CN112831423B

CN112831423B - 褐紫曲霉菌株及其用途

Info

Publication number: CN112831423B
Application number: CN202110330080.7A
Authority: CN
Inventors: 李戌清; 严建立; 张敬泽; 李丁圯
Original assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Current assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN112831423A

Abstract

本发明公开了一种褐紫曲霉菌株及其应用。所述褐紫曲霉菌株，命名为褐紫曲霉菌(Aspergillus brunneoviolaceus)HZ23，保藏号为CCTCC M 2021173。所述褐紫曲霉菌株具有高效溶磷、产生铁载体和3‑吲哚乙酸(IAA)的能力，可用于新垦造耕地农业生产，改善土壤微生物种群结构，促进土壤熟化，从而促进作物的生长，提高作物生物量。

Description

褐紫曲霉菌株及其用途

技术领域

本发明涉及微生物制剂领域，特别涉及褐紫曲霉菌株及其用途。

背景技术

为了缓解现有耕地资源不断减少，耕地占用补平平衡难度日趋加大等问题，我国多地利用新垦造耕地填补占用耕地面积，以确保当地农耕地面总量相对稳定性。然而，新垦耕地不同于可耕地，通常为未成熟的土壤，在多数情况下，砾石含量高、呈酸性、缺乏营养，不适合作物生长。人们常利用畜禽粪便、生物固体、纸浆副产品、植物残体和作物残渣等用于土壤改良，以改变土壤理化性质和微生物群落结构。其中，土壤微生物对土壤生态系统的形成和演化发挥着重要作用，尤其细菌和真菌在促进植物利用土壤养分和促进土壤团聚体的形成中起着重要作用。

在农业土壤中，植物根可分泌一些代谢物，提供根围微生物生长、繁殖，而这些微生物群落的形成可通过多种机制来促进植物生长和减轻非生物胁迫。其中，一些植物促生真菌(PGPF)能溶解土壤中不溶的磷酸盐，固氮，或产生铁载体富集铁元素便于植物吸收；也可产生3-吲哚乙酸(IAA)促进植物生长，以及产生挥发性有机化合物、胞外酶等抑制植物生长的病原体和改善非生物胁迫。另外，这些真菌可通过改变土壤物理、化学性质而提高生物量，为植物生长提供多种益处。目前，已报道的植物促生真菌(PGPF)主要有曲霉菌、青霉菌以及木霉菌等，但多数作为生防肥料应用于农业耕作土壤。这些土壤通常营养丰富，pH适中，有利于植物生长，也适合根围真菌的生长。而相对未成熟土壤的逆境条件，由于营养贫乏和太低的pH，既不利于植物生长，也不利于土壤微生物的繁殖，迄今还没有在未成熟土壤条件下研究用植物促生真菌促进植物和土壤改良的相关报道。因此，在此极端条件下筛选植物促生真菌，研究它们对植物促生作用，获得高效的促生菌株。显然这些菌株可用于开发微生物菌肥或生物肥料，应用于土壤的修复、改良和促进土壤的成熟，因而具有潜在的应用价值。

发明内容

针对现有技术问题，本发明提供了一种高效溶磷、产铁载体和IAA的褐紫曲霉菌(Aspergillus brunneoviolaceus)，其能够改善新垦耕地的土壤成分，促进作物的生长。

本发明的褐紫曲霉菌株，命名为褐紫曲霉菌(Aspergillus brunneoviolaceus)HZ23，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2021173，保藏日期为2021年2月1日，保藏地址为中国武汉。

