CN114032177A - 一种矩孢木霉及其土壤修复菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种矩孢木霉，该矩孢木霉的拉丁学名为Trichodermaoblongisporum，菌株号TR1389A，保藏号为CGMCC No.21437。本发明还公开了一种矩孢木霉土壤修复菌剂，该土壤修复菌剂含有矩孢木霉发酵制备的原粉。本发明的土壤修复剂能够调节土壤酸碱度，根据土壤酸碱度的不同，能迅速改善酸性土壤，调节PH值至6以上；能杀死土壤中的有害菌及线虫等，净化土壤防止土传病害的发生；同时使作物营养均衡，释放的矩孢木霉菌到土壤中，修复土壤微生物环境，所有成分均能被土壤接受，能有效遏制现在的土壤环境恶化造成的一系列恶性循环；并且其制备方法设备投资节省、制备工艺简单、制造成本低价格低廉。

Description

一种矩孢木霉及其土壤修复菌剂
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种矩孢木霉及其土壤修复菌剂。
背景技术
中国盐渍土分布于辽、吉、黑、冀、鲁、豫、晋、新、陕、甘、宁、青、苏、浙、皖、闽、粤、内蒙古及西藏等19个省区。按自然地理条件及土壤形成过程，划分为滨海湿润—半湿润海浸盐渍区、东北半湿润—半干旱草原—草甸盐渍区、黄淮海半湿润—半干旱旱作草甸盐渍区、甘新漠境盐渍区、青海漠境盐渍区及西藏高寒漠境盐渍区等8个分区。随着土地资源的紧张和粮食安全问题的日益凸显，寻求有效防治和改良盐碱化土壤的措施十分重要。
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在生物进化过程中，它们一直与动、植物共存。作为有机化合物的分解者和物质流动的传递者，在土壤生态系统的物质流、能量流和信息流的传递中，起到了不可忽视的作用。随着可持续无公害、绿色和有机农业的不断发展，多种土壤生物改良剂应运而生，对改善土壤理化性状、活化土壤中矿物质养分、提高植物营养吸收水平、改善土壤中有益微生物群体结构、增强植物的抗病和抗逆性能(抗旱、盐、酸)等方面起到了重要的作用，并显示出在土壤环境和资源保护方面的巨大潜力，目前已在许多农田生态系统中得到推广和应用。木霉菌(包括“矩孢”木霉)作为一种重要的土壤微生物，生存能力强，分布、适应性广，具有对物病原真菌拮抗和分解纤维素的能力，已引起人们广泛关注。木霉菌不仅能对多种真菌病害起到生物防治作用，还具有促进作物生长、修复重金属污染土壤以及改良盐渍化土壤等方面的功能。
因此，研究一种能够效防治和改良盐碱化土壤的土壤修复菌剂，是本领域技术人员急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种矩孢木霉及其土壤修复菌剂。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种矩孢木霉，所述矩孢木霉的拉丁学名为Trichoderma oblongisporum，菌株号TR1389A，保藏号为CGMCC No.21437。
本发明的矩孢木霉(Trichoderma oblongisporum)菌株保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2021年01月25日。
本发明的第二方面是提供一种矩孢木霉土壤修复菌剂，所述土壤修复菌剂含有所述矩孢木霉发酵制备的原粉，具体包括如下重量百分比的组分：
Figure BDA0002962560040000021
进一步地，所述土壤修复菌剂含有所述矩孢木霉发酵制备的原粉，具体包括如下重量百分比的组分：
Figure BDA0002962560040000022
进一步地，通过矩孢木霉发酵制备矩孢木霉原粉，包括如下步骤：将所述矩孢木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养；然后转移至培养液中进行摇瓶培养24-36h，得到一级种子液；然后向中级发酵罐中倒入所述一级种子液发酵6-8天，得到矩孢木霉发酵液；将所述矩孢木霉发酵液进行离心，获得木霉菌发酵浓缩液；将所述浓缩液通过喷雾干燥塔进行喷雾干燥获得矩孢木霉原粉。
进一步地，所述矩孢木霉土壤修复菌剂的有效菌含量≥2亿CFU/g。
进一步地，所述矩孢木霉土壤修复菌剂的有机质含量≥300g/kg。
