合发病加重。④肥料质量差。未经过充分腐熟的牲畜粪便也会带来病菌和微生物污染。⑤土壤盐渍化严重。上海市滨海初生盐渍土约占全市土壤资源的15%。初生或次生盐渍化土壤很难用于蔬菜的可持续生产。⑥微生态多样性下降。设施栽培条件下土壤的干湿交替不明显，造成土壤长期处于厌气环境，一些好气性的微生物生长受到抑制。破坏了土壤生物的多样性，微生物种群结构破环在众多连作障碍因素中，盐渍化是上海蔬菜安全生产中最关注的问题。上海市设施蔬菜次生盐渍化已相当严重。据报道，上海地区大棚蔬菜土壤的盐分高达0.49～0.93%，更甚者大棚芦笋的土壤含盐量则达2.21%，芦笋不长，整株死亡。截止2007年，根据土壤盐化程度分级标准，奉贤地区盐渍化土壤已经达到38.8%，浦东和金山地区盐渍化程度也达到14%。松江区盐渍化也日益严重，叶榭、泖港等6个镇、街道设施蔬菜总面积564．6hm²，其中已有土壤次生盐渍化危害的达141．7hm²，占总面积的25.1％；3年以上设施与3年以内设施相比，土壤次生盐渍化发生面积大，危害程度高，盐渍化严重面积达41.1hm²，比3年以内设施多28.6hm²；同时，由真菌等病原体引起的土传病害面积已达343.1hm²，占设施蔬菜总面积的60.76％。对南汇和崇明两区设施栽培大棚的调查显示：随着栽培时间的增加,土壤表层（0～5 cm)有机质变化不明显；而土壤中硝态氮和总盐量增加，连续栽培15年土壤的硝态氮（94.23mg/kg)是露地表层土的14.8倍，EC值是露地的14.9倍；从第5年起土壤出现酸化现象，次生盐渍化越严重，对土壤脲酶、磷酸酶和呼吸强度的抑制越明显，连续栽培15年土壤脲酶活性受抑制率达到71.8%。同时，上海的城市绿化也受到严重影响，上海临港新城绿化陷盐碱之困，新城的土壤pH大于8.5（适宜植物生长的土壤pH在6.5在7.5之间），不少草坪已经退化、枯死，罗汉松、蜀桧、香樟等苗木长势较弱，叶片稀少。针对初生和次生盐渍化，国内外目前主要采用的治理技术主要有生物和非生物的土壤改良剂。

土壤改良剂按原料来源可分为非生物改良剂（天然改良剂、人工合成改良剂、天然-合成共聚物改良剂）和生物改良剂等。天然改良剂主要是通过改善土壤结构、提高土壤的保水能力、提高土壤保肥能力和增加土壤肥力等作用来改善土壤。尽管效果明显，但是，天然矿物在实际应用中存在一些理论和技术问题，如施用量、施用方式、施用时间及天然矿物的储量对其大面积推广应用的限制等。合成改良剂是模拟天然改良剂人工合成的高分子有机聚合物。国内外研究和应用的人工合成土壤改良剂有聚丙烯酰胺(Polyacrylamide，PAM)、聚乙烯醇树脂、聚乙烯醇、聚乙二醇、脲醛树脂等，其中PAM是研究者最为关注的人工合成土壤改良剂。但是其不足之处在于成本较高、机制不清楚。目前研究和应用的生物改良剂包括一些生物控制剂、有机肥、微生物菌肥、绿肥植物、菌根、好氧堆制茶、蚯蚓（例如唐山市丰润区天龙蚯蚓开发有限公司）等，其中研究应用较多的有机肥、微生物菌肥、有丛枝菌根（AM）。但是目前很多生物土壤改良剂是由动物粪便、农业废弃物等发酵而来，活性成分种类繁多，其活性受到生产条件影响较大。