本发明还提供了包含所述褐紫曲霉菌株的微生物菌剂。

可选的，所述微生物菌剂为褐紫曲霉菌HZ23的分生孢子分散于水中制备得的悬浮液。

本发明还提供了所述微生物菌剂在促进作物生长中的应用。

可选的，所述应用包括：

在作物生长期间，对所述作物灌根褐紫曲霉菌HZ23的悬浮液。

作物生长主要涉及根、茎、叶等，可用根长、根数、株高、地下干重或鲜重、地上干重或鲜重等指标来衡量。

可选的，所述作物种植于新垦造耕地土壤中。

可选的，所述新垦造耕地土壤的pH为5～6。

可选的，所述作物为茄子。

可选的，所述悬浮液的浓度为10⁶～10⁷个分生孢子/mL。

可选的，灌根时间为作为作物生长到3～4片叶阶段。

本发明通过筛选获得的褐紫曲霉菌株兼具高效溶磷、产生铁载体和3-吲哚乙酸(IAA)的性能，可用于新垦造耕地农业生产，改善土壤微生物种群结构，尤其针对酸性土壤，能够促进种植作物的生长，提高作物生物量。

附图说明

图1为分离系HZ23在25℃或37℃下在不同培养基上培养7天的形态学观察图，其中A：25℃，CYA培养基；B：25℃，MEA培养基；C：25℃，CREA培养基；D：37℃，CYA培养基；E：分生孢子梗；F：分生孢子，比例尺为10μm。

图2为分离系HZ23在不同pH的PDA培养基上培养7天的产孢子量，其中纵坐标数值为×10⁷，不同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著。

图3为基于ITS、TUB、RPB2和CaM四个基因构建的包含52个曲霉属种分类单元的最大似然(ML)树示意图，以A.robstus NRRL6362T为树外群，具有最大ML支持率100％和贝叶斯后验概率(BPP)1.00的分支用粗黑线显示；ML-BS(左)>80％和BPP(右)为0.95以上分支上显示相应值，ML-BS低于80％和BPP低于0.95的分支用“-”表示，本研究分离株系的分类单元用粗体显示。

图4为4个株系在改良NBRI-MTSB培养基上的溶磷能力测定结果图，A：草酸青霉菌(P.oxalicum)HZ06，分离自临安于潜新垦造耕地土壤；B：褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ23；C：褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ10，分离自建德大洋新垦造耕地土壤；D：塔宾曲霉菌(A.tubingensis)HZ123，分离自临安于潜新垦造耕地土壤。

图5为4个株系在CAS培养基上的产铁载体能力测定结果图，A：草酸青霉菌(P.oxalicum)HZ06；B：褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ23；C：褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ10；D：塔宾曲霉菌(A.tubingensis)HZ123。

图6为不同浓度色氨酸和pH值对4个株系产IAA能力的影响结果图，A：塔宾曲霉菌(A.tubingensis)HZ123；B：草酸青霉菌(P.oxalicum)HZ06；C：褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ10；D：褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ23。

图7为4个株系悬浮液对种植于新垦造耕地茄子灌根30天的生长影响结果图，A：用草酸青霉菌(P.oxalicum)HZ06灌根；B：图A的根；C：用褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ23的悬浮液灌根；D：图C的根；E：用褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ10灌根；F：图E的根；G：用塔宾曲霉菌(A.tubingensis)HZ123灌根：H：图G的根；I：对照；各图中箭头指示根位置。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但本发明不仅限于此。

实施例1分离系的分离、纯化、筛选和鉴定

1.分离和纯化

以5点采样法采集浙江省台州市三门县林下荒芜土地土壤，于干净封口袋中，带回实验室。以土壤稀释法分离土壤微生物株系。即，称取2g土样于18mL双蒸水(ddH₂O)中，在180rpm摇床上震荡30min，制成10^-1土壤稀释液；取1mL该稀释液至含有9mL ddH₂O的离心管中，制成10^-2土壤稀释液；以此类推，获得10^-3、10^-4土壤稀释液。分别取100μL 10^-3和10^-4土壤稀释液，涂布在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，并置于25℃培养箱中培养3～4天，挑选生长速度快(菌落大)、菌落形态各异(比如，颜色、菌丝稀疏或致密、同心圆状辐射等形态)的真菌于新的PDA平板上纯化，纯化2～3次，得到162个分离系。