本发明的土壤修复剂不能取代大量元素肥料(氮、磷、钾)类肥料，可与大量元素水溶肥、复合肥、复混肥等肥料配合施用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的土壤修复剂能够调节土壤酸碱度，根据土壤酸碱度的不同，能迅速改善酸性土壤，调节PH值至6以上；能杀死土壤中的有害菌及线虫等，净化土壤防止土传病害的发生；同时使作物营养均衡，释放的矩孢木霉菌到土壤中，修复土壤微生物环境，所有成分均能被土壤接受，能有效遏制现在的土壤环境恶化造成的一系列恶性循环；并且其制备方法设备投资节省、制备工艺简单、制造成本低价格低廉。
附图说明
图1为本发明矩孢木霉的分生孢子梗的电镜照片；
图2为本发明矩孢木霉的分生孢子形态的电镜照片；
图3为本发明矩孢木霉的PDA平板形态的照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种矩孢木霉，从陕西省汉中市番茄根围土中分离得到，上述矩孢木霉的拉丁学名为Trichoderma oblongisporum，菌株号TR1389A，保藏号为CGMCCNo.21437。
本发明的矩孢木霉(Trichoderma oblongisporum)菌株保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2021年01月25日。
矩孢木霉的分类鉴定：
上述矩孢木霉菌株菌落生长中等速度，偏快，培养4天后直径达6.5～7.5cm，PDA培养基上气生菌丝卷毛状，白色。分生孢子产生区平展，或者大小以及形状均不规则的致密产孢簇，直径一般为4mm，有时愈合成为大的产孢簇，由于有大量不分枝的分生孢子梗顶端不育延长物，产孢簇表面因此成为卷毛状，开始时为黄绿色，逐渐转变为茶绿色，最后为橄榄色。菌落反面为无色或者浅黄色(BLA)。无渗出物，有微弱的酵母气味。
参照图1～图3，上述矩孢木霉菌株的菌丝透明，壁光滑，直径多数为2～6μm，基内菌丝可达11μm。厚垣孢子少见，产生于基内菌丝上，顶生、单生，半透明，亚球形至阔椭圆形，直径可达8μm；分生孢子梗透明，壁光滑，基部直径9μm，向上逐渐变细，大部分区域的直径为4～6μm，分枝相对较少，多数以直角生出，初级分枝单生、互生或者对生，很少有再次分枝，终极分枝1～4个细胞，顶生细胞为柱形或者稍微膨大的柱形。3.5～6×2.8～4.4μm，分生孢子梗主轴上部有很长的直或者波曲的不育部分，在分生孢子梗可育部分的上部可以分枝一次或者两次，然后至顶约200μm的长度不再分枝，从可育部分向上逐渐变细，宽度3μm～6μm，顶端钝圆，分枝间距长(15～40μm)，瓶梗近似安瓿形，大小为3.3～6.6×2.9～3.6μm，基部略缩缢，顶部突然变细，形成短的分生孢子着生丝，直径0.6μm，稀疏，常常2～3个呈漩涡状排列，偶尔端生或者四个一组为漩涡状排列，平展产孢区的瓶梗长而且细，有时呈钻形。分生孢子椭圆形至短柱形，两端阔圆或者基部略细，大小为3.5～5.0×1.7～2.8μm(平均4.5×2.3μm)，壁光滑而且薄，半透明至浅绿色。
矩孢木霉的分子生物学菌种鉴定：
采用引物ITS4和ITS5扩增到ITS1-5.8S-ITS2区序列得到的序列段，通过NCBI GenBank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，该序列段与矩孢木霉的相似度达到99％。
ITS序列如下：
TCCTCCGGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAGTTTGGTTTGTTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCATGAGAGGCTGCGGCGAGGCCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGCCGGTTAAGGGCCGATCCCCAACGCCGGACCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAAACGCCCACTAGGGGCGCCGAGAAGGCTCAGATATAAAAAACCCGCGAGGGGGTATACAAAAGAGTTTTGGGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCTTGGTCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCAGAAATCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTTACTTCCA
采用引物Ef728和Tef1αR扩增Tef1α序列得到的序列段，通过NCBI Gen Bank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，TR1389A的Tef1α序列与矩孢木霉该段序列高度同源。
Tef1α序列如下：
TCATCGAGAAAAGTCGAGAAGGTAAGCTTCATCCACTGATTTTCGAGCTCAATTTCCCTCTTTTTTCATGCAATTCTCGAACGAATTTGCGCGTCGACAATTCTTCCCCTTCCGCATCATCACCCCGCTCTCGTTGCCTACCCCTCCTTTCCAGCGACGCAAAATTTTTTTGCTGCCATATTTTTTTGGTGGGGGTACGCATGTAGCGACCCCACCACAGCCTCAGGCTGCTTCATGCCTTTGTCTACCACCACACAAAACTCATCCATTCAAGCACATAAGCTCCAACGTCTTCACTTGTTACCTTCAGTGATGCTAATCATATTCCCCTCAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCTTTCAAGTACGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTGTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTCATTCATGGCTGTCATTCAACATCCACGAATCAGCGCTAATGCAAACCTCACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCCAGGCTGACTGCGCTATTCTCATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGGGATGGCA
通过分子生物学菌种鉴定并结合形态特征，可确定本发明分离的菌株为矩孢木霉株。
上述矩孢木霉菌株的分生孢子阶段为半知菌门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，丛梗孢(Moniliaceae)，木霉属(Trichoderma)，其有性态是属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、肉座目
(Hypocreales)、肉座科(Hypocreaceae)、肉座菌(Hypocrea)。
实施例2
本实施例提供一种土壤修复菌剂，上述土壤修复菌剂含有实施例1获得的矩孢木霉发酵制备的矩孢木霉原粉，上述矩孢木霉原粉的制备包括如下步骤：
步骤一，将实施例1分离得到的矩孢木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养；
步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24h，得到一级种子液；
步骤三，将中级发酵罐中的培养液121℃、15磅压力下灭菌20min后，保持正压，冷却至30℃，然后向中级发酵罐中倒入步骤二所得的一级种子液，加压通入无菌空气，在28～30℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/H空气流量和120～150rpm转速条下进行发酵6天，得到矩孢木霉发酵液；
步骤四，将上述矩孢木霉发酵液进行离心，获得木霉菌发酵浓缩液；将所述浓缩液通过喷雾干燥塔进行喷雾干燥获得矩孢木霉原粉。
其中，步骤二和步骤三中，上述培养液包括如下重量比的组分：
Figure BDA0002962560040000061
更优选地，上述培养液包括如下重量比的组分：
Figure BDA0002962560040000071
上述土壤修复菌剂，具体包括如下重量百分比的组分：
Figure BDA0002962560040000072