国内目前对土壤改良剂的开发及商品化也取得了一定的成就，主要土壤改良产品有北京飞鹰绿地科技发展有限公司研发的禾康，其活性成分为有极大分子；北京卓越东方科技有限公司研发的Excellence Soil Amendment 50 土壤改良剂，其有效成分是线性功能性高分子聚合物；杭州旺源生物技术有限公司成产的土壤改良剂1#，是以牛粪、硬木片等为主要原料，在加入美国原种生物菌，经60℃以上高温发醇，并堆置安定的纯有机产品；日照益康有机农业科技发展有限公司推出的海晟宝，是利用海藻生物菌微生物技术，也就是人为地向土壤加入有益微生物原液，改变土壤生态系统的组成，从而改善土壤；保水剂（文安县松阳化工有限公司）、“E-2001”土壤改良剂（烟台博洁农业技术开发有限公司）、筑田菌剂（长春富田生物科技有限公司）、澳甘霖土壤改良精华素（重庆澳甘霖发展有限公司）、美亚土壤改良剂、山佰松、施地佳、发润土壤改良剂及康地宝土壤改良剂等等。这些商品化改良剂在土壤改良方面起到一定的显著效果。

在土壤改良剂应用过程中，也存在一些问题急待解决：①天然改良剂改良效果有限，主要表现在持续期短或储量不足等问题。②人工合成的高分子改良剂成本高，有引起对环境二次污染的风险，从而限制了它的广泛应用。③非生物土壤改良剂往往功能单一，修复效果不全面或有不同程度的负面影响等问题。

相比之下，由于生物改良剂主要是有益微生物组成，具有环境友好的优势，修复功能多样，修复效果可持续性强，开发和应用潜力大。目前国内应用的微生物土壤改良剂主要是光合菌、共生良好的乳酸菌和酵母菌、枯草芽孢杆菌、解磷菌、解钾菌、固氮菌、小分子甲壳素及多种分解酵素等组成。可有效转化底肥，释出小分子养份与活性因子，改良土壤肥份，调节土壤PH值，改善土壤团粒结构，构建有益菌群优势。同时能有效抑制土壤传染性病虫害的发生，如猝倒病、枯萎病、青枯病、线虫、根腐病等。还能减少化肥、化学农药残留、盐渍化对土壤质地的影响。但存在的问题所含菌种过多，导致发酵制备工艺复杂，生产成本高，商业化推广难。　木霉菌作为国际公认的生防真菌，不仅能对至少29个属18种的病原菌产生拮抗作用，并且已证明还能促进作物生长、改良土壤环境、提高农产品品质。但是目前国内具有自主知识产权的木霉菌土壤改良剂还不多见。目前国内较好的木霉改良剂，如Bio-Green Planet 土壤改良剂，是由木霉菌和杆菌等有益微生物组成，活孢子数为20亿/g，主要用于土传病原菌的防控，促进作物生长，但并没有表明具有减少盐渍化和降解有机磷农药残留的功能，而具其核心技术是来自美国的技术，产品价格较高。

发明内容

本发明的目的在于针对国内外缺少能高效治理设施菜田土壤盐渍化和有机磷农药残留，同时能兼治防治多种土传病害的微生物土壤改良剂的不足，提供了一种制备工艺简单、生产成本低，仅以一种多功能木霉菌株（Trichoderma harzianum ,编号SH2303）为核心的多功能土壤改良剂的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，哈茨木霉菌株Trichoderma harzianum SH2303 CGMCC NO.4963在PDA培养基上培养2～3d，用直径为5mm的打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基5～7d；