2.筛选

溶磷：分别用打孔器切取菌片(直径5mm)将162个分离系转接于NBRI-MTSB培养基平板上(葡萄糖10g、氯化镁5g、氯化钾0.2g、七水硫酸镁0.25g、硫酸铵0.1g、磷酸钙5g、琼脂15g、双蒸水1000mL，pH 7.0)，在25℃培养3天，观察溶磷情况。

产铁载体：分别用打孔器切取菌片(直径5mm)将162个分离系转接于CAS培养基平板上于25℃培养3天，观察培养基颜色变化，若由紫色转变为黄色，则表明该培养基上的分离系具有产铁载体能力。

其中，CAS培养基的组分及其制备方法如下：

溶液A：CAS 0.0605g、双蒸水50mL、1mM六水氯化铁(含10mM HCl)10mL；溶液B:HDTMA 0.0729g、双蒸水40mL；

溶液B:HDTMA 0.0729g、双蒸水40mL；

溶液C:双蒸水750mL、10x MM9(磷酸二氢钾0.3g、氯化钠05g、氯化铵1.0g、氢氧化钠6.0g、30.24PIPES、双蒸水1000mL，菌后再加入10％酪蛋白氨基酸30mL、葡萄糖2g、1M氯化镁1mL、100mM氯化钙1mL)100mL、琼脂15g、PIPES 30.24g，pH 6.8，

溶液A和B混匀灭菌，溶液C灭菌后冷却到50℃左右时加入上述已灭菌的A+B溶液、10％酪蛋白氨基酸30mL、葡萄糖2g、1M氯化镁1mL、100mM氯化钙1mL。

产IAA：分别用打孔器切取菌片(直径5mm)将162个分离系转接于含10mL马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基的试管中，于28℃150rpm摇床上培养7天，利用分光光度计检测是否产生IAA。

通过上述三个实验得到4株兼具溶磷、产铁载体和IAA的分离系，并进行编号，分别为HZ123、H06、HZ10、HZ23。

3.分离系HZ23的鉴定

3.1形态特征

将分离得到的分离系HZ23分别接种于四种培养基上，25℃或37℃下培养7天，观察生长菌落的直径大小，四种培养基及其组分如下：

CYA培养基：Czapek Concentrate 10mL、蔗糖30g、酵母提取物5g、磷酸氢二钾1g、五水硫酸铜0.005g、七水硫酸锌0.01g、琼脂20g、双蒸水1000mL、pH 6.2；其中，CzapekConcentrate配方如下：硝酸钠30g、氯化钾5g、七水硫酸镁5g、七水硫酸亚铁(绿矾)0.1g、七水硫酸锌0.1g、五水硫酸铜0.05g、双蒸水1000mL。

MEA培养基：麦芽提取物50g、五水硫酸铜0.005g、七水硫酸锌0.01g、双蒸水1000mL、pH 5.4。

CREA培养基：肌酸3g、蔗糖30g、氯化钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸亚铁(绿矾)0.5g、三水磷酸氢二钾1.3g、溴甲酚紫0.05g、琼脂15g、双蒸水1000mL。

