CN112342144A - 一株百岁兰曲霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株百岁兰曲霉菌及其应用。本发明的百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX‑S3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020217；从杉木根际土壤筛选获得，具有高效的解磷能力；对5种难溶性磷酸盐磷酸钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)均具有较好的溶解能力；该菌制成的液体菌剂对杉木地径和苗高具有显著的促生长作用。因此，本发明为开发环境友好型杉木生物专用肥料提供了优良的菌株资源。

Description

一株百岁兰曲霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物和生物肥料领域，具体涉及一株百岁兰曲霉菌及其应用。
背景技术
杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国南方主要用材树种，具有种植面积广、蓄积量大和产量高等特点，在森林固碳、经济与生态建设方面发挥着重要作用。然而，近年来我国杉木人工林面临着生产力低下的现状，林地养分供应不足，土壤肥力衰退已严重影响了杉木人工林的资源培育，威胁到杉木人工林持续发展。
根际微生物是介导土壤生态功能、参与植物生长发育调控的关键因子，根际土壤微生物通过改变土壤养分的有效性以及与植物根系共生的方式直接或间接影响植物群落结构及生产力。在土壤微生物中存在着大量的解磷微生物，包括解磷真菌和解磷细菌。这类微生物能将土壤中难溶性的磷酸盐转化为可溶性磷供植物吸收利用，进而促进植物生长。应用解磷微生物制剂代替部分化学肥料能缓解化学肥料带来的土壤板结、水体污染等一系列问题。解磷微生物种类较多，主要包括解磷真菌、解磷细菌和解磷放线菌。虽然解磷真菌在数量和种类上少于解磷细菌，然而研究显示解磷真菌的解磷能力要远强于细菌，有时甚至是细菌的几十倍，且遗传性状更加稳定。解磷真菌作为土壤磷循环中一类重要的微生物，能够改善杉木人工林的磷素供应，促进杉木更好的生长。目前有关杉木根际高效解磷真菌的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株杉木根际高效解磷真菌百岁兰曲霉菌及其应用。
发明人从江西省吉安市泰和县石溪林场杉木人工林根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷真菌百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX-S3。
百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX-S3主要形态和生物学特征：在PDA培养基平板上菌落黑褐色；分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，分生孢子球形或近球形。百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX-S3的ITS片段序列如SEQ IDNO.1所示， BenA片段序列如SEQ ID NO.2所示，CaM片段序列如SEQ ID NO.3所示。将所测ITS、BenA 及CaM基因序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析，然后基于ITS、BenA和CaM 多基因联合使用贝叶斯方法构建系统发育树。结果显示，菌株JX-S3与百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)同源性很高，相似度达到95％。结合形态及ITS、BenA及CaM序列分析，鉴定JX-S3菌株为百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)。
本发明的百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX-S3对难溶性磷酸盐具有较好的溶解能力，可将土壤中难溶性磷转变为可溶性磷提高土壤有效磷含量，并具有解钾和产IAA能力，可显著促进杉木实生苗的生长发育。
因此，本发明的第一个目的是提供一株百岁兰曲霉菌JX-S3，其保藏编号为：CCTCCNO： M 2020217。
本发明的第二个目的是提供所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐中的应用。
优选，所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铁、磷酸氢钙、磷酸铝和/或植酸钙。
本发明还提供所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在解钾中的应用。
本发明还提供所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在产IAA中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在促进植物生长中的应用。
优选，所述的的植物为杉木。
本发明的第四个目的是提供一种菌剂，其含有所述的百岁兰曲霉菌JX-S3。
本发明的第五个目的是提供一种生物肥料，其含有所述的百岁兰曲霉菌JX-S3。
优选，所述的生物肥料的剂型为粉剂、悬浮剂或颗粒剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的杉木根际高效解磷真菌百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX-S3在液体摇培的条件下，对难溶性磷酸盐磷酸钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)具有较强的溶解效果，与对照(CK)相比，解磷能力差异极显著；本发明的百岁兰曲霉JX-S3还具较好的解钾和分泌植物生长素IAA能力；本发明的杉木根际高效解磷真菌JX-S3菌株制成液体菌剂接种杉木实生苗。结果表明，该菌剂能明显促进杉木的生长发育，因此，本发明为将来开发杉木专用微生物肥料提供了优良的菌株资源。
本发明的百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX-S3于2020年06月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，邮编：430072；保藏编号为：CCTCC NO：M 2020217。