步骤二，将步骤一中制得的木霉菌株SH2303种子菌接入产孢培养基中，在300L发酵罐中优化培养条件下发酵5～7d，厚壁孢子达6～7×10⁸个/mL；

步骤三，将步骤二中制得的发酵液与载体按重量比1:1混合，常温下进行二次开放式固体发酵5～7d，木霉分生孢子和厚垣孢子达20～50亿/g。

优选的，步骤一中所述PDA培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。

优选的，步骤一中所述种子培养基成份为：玉米粉4g，水100mL；所述培养基pH值为4。

优选的，步骤二中所述产孢培养基成份为：玉米粉 40g/L, NH₄H₂PO₄ 140 g/L,牛肉膏 540 g/L, Na₃PO₄ 340 g/L, CuSO₄.5H₂O 0.0640 g/L, ZnSO₄.7H₂O 0.0640 g/L, MnSO₄.H₂O 0.0240g/L；

优选的，步骤二中所述优化培养条件为：为转速 240r/m，温度 28℃，pH 4，溶氧量80mg/L。

优选的，步骤三中所述载体为稻壳、硅藻土和麸皮按重量比3:9:3混合而成。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明制得的土壤改良剂以改良蔬菜种植土壤初生和次生盐渍化、降解有机磷农药残留土壤为主要目标，同时能兼治土传病害，促进作物生长，提高农作物产量；由于仅利用一种木霉菌株，发酵工艺容易优化，菌剂制备成本低，易于商业化大规模推广；尤其适用于初生盐渍化严重或连作障碍严重的设施菜田土壤修复；具有很高的田间普遍使用价值。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中涉及的木霉菌具体为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum 菌株SH2303，是从华东地区农田土壤分离、纯化、筛选而来的，其保藏信息为：该菌株已于2011年6月17日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 NO.4963；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所 100101。

实施例1、木霉菌土壤改良剂的制备

木霉菌土壤改良剂的制备，包括以下步骤：

步骤一，木霉菌株Trichoderma harzianum SH2303 CGMCC NO.4963在PDA培养基上培养3d，用直径为5mm的打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基5d；

步骤二，将步骤一中制得的木霉菌株SH2303种子菌接入产孢培养基中，在300L发酵罐中优化培养条件下发酵7d，厚壁孢子达6～7×10⁸个/mL；

步骤三，将步骤二中制得的发酵液与载体按重量比1:1混合，常温下进行二次开放式固体发酵7d，木霉分生孢子和厚垣孢子达50亿/g。

其中，步骤一中所述PDA培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。所述种子培养基成份为：玉米粉4g，水100mL；所述培养基pH值为4。

步骤二中所述产孢培养基成份为：玉米粉 40g/L, NH₄H₂PO₄ 140 g/L,牛肉膏 540 g/L, Na₃PO₄ 340 g/L, CuSO₄.5H₂O 0.0640 g/L, ZnSO₄.7H₂O 0.0640 g/L, MnSO₄.H₂O 0.0240g/L。所述优化培养条件为：为转速 240r/m，温度 28℃，pH 4，溶氧量80mg/L。

步骤三中所述载体为稻壳、硅藻土和麸皮按重量比3:9:3混合而成。

实施例2、木霉菌土壤改良剂的制备

本实施例同实施例1，所不同之处在于：步骤一中，在PDA培养基上培养2d，用直径为5mm的打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基7d；步骤二中，优化培养条件下发酵为5d；步骤三中，固体发酵为5d，木霉分生孢子和厚垣孢子达20亿/g。

实施例3、木霉菌土壤改良剂的制备

本实施例同实施例1，所不同之处在于：步骤一中，在PDA培养基上培养2.5d，用直径为5mm的打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基6d；步骤二中，优化培养条件下发酵为6d；步骤三中，固体发酵为6d，木霉分生孢子和厚垣孢子达35亿/g。

实施例4、木霉菌土壤改良剂对土壤理化性质的改善试验

步骤一：土壤处理。对长兴岛三个盐渍化比较严重的蔬菜大棚（共计1.5亩），进行以下操作处理：设施菜地深翻后，耙匀；每个大棚都分处理和对照两试验小区，挖地沟隔开；处理小区用实施例1中制得的木霉菌土壤改良剂均匀撒施处理，用量为20kg/亩，试验以常规商用有机肥做对照（100kg/亩）；再次耙匀，灌水湿润。