结果参见图1，图1A为25℃下分离系HZ23在CYA培养基上培养7天后生长菌落的直径为60～62mm，图1D为37℃条件下在CYA培养基上培养7天后生长菌落的直径为22～29mm；图1A视野中，可见具有分生孢子头的分生孢子梗覆盖在菌落上，在CYA培养基上呈棕色到深棕色(近黑色)，短绒毛状到稍微絮状，菌丝体白色到浅黄色。图1B为25℃下分离系HZ23在MEA培养基上培养7天后生长菌落的直径为46～50mm，表明分离系HZ23的菌落呈棕色，菌丝体为白色；图1E为分生孢子梗的形态示意图，表明分离系HZ23分生孢子梗的菌柄为光滑状，透明或稍微着色，泡囊球状到椭圆形，直径32～51μm，分生孢子头单列，瓶状体7～9×3.5～4.5μm，覆盖整个泡囊。图1C为25℃下分离系HZ23在CREA培养基上产孢子和产酸结果示意图，表明分离系HZ23具有产孢子能力，且未接种前的CREA培养基呈紫色，接种后菌落生长区域呈黄色，表明分离系HZ23还具有产酸能力；图1F为分生孢子形态示意图，表明分离系HZ23的分生孢子为球状到亚球状，3.5～4.5(平均4.0)×3.1～4.0(平均3.6)μm，表面瘤状到刺状。

图2不同pH条件下分离系HZ23产孢子能力测试结果，表明pH 5～7条件下分离系HZ23产孢子能力好。

3.2分离系HZ23系统发育分析

提取分离系HZ23的基因组DNA，分别以引物对ITS5(5′-GGA AGT AAA AGT CGT AACAAG G-3′)(SEQ ID NO：1)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)(SEQ ID NO：2)、Bt2a(5′-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC -3′)(SEQ ID NO：3)和Bt2b(5′-ACC CTCAGT GTA GTG ACC CTT GGC-3′)(SEQ ID NO：4)、5F(5′-GAY GAY MGW GAT CAY TTY GG-3′)(SEQ ID NO：5)和7CR(5′-CCC ATR GCT TGY TTR CCC AT-3′)(SEQ ID NO：6)、CMD5(5′-CCGAGT ACA AGG ARG CCT TC-3′)(SEQ ID NO：7)和CMD6(5′-CCG ATR GAG GTC ATR ACG TGG-3′)(SEQ ID NO：8)扩增ITS、TUB、RPB2、CaM基因。其中，PCR扩增体系(50μL)为：32.5μLddH₂O、5μL 10x PCR buffer、4μL 2.5mM dNTP、2μL 10μM各引物、4μL DNA、0.5μL 5U/μLTaq DNA聚合酶(TaKaRa Bio Inc.,Japan)。ITS区扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min。TUB和CaM基因扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性60s、55℃退火60s、72℃延长90s，35个循环；72℃总延伸10min。RPB2基因扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、51℃退火30s、72℃延长1min，5个循环；94℃变性30s、49℃退火30s、72℃延长1min，5个循环；94℃变性30s、51℃退火30s、72℃延长1min，5个循环；94℃变性30s、47℃退火30s、72℃延长1min，30个循环；72℃总延伸10min。PCR扩增所得片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。所得片段序列如下：

ITS区序列：

TGGAAGTAAAAATCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCTGGGTCCTTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGCCCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA(SEQ ID NO：9)

TUB区序列：

TGGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTCTGGTATGTCTCTACTCGAGTGAATGGATAGATGACATGTTCTGTAGACTCTCACCCAGAGTCAAGAACATTACTGTCAAAGCTTCTCTGTGGTCAATTGAGCTAACAATCTTCCAGGCAGACCATCTCTGGTGAGCACGGCCTCGATGGCGCCGGTGTGTAAGTGCAGACTTCCCGGGCGGCAGGACCAGCGGGTCGCGGAAAATGGTGAAGGATATTAATGGAAAGGACAGTTACAATGGCTCCTCCGACCTCCAGCTGGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACGAGGTTCGTCTTCGAGTCCTCCCTCCGGCTTTCCCGCATCAGCTCCTGACTGCTTCACCAGGCTAGCGGCAACAAGTATGTTCCCCGTGCCGTCCTCGTCGACCTCGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCTTTCGGCCAGCTTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTTCGGTCAATCCGGTGCTGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACTACACTGAGGGTA(SEQ ID NO：10)