附图说明
图1是菌株JX-S3在PDA培养基上的菌落形态。
图2是菌株JX-S3的分生孢子梗及分生孢子。
图3是菌株JX-S3在NBRIP培养基上产生的解磷圈。
图4是菌株JX-S3的系统发育树。
图5是菌株JX-S3对5种对难溶性磷酸盐磷酸钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)的溶解能力。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
从江西省吉安市泰和县石溪林场杉木人工林根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷真菌 JX-S3菌株。
JX-S3菌株主要形态和生物学特征：在PDA培养基平板上培养7天菌落黑褐色(图1)；分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，分生孢子球形或近球形(图2)。
图3是菌株JX-S3在NBRIP培养基上培养7天产生的解磷圈，说明JX-S3具有解磷能力，是一株解磷菌。
分子生物学鉴定：
提取JX-S3菌株的DNA，用相应的引物PCR扩增获得其ITS、BenA及CaM片段然后基因测序，测得ITS片段序列如SEQ ID NO.1所示，BenA片段序列如SEQ ID NO.2所示，CaM 片段序列如SEQ ID NO.3所示。将所测ITS、BenA及CaM基因序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析，然后基于ITS、BenA和CaM多基因联合使用贝叶斯方法构建系统发育树。结果显示，菌株JX-S3与百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)同源性很高，相似度达到95％(图4)。结合形态及ITS、BenA及CaM多基因序列联合鉴定分析，鉴定JX-S3菌株为百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)。
本发明的百岁兰曲霉菌(Aspergillus welwitschiae)JX-S3于2020年06月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072；保藏编号为：CCTCC NO：M 2020217。
实施例2：百岁兰曲霉菌JX-S3在不同初始pH下生物量的测定
将活化的JX-S3菌株接种在PDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)中，25℃，120r/min振荡培养5d作为种子液，将PDA液体培养基的pH设置为1.5、 2.5、3.5、4.5、5.5、6.5六个梯度，分装于250ml三角瓶中，装液量为100mL。随后，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到PDA液体培养基中，各处理3个重复，25℃，120r/min 振荡培养8d。菌丝过滤后在65℃下烘干48h，称重。结果见表1，JX-S3菌株在pH 1.5、2.5、 3.5、4.5、5.5及6.5的不同酸性条件下生长较好，菌丝生物量并无差异，以上表明，菌株JX-S3 能适应不同的酸性的环境，具备在不同酸性土壤环境中生长的能力。
表1不同pH对菌株JX-S3菌丝生物量发酵液pH的影响
Figure BDA0002706323140000041
实施例3：百岁兰曲霉菌JX-S3对不同磷源的溶解能力试验
解磷培养基A：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，MgCl2 5g，KCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，(NH4)2SO4 0.1g，蒸馏水1000mL，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基B：用磷酸铝(AlPO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基C：用磷酸铁(FePO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基D：用磷酸氢钙(CaHPO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基E：用植酸钙(C6H6Ca6O24P6)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
将活化的JX-S3菌株接种PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL)中，25℃，120r/min振荡培养5d作为种子液，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到装有50mL解磷培养基A、B、C、D或E的100mL三角瓶中，以接相同体积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理三个重复，25℃，121r/min培养8d后，发酵液4℃， 10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见图5。
由图5可知，在振荡培养8d后，菌株JX-S3对5种难溶性磷酸盐磷酸钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)的均具有较强的溶解能力，解磷能力分别为732.76mg/L、945.47mg/L、891.63mg/L、601.46mg/L、 673.53mg/L，此外，菌株JX-S3对5种磷源的解磷能力具有显著差异性，对磷酸铁和磷酸氢钙的溶解能力最高。以上结果表明，菌株JX-S3对五种难溶性磷源均具有较强的溶解能力，显示该菌株红壤、石灰岩等不同类型土壤中具有较强的解磷能力。
实施例4：百岁兰曲霉菌JX-S3的解钾和产IAA能力
将菌株JX-S3接入装有50mL解钾培养基(解钾培养基的配方是：钾长石粉0.1g，Na2HPO4 2.0g，FeCl3 0.005g，MgSO4·7H2O 0.5g，蔗糖5.0g，Ca2CO3 0.1g，琼脂18.0g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0)的100mL三角瓶中，28℃、180r/min条件下振荡培养7d得到发酵液，将发酵液先在500r/min，10min条件下除去发酵液中的不溶性物质，然后在10 000r/min，10min 条件下离心收集上清液，采用火焰分光光度计法测定上清液中有效钾的含量。结果如表2所示，菌株JX-S3解钾量为16.78mg/L，具有较好的解钾能力。