步骤二：播种。均匀撒播小白菜（Brassica chinensis）即俗称的鸡毛菜，种子用量为500g/亩，然后耙土覆盖。

步骤三：取样。15d后，按照5点取样法用取样器取5～10cm土层深度的土壤。

步骤四：检测。将采集的处理小区土壤和对照小区土样分别混合，均匀后送至澳实（上海）检测公司进行土壤理化性质的检测，结果如表1所示。

表1 木霉菌土壤改良剂对土壤理化性质的改变

由表1可知：与对照相比，土壤全盐量下降29.6%，土壤速效钾增加29.5%，速效氮增加51.72%，速效效磷增加28.57%，总氮磷钾分别增加18.6%、20.83%和28.9%。木霉菌改良过的土壤出苗率高达90%，对照仅为20%；该实例结果表明木霉菌对土壤具有明显的修复作用。

实施例5、木霉菌土壤改良剂对黄瓜的生长促进试验

步骤一：土壤处理。设施菜田（金山明缘果蔬专业合作社，6个温室大棚，总计3亩）深翻后，耙匀；每温室大棚分5纵畦，第2、4畦做对照，不用木霉土壤改良剂处理；第1、3、5畦为处理，将实施例1中制得的木霉菌土壤改良剂匀撒施在土壤表面，用量为20kg/亩。再次耙匀，灌水。步骤二：移栽。移栽入黄瓜（新4号）幼苗，同时处理畦以20kg/亩用量灌根。

步骤三：测量。坐果期，测量黄瓜的株高、叶片数及坐果数；结果如表2所示。

表2 木霉菌土壤改良剂对黄瓜的生长促进作用

由表2可知：与对照相比，木霉菌土壤改良剂对黄瓜生长的促进作用明显。处理的黄瓜株高是对照黄瓜株高的2.6倍，每株黄瓜叶片数平均增加65,28%，处理黄瓜植株的坐果数比对照植株增加66.7%。

实施例6、木霉菌土壤改良剂对黄瓜枯萎病的防治试验

步骤一：土壤处理。设施菜田（浦东关祥番茄种植合作社，4个温室大棚，总计2亩）深翻后，耙匀；将每个温室自南到北均分为6等区间，第1、3、5块作为处理，第2、4、6块做对照；处理区间用实施例1中制得的木霉菌土壤改良剂（20kg/亩）进行均匀撒施，耙匀，灌水；3对照区间不施木霉菌改良剂。

步骤二：移栽。移栽入黄瓜（黑瓜）幼苗，同时处理畦以20kg/亩用量灌根。

步骤三：数据采集分析。大棚内5点取样，每点调查20株，统计枯萎病的发病率、计算防效；计算数据用DPS软件进行统计分析，检验各处理平均值之间的差异显著性；结果如表3所示。

表3 木霉菌土壤改良剂对黄瓜枯萎病的防治作用

表3的试验结果显示，木霉菌土壤改良剂能有效的防治黄瓜枯萎病的发生，木霉菌处理后枯萎病发病率明显降低，防效达到71.71%。

实施例7、木霉菌土壤改良剂对莴笋品质的影响试验

步骤一：土壤处理。交大七宝农场的1亩试验地按如下操作处理，菜地深翻后，耙匀，将其自南到北均分为6等区间，第1、3、5块作为处理，第2、4、6块做对照；处理区间用实施例2中制得的木霉菌土壤改良剂（20kg/亩）进行均匀撒施，耙匀，灌水；3对照区间以不施木霉菌改良剂为对照。

步骤二：移栽。移栽莴笋（品种：夏抗）幼苗，密度为20cm。

步骤三：取样。40d后取肉质茎。

步骤四：测样。将步骤三中所取样品送往珠海市出入境检验检疫局检验检疫技术中心，按照国际标准对取样进行品质检测，检测标准包括热量、碳水化合物、饱和脂肪酸、反式脂肪酸、总膳食纤维、总糖、蛋白质、脂肪和钠；结果如表4所示。