RPB2区序列：

AATTGTCCGGTCTCTTCTTGCGAACCTTTTCCGAGTCTTGTTCACCCGCGTCACCCGCGATCTACAGCGGTATGTTCAGCGGTGCGTGGAGACGAACAGAGAGATTTACCTGAACATTGGTATCAAGGCTAGCACCTTGACGGGAGGATTGAAGTATGCTCTTGCTACGGGTAACTGGGGCGAGCAGAAGAAGGCAGCTAGCTCCAAGGCCGGTGTGTCTCAAGTGCTCAGTCGTTACACTTACGCCTCCACCTTGTCCCATCTTCGCCGAACCAATACACCCATCGGGCGAGACGGAAAGATCGCCAAGCCTCGTCAGCTTCACAACACTCATTGGGGCCTGGTGTGTCCGGCTGAAACCCCTGAAGGTCAAGCTTGTGGTTTGGTCAAGAACTTGGCTCTCATGTGCTACATCACTGTCGGTACGCCCAGCGAGCCTATCATTGATTTCATGATTCAGCGTAATATGGAAGTCCTCGAGGAGTTCGAACCTCAAGTGACACCGAACGCTACCAAGGTTTTTGTCAACGGTGTCTGGGTTGGTATCCACAGAGACCCCGCTCACCTTGTCAACACGATGCTTTCCCTTCGTCGCCGCAACATGATTTCGCACGAGGTCAGTCTGATTCGAGACATTCGTGAGCGGGAGTTCAAGATTTTCACCGATGCTGGACGTGTCTGCCGACCGCTCTACGTCATTGACAATGACCCGAAGAGTGAAAACTGCGGCTCTCTGGTGCTCAACAAAGAACACATCCGCAAACTAGAACAAGATAAAGACTTGCCTCCAGACTTGGATCCAGAAGACCGCCGCGATCGTTACTTTGGTTGGGATGGCCTGGTGAAGTCTGGTGTAGTGGAGTACGTCGATGCTGAAGAAGAAGAGACCATCATGATTTCCATGACTCCGGAAGATCTCGAAATTTCCAAGCAACTCCAGGCTGGTTATGCTCTTCCGGATGAGGAACTACACGATCCGAACAAGCGTGTACGCCTCCATTCTGAGTCAAAGGCGCACACTTGGACTCACTGCGAGATCCATCCCAGTATGATCCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTCCCAGATCACAACCAGTCTCCCCG(SEQ ID NO：11)

CaM区序列：

TCCGAGTACAAGGAGGCCTTCTCCCTTTTTGTAAGCGACCCCGATGCTTTCTCGTCTGCTATAAAACAATGTTTACTGATTCGTTTCTCGTGATCCCTGATAGGACAAGGATGGCGATGGTTAGTGTAGTTCTTTACCCCTCAACGAAACCCGCCTGGCATCACCTGGCACTATAGCCACCATACCGCAAACGCCACAGAAACTATCAAGAATCGATCGCATTTCTGACAGAATCCATGCTACAGGACAAATTACCACCAAGGAGTTGGGTACCGTTATGCGCTCTCTCGGCCAGAACCCCTCCGAGTCTGAGCTCCAGGACATGATCAACGAGGTTGACGCTGACAACAACGGCACTATCGACTTTCCCGGTATGTGATGGCCATGCATCGAGCTCCGGACATAGTATTGACAGCTGCCCAGAATTCCTTACCATGATGGCCCGTAAGATGAAGGATACCGACTCTGAGGAGGAGATCCGTGAGGCCTTCAAGGTCTTCGATCGCGATAACAACGGCTTCATCTCTGCCGCGGAGCTGCGCCACGTCATGACCTCTATCGG(SEQ ID NO：12)