采用Salkowski比色法测定产IAA能力。取IAA标品，配置成0、0.5、2.5、5.0、7.5、10、12.5、15.0、17.5、25.0、50.0mg/L的浓度梯度，取2mL各浓度IAA加入等量的氯化铁比色液(PC比色液)，30℃中暗保温30min，波长530nm下利用分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线。将活化后的菌株JX-S3接种至King培养基(King培养基配方为：蛋白胨2g甘油1g、K2SO40.15g、MgSO4 4.7g、H2O 0.15g、琼脂1.5g、H2O 1000mL、pH 7.2)震荡培养15d，按标准曲线制作方法测定发酵液中IAA含量。试验结果如表2所示，菌株JX-S3具有较好的产IAA能力，其IAA分泌量为22.46mg/L。
表2菌株JX-S3的解钾和产IAA能力
Figure BDA0002706323140000051
注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。
实施例5：百岁兰曲霉菌JX-S3温室盆栽试验：
(1)杉木苗的培育
杉木种子以0.5％高锰酸钾溶液浸泡2h进行表面消毒，再用自来水冲洗1h后，播种于灭菌沙子中，置于25℃温室中培养，待其长到子叶期时进行芽苗截根移苗。
(2)盆栽基质
基质土壤采自江西农业大学校园后山，按照土壤：砂子：蛭石＝2：1：1的配比，在165℃条件下灭菌2h，冷却后备用。
(3)液体菌剂的制备
将保存的菌株JX-S3菌种接入PDA固体平板培养基中，于25℃培养6d，待菌丝长满平板，在无菌条件下，用打孔器(d＝7mm)在菌落边缘打成菌饼，再转接装有250mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中扩繁，每瓶挑取10粒菌饼。置于培养温度25℃和培养转速120r·min-1培养条件下培养至菌丝体旺盛期，用灭菌的匀浆机粉碎，制备成液体菌剂。(4)液体菌剂接种的盆栽试验
采用芽苗截根法移栽杉木苗，菌剂接种量为10ml/株。具体方法如下：取适量无菌的盆栽基质装入花盆中，将杉木苗轻轻地从育苗盆中取出，尽量不伤及根系，并用清水将幼苗根部的沙子冲洗干净，用解剖刀将芽苗截去少量主根后移栽至花盆中，将液体菌剂放入杉木根际周围，压实基质，再覆基质土浇水定根。以只接种液体培养基、不接种菌种的处理作为对照，每处理10个重复。置于25℃温室培养，适时浇水，统一管理。杉木根际基质接种后180d杉木生长情况见表3，可以看出，接种JX-S3能够显著促进杉木苗的生长。与对照相比，接种JX-S3 的处理在苗高和茎粗上的增长率分别达到了34.27％和40.43％，促生效果显著。
表3 JX-S3菌株对杉木实生苗生长的影响
Figure BDA0002706323140000061
注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一株百岁兰曲霉菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 百岁兰曲霉菌JX-S3(Aspergillus welwitschiae JX-S3)
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gaattctatc cccttcacat tttacctgta gcgctcgatc cgaccgcggg atttcgacag 240
catttcccag aatgatttgg atcataatac taatttaatc ggtgaatcag gccagatcac 300
caccaaggag ctcggcactg tgatgcgctc ccttggccag aacccctccg agtctgagct 360
tcaggacatg atcaacgagg ttgacgctga caacaacgga acgatcgact tccccggtat 420
gtgttagatt tacgcctgta aggcggaaat gcgggctgga ttgtgattga cttttgccgc 480
cagaattcct taccatgatg gctcgtaaga tgaaggacac cgactccgag gaggaaatcc 540
gcgaggcttt caaggtcttc gaccgcgaca acaatggttt tatctccgcc gcggagctgc 600
gccacgtcat gacctccatt ggcgagaagc tcaccgacga cgaagtcgat gagatgatcc 660
gtgaggcgga ccaggacggt gatggccgca tcgactgtat gtttaccatg cccgattata 720
ctcatatcat aacatactga ctctgctacc agacaacgag ttcgtccagt cccatgatgc 780

Claims (10)

1.一株百岁兰曲霉菌JX-S3，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2020217。
2.权利要求1所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铁、磷酸氢钙、磷酸铝和/或植酸钙。
4.权利要求1所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在解钾中的应用。
5.权利要求1所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在产IAA中的应用。
6.权利要求1所述的百岁兰曲霉菌JX-S3在促进植物生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的的植物为杉木。
8.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的百岁兰曲霉菌JX-S3。
9.一种生物肥料，其特征在于，含有权利要求1所述的百岁兰曲霉菌JX-S3。
10.根据权利要求9所述的生物肥料，其特征在于，所述的生物肥料的剂型为粉剂、悬浮剂或颗粒剂。
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