表4 木霉菌土壤改良剂对莴笋品质的影响

由表4可知：与对照相比，木霉菌生物土壤改良剂处理过的莴笋热量增加27.12%，碳水化合物含量增加45%，饱和脂肪酸含量增加33.3%，总糖含量增加44.4%，蛋白质含量增加3.6%。

实施例8、木霉菌土壤改良剂对土壤重金属及硝态氮的修复试验

步骤一：土壤处理。交大七宝农场的1亩试验地按如下操作处理，菜地深翻后，耙匀，将其自南到北均分为6等区间，第1、3、5块作为处理，第2、4、6块做对照；处理区间用实施例3中制得的木霉菌土壤改良剂（20kg/亩）进行均匀撒施，耙匀，灌水；3对照区间以不施木霉菌改良剂为对照。

步骤二：播种。撒播油菜（品种：沪油17）幼苗，播种量0.6kg/亩。

步骤三：取土样。按照5点取样法，45d后拔油菜，取根际土，每区间取根际土200g。

步骤四：测样。将步骤三中所取处理每区间土壤和对照区间土壤分别混匀，送往澳实（上海）检测有限公司，按照国家标准对取样进行理化性质的检测，检测指标包括镉、锌、铅及硝氮；结果如表5所示。

表5 土壤菌改良剂对土壤重金属及硝态氮的修复效果

由表5可知：使用木霉菌土壤改良剂后，土壤中的铜含量下降8%，锌含量下降16.9%，硝氮的含量下降75.6%；说明土壤菌改良剂能明显降低土壤中的铜、镉、锌及硝酸盐亚硝酸盐含量。

实施例9、木霉菌土壤改良剂对土壤辛硫磷的降解试验

步骤一：土壤（来自闵行交大农场）灭菌（160℃），降温，粉碎机粉碎，过80目筛子；取商用辛硫磷，按照使用说明，1000倍稀释得稀释液。

步骤二：用步骤一所得稀释辛硫磷液体润湿步骤一的土壤，使之湿度为15%。

步骤三：将用农药处理过的土壤平6分份，处理组（3份）按5%（木霉菌改良剂w：湿土w）加入实施例1中制得的木霉菌土壤改良剂；对照组（3份）不做处理。

步骤四：将处理组和对照组均放入28℃恒温培养箱中培养，7d后测乙酰胆碱酯酶活抑制率；结果如表6所示。

表 6 木霉菌土壤改良剂对土壤辛硫磷的降解作用

由表6可知：用了木霉菌土壤改良剂的处理对乙酰胆碱酯酶酶活的抑制作用较小，为24.62，说明大量的辛硫磷被木霉菌降解。

Claims

1.一种木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，哈茨木霉菌株Trichoderma harzianum SH2303 CGMCC NO.4963在PDA培养基上培养2～3d，用打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基5～7d；

2.根据权利要求1所述的木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，其特征在于，步骤一中所述PDA培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。

3.根据权利要求1所述的木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，其特征在于，步骤一中所述种子培养基成份为：玉米粉4g，水100mL；所述培养基pH值为4。

4.根据权利要求1所述的木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，其特征在于，步骤二中所述产孢培养基成份为：玉米粉 40g/L, NH₄H₂PO₄ 140 g/L,牛肉膏 540 g/L, Na₃PO₄ 340 g/L, CuSO₄.5H₂O 0.0640 g/L, ZnSO₄.7H₂O 0.0640 g/L, MnSO₄.H₂O 0.0240g/L。

5.根据权利要求1所述的木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，其特征在于，步骤二中所述优化培养条件为：为转速 240r/m，温度 28℃，pH 4，溶氧量80mg/L。

6.根据权利要求1所述的木霉菌多功能土壤改良剂的制备方法，其特征在于，步骤三中所述载体为稻壳、硅藻土和麸皮按重量比3:9:3混合而成。