图3为构建的系统发育树，分别以TIM2+I+G或TIM2ef+I+G作为ITS最好的演化模型为最大似然(ML)或贝叶斯推断(BI)树的构建，相似地，分别以TIM3+I+G或TIM3+I+G为CMD基因，TrN+I+G或TrNef+I+G为RPB2基因，TIM1+G或TIM1+G为TUB基因。系统发育树由52个分类单元构成，其中A.robstus NRRL6362^T作为外群。4个位点的序列串联后，剔除模糊区序列共有2392个碱基，其中包含有信息的碱基有279个。构建的系统发育树结果表明分离系HZ23与褐紫曲霉菌分离系HZ10、PW4049、PW4122和NRRL4912作为一个分支聚在一起，具有ML-BS支持率为86％、贝叶斯后验概率BI-PP为1.00。系统发育分析结果一致于形态学鉴定结果，即分离系HZ23属于褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)，分类命名为褐紫曲霉菌HZ23，并将其保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2021173。

实施例2溶磷能力测定

将-70℃下保存的分离系HZ23、草酸青霉菌(P.oxalicum)HZ06、褐紫曲霉菌(A.brunneoviolaceus)HZ10、塔宾曲霉菌(A.tubingensis)HZ123分别在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上于25℃培养活化3天；

分别用打孔器切取菌片(直径5mm)转接于NBRI-MTSB培养基平板上，在25℃培养3天，并测量溶磷圈直径。

参见图4，实验结果表明分离系HZ23溶磷圈直径为3.88±0.25cm(图4B)，虽然大于褐紫曲霉菌HZ10(3.60±0.18cm)(图4C)和草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)HZ06(3.48±0.05cm)(图4A)，但显著小于塔宾曲霉菌(A.tubingensis)HZ123的溶磷圈直径(4.20±0.21cm)(图4D)。

实施例3产铁载体能力测定

将实施例2活化的四个株系分别用打孔器切取菌片(直径5mm)转接于CAS培养基平板上于25℃培养3天，测量橙黄色晕圈直径。

参见图5，分离系HZ23橙黄色晕圈直径为1.23±0.39cm(图5B)，大于褐紫曲霉菌HZ10(1.04±0.24cm)(图5C)，但显著小于塔宾曲霉菌HZ123(2.78±0.71cm)(图5D)和草酸青霉菌HZ06(2.05±0.56cm)(图5A)。

实施例4产IAA能力测定

将实施例2活化的四个株系分别用打孔器切取菌片(直径5mm)转接于含10mL PDB培养基的试管中，于28℃150rpm摇床上培养7天，利用分光光度计测定OD₅₃₀值。以不同PDB培养基pH(pH 5.0、6.0、7.0)和PDB中色氨酸含量(0.1％、0.5％、1.0％、1.5％)为不同处理。结果如表1、图6所示，分离系HZ23在PDB培养基pH 5.0、色氨酸含量1.5％时产IAA能力最大，为71.50±2.22μg/mL，草酸青霉菌HZ06和褐紫曲霉菌HZ10在pH 9.0、色氨酸含量1.5％时最大，分别为73.92±4.82μg/mL和85.33±5.92μg/mL，而塔宾曲霉菌HZ123在pH 7.0、色氨酸含量1.5％时最大，为267.38±2.38μg/mL。

表1 4个株系产IAA能力测定.

注:不同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著。

实施例5分离系HZ23在新垦造耕地土壤中对茄子苗的促生作用

将实施例2活化的四个株系分别用打孔器切取菌片(直径5mm)转接于新的PDA培养基平板上，于25℃培养7～10天，用无菌水收集孢子，以获得10⁶个/mL的孢子悬浮液。

杭茄2010种子先用2％次氯酸钠溶液消毒2min，再用无菌水冲洗3次，并在无菌水中浸泡5h，风干。将上述种子置于湿润的无菌滤纸上，于25℃预培养3天。将发芽的种子播种至装满耶糠的32孔穴盘中，置于25℃、相对湿度70～80％的温室中培养。选择长势基本一致的3～4叶期茄子幼苗，定植于装有未灭菌新垦造耕地土壤的花盆中(pH5.2)，每盆1株，每处理30株，三次重复。于定植当天，在茄子植株根部灌上述孢子悬浮液10mL，以灌无菌水为对照。在25℃、相对湿度70～80％的温室内生长30天后，测定茄子植株株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重。其中，促生作用(GPF％)＝(处理-对照)/对照×100％。