其制备方法为：将矩孢木霉原粉、草炭、生物炭、矿物腐殖酸钾、糖蜜粉、秸秆粉和复合氨基酸粉混合均匀，得到的土壤修复菌剂有效菌含量≥2亿CFU/g，有机质含量≥300g/kg。
应用例
将实施例2制备的矩孢木霉土壤修复菌剂进行田间土壤修复实验：
试验地点位于上海松丰蔬果专业合作社(上海市松江区叶榭镇)的联栋大棚内，区域3，棚号A13。该试验地为盐渍土，土壤0-20cm基本情况如下：pH 5.88、有机质13.8g/kg、EC值1.58ms/cm、速效磷352.8mg/kg、速效钾295.6mg/kg、铵态氮57.11mg/kg、总碱度0.014g/kg、碱化度6.12％、阳离子交换量18.4cmol+/kg、全盐量8.29g/kg，属于酸性重度盐渍土壤；0-20cm土壤层电导率较高，土壤电导率是测定土壤水溶性盐的指标，所以说明0-20cm土壤层中盐离子含量较高。
试验设计：试验以盐渍土种植棚为试验棚(约240m2)，划分为以下3个处理，常规种植区和土壤修复剂处理区(在常规处理的基础上，按照每亩施用2或4kg修复剂撒施或拌土，并保持土壤湿润，“低浓度”为土壤修复剂2kg/亩处理，“高浓度”为土壤修复剂4kg/亩处理)。种植作物为青菜，分别于2017年12月-2018年2、2018年12月-2019年2月和2019年12月-2020年2月连续3年种植。连续田试3年后对土壤各方面修复效果进行检测以及作物农艺性状指标进行调查，于收获期当天分别取样调查，调查采取3点取样，每点调查50株青菜。
结果表明，当土壤属于酸性重度盐渍土，施用本发明土壤修复剂(高浓度、低浓度)均能提高土壤pH以及土壤有机质含量、水解性氮、阳离子交换量均得到提高，土壤EC值降到适宜作物生长的范围内，且土壤中的速效磷、速效钾含盐量也得到显著提高，减轻了土壤的盐渍化，提高了作物对氮磷钾的利用率(表1所示)。
表1
检测项目 对照组 土壤修复剂(低浓度) 土壤修复剂(高浓度)
PH 5.88 6.07 6.31
有机质(g/Kg) 12.1 45.4 68.0
水解性氮(mg/kg) 146.67 160.45 177.32
速效磷(mg/kg) 261.4 388.8 426.8
速效钾(mg/kg) 579.6 648 742
阳离子交换量(cmol/kg(+)) 13.38 19.2 21.3
EC值(ms/cm) 1.43 0.71 0.52
另外，施用本发明土壤修复剂(高浓度、低浓度)能提高青菜的农艺性状和品质，且对青菜有增产的作用(如表2所示)。
表2
检测项目 对照组 土壤修复剂(低浓度) 土壤修复剂(高浓度)
高度(cm) 15.32 23.22 25.0
地上部分鲜重(g) 38.32 58.21 66.90
产量(公斤/亩) 1232 1402 1487
根肿病发病率(％) 21 3 3
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种矩孢木霉，其特征在于，所述矩孢木霉的拉丁学名为Trichodermaoblongisporum，菌株号TR1389A，保藏号为CGMCC No.21437。
2.一种矩孢木霉土壤修复菌剂，其特征在于，所述土壤修复菌剂含有所述矩孢木霉发酵制备的原粉，具体包括如下重量百分比的组分：
Figure FDA0002962560030000011
3.根据权利要求2所述的矩孢木霉土壤修复菌剂，其特征在于，所述土壤修复菌剂含有所述矩孢木霉发酵制备的原粉，具体包括如下重量百分比的组分：
Figure FDA0002962560030000012
4.根据权利要求2所述的矩孢木霉土壤修复菌剂，其特征在于，通过矩孢木霉发酵制备矩孢木霉原粉，包括如下步骤：将所述矩孢木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养；然后转移至培养液中进行摇瓶培养24-36h，得到一级种子液；然后向中级发酵罐中倒入所述一级种子液发酵6-8天，得到矩孢木霉发酵液；将所述矩孢木霉发酵液进行离心，获得木霉菌发酵浓缩液；将所述浓缩液通过喷雾干燥塔进行喷雾干燥获得矩孢木霉原粉。
5.根据权利要求2所述的矩孢木霉土壤修复菌剂，其特征在于，所述矩孢木霉土壤修复菌剂的有效菌含量≥2亿CFU/g。
6.根据权利要求2所述的矩孢木霉土壤修复菌剂，其特征在于，所述矩孢木霉土壤修复菌剂的有机质含量≥300g/kg。
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