结果如图7所示，与对照相比，4个株系(除HZ123外)均可不同程度的促进茄子植株的生长，其中，褐紫曲霉菌HZ23和HZ10、草酸青霉菌HZ06对茄子叶片大小和根长有明显的促生作用。4个株系对茄子植株生长和生物量积累的作用均显著优于对照，其中，褐紫曲霉菌HZ23灌根，茎长、地上干重(或鲜重)分别比对照增加12.61％、28.15％(或33.55％)，根长、地下干重(或鲜重)分别比对照增加1.99％、28.26％(或27.70％)；褐紫曲霉菌HZ10灌根，茎长、地上干重(或鲜重)分别比对照增加6.61％、23.70％(或20.51％)，根长、地下干重(或鲜重)分别比对照增加8.12％、43.48％(或35.81％)；草酸青霉菌HZ06灌根，茎长、地上干重(或鲜重)分别比对照增加22.35％、39.26％(或47.69％)，根长、地下干重(或鲜重)分别比对照增加0.83％、41.30％(或28.72％)；而塔宾曲霉菌HZ123灌根，地上干重(或鲜重)比对照减少-0.79％(或-2.22％)。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州市农业科学研究院

<120> 褐紫曲霉菌株及其用途

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

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tcctccgctt attgatatgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24

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<211> 24

<212> DNA

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accctcagtg tagtgaccct tggc 24

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<212> DNA

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<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgagtacaa ggargccttc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgatrgagg tcatracgtg g 21

<210> 9

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggaagtaaa aatcgtaaca aggtttccgt aggtgaacct gcggaaggat cattaccgag 60

tgctgggtcc ttcggggccc aacctcccac ccgtgcttac cgtaccctgt tgcttcggcg 120

ggcccgcctt cgggcggccc ggggcctgcc cccgggaccg cgcccgccgg agaccccaat 180

ggaacactgt ctgaaagcgt gcagtctgag tcgattgata ccaatcagtc aaaactttca 240

acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taactaatgt 300

gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc 360

cggggggcat gcctgtccga gcgtcatttc tcccctccag ccccgctggt tgttgggccg 420

cgcccccccg ggggcgggcc tcgagagaaa cggcggcacc gtccggtcct cgagcgtatg 480

gggctctgtc acccgctcta tgggcccggc cggggcttgc ctcgaccccc aatcttctca 540

gattgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga 600

<210> 10

<211> 538

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggtaaccaa atcggtgctg ctttctggta tgtctctact cgagtgaatg gatagatgac 60

atgttctgta gactctcacc cagagtcaag aacattactg tcaaagcttc tctgtggtca 120

attgagctaa caatcttcca ggcagaccat ctctggtgag cacggcctcg atggcgccgg 180

tgtgtaagtg cagacttccc gggcggcagg accagcgggt cgcggaaaat ggtgaaggat 240

attaatggaa aggacagtta caatggctcc tccgacctcc agctggagcg catgaacgtc 300

tacttcaacg aggttcgtct tcgagtcctc cctccggctt tcccgcatca gctcctgact 360

gcttcaccag gctagcggca acaagtatgt tccccgtgcc gtcctcgtcg acctcgagcc 420

cggtaccatg gacgccgtcc gtgccggtcc tttcggccag ctttccgccc cgacaacttc 480

gtcttcggtc aatccggtgc tggtaacaac tgggccaagg gtcactacac tgagggta 538

<210> 11

<211> 1106

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aattgtccgg tctcttcttg cgaacctttt ccgagtcttg ttcacccgcg tcacccgcga 60

tctacagcgg tatgttcagc ggtgcgtgga gacgaacaga gagatttacc tgaacattgg 120

tatcaaggct agcaccttga cgggaggatt gaagtatgct cttgctacgg gtaactgggg 180

cgagcagaag aaggcagcta gctccaaggc cggtgtgtct caagtgctca gtcgttacac 240

ttacgcctcc accttgtccc atcttcgccg aaccaataca cccatcgggc gagacggaaa 300

gatcgccaag cctcgtcagc ttcacaacac tcattggggc ctggtgtgtc cggctgaaac 360

ccctgaaggt caagcttgtg gtttggtcaa gaacttggct ctcatgtgct acatcactgt 420

cggtacgccc agcgagccta tcattgattt catgattcag cgtaatatgg aagtcctcga 480

ggagttcgaa cctcaagtga caccgaacgc taccaaggtt tttgtcaacg gtgtctgggt 540

tggtatccac agagaccccg ctcaccttgt caacacgatg ctttcccttc gtcgccgcaa 600

catgatttcg cacgaggtca gtctgattcg agacattcgt gagcgggagt tcaagatttt 660

caccgatgct ggacgtgtct gccgaccgct ctacgtcatt gacaatgacc cgaagagtga 720

aaactgcggc tctctggtgc tcaacaaaga acacatccgc aaactagaac aagataaaga 780

cttgcctcca gacttggatc cagaagaccg ccgcgatcgt tactttggtt gggatggcct 840

ggtgaagtct ggtgtagtgg agtacgtcga tgctgaagaa gaagagacca tcatgatttc 900

catgactccg gaagatctcg aaatttccaa gcaactccag gctggttatg ctcttccgga 960

tgaggaacta cacgatccga acaagcgtgt acgcctccat tctgagtcaa aggcgcacac 1020

ttggactcac tgcgagatcc atcccagtat gatccttggt gtttgtgcca gtatcattcc 1080

ctcccagatc acaaccagtc tccccg 1106

<210> 12

<211> 562

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tccgagtaca aggaggcctt ctcccttttt gtaagcgacc ccgatgcttt ctcgtctgct 60

ataaaacaat gtttactgat tcgtttctcg tgatccctga taggacaagg atggcgatgg 120

ttagtgtagt tctttacccc tcaacgaaac ccgcctggca tcacctggca ctatagccac 180

cataccgcaa acgccacaga aactatcaag aatcgatcgc atttctgaca gaatccatgc 240

tacaggacaa attaccacca aggagttggg taccgttatg cgctctctcg gccagaaccc 300

ctccgagtct gagctccagg acatgatcaa cgaggttgac gctgacaaca acggcactat 360

cgactttccc ggtatgtgat ggccatgcat cgagctccgg acatagtatt gacagctgcc 420

cagaattcct taccatgatg gcccgtaaga tgaaggatac cgactctgag gaggagatcc 480

gtgaggcctt caaggtcttc gatcgcgata acaacggctt catctctgcc gcggagctgc 540

gccacgtcat gacctctatc gg 562

Claims

1.褐紫曲霉菌株，其特征在于，命名为褐紫曲霉菌(Aspergillus brunneoviolaceus)HZ23，保藏号为CCTCC M 2021173。

2.包含权利要求1所述的褐紫曲霉菌株的微生物菌剂。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为褐紫曲霉菌HZ23的分生孢子分散于水中制备得的悬浮液。

4.权利要求2～3任一所述的微生物菌剂在促进作物生长中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：

在作物生长期间，对所述作物灌根褐紫曲霉菌HZ23的悬浮液。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述作物种植于新垦造耕地土壤中。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述新垦造耕地土壤的pH为5～6。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述作物为茄子。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述悬浮液的浓度为10⁶～10⁷个分生孢子/mL。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，灌根时间为作物生长到3～4片叶阶段。