CN115287195B - 一种利用内生真菌p-b313提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用内生真菌P‑B313提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，属于微生物应用技术领域。所述方法包括将保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌Pseudophialophora sp.P‑B313与水稻种子共培养，使其定殖于水稻根部组织中。本发明提供了内生真菌P‑B313在促进水稻生长，增加谷粒产量方面的新用途，通过将内生真菌P‑B313定殖于水稻根部组织，可以显著提升水稻种苗素质、增加水稻产量。内生真菌P‑B313对水稻显著的共生互作效果使其在农业领域内的推广应用具有巨大价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及内生真菌P-B313在提高水稻种苗素质和(或)谷粒产量中的应用。
背景技术
植物内生真菌是指至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌，普遍存在于生态系统中，且与宿主植物进行着非常稳定的长期互作关系。近年来随着人们对植物微生态系统的深入认识，发现植物的表型除了受自身遗传特性的影响外，还受周围有益微生物的积极调控。植物与内生真菌的共生互作就是其中典型的例子。
在植物内生真菌与寄主形成互惠共生关系的过程中，一方面植物内生真菌从寄主中获取水分、矿物营养等生长所需的养分，另一方面植物内生真菌赋予植物丰富多样的生物学功能，例如促进植物生长，提高植物生物量，增强寄主植物的抗生物和非生物胁迫的能力。
水稻作为我国最重要的粮食作物，实现水稻的稳定高产是我国可持续发展的基础。利用野生稻内生真菌重建有益的水稻-内生真菌共生体系是促进水稻生长、提高产量与抗逆性的有效途径之一。因此建立野生稻内生真菌与水稻的互惠共生体，对于提高水稻产量以及对于农业的可持续发展具有重要的意义。
目前，我国水稻机械化插秧迅速推广普及，对于秧苗素质要求亦越发严格。因此，培育出既适合机械插秧作业，又满足高产农艺要求的健壮秧苗成了最大的技术障碍。“秧好一半谷”，提高秧苗素质，健苗壮秧是促进水稻高产的重要技术措施。专利文献CN101486970 A公开从野生稻(Oryza granulata)中分离到一株瓶霉属内生真菌R5-6-1，该菌株接种水稻后，表现出水稻长势旺，苗壮，根系颜色呈褐色，水稻干重显著增加，表明该菌株能促进水稻生长和增加生物量。
水稻作为粮食作物，其可食用部分为种子。前期研究表明，通过重建水稻-内生真菌共生体系以促进水稻植株生长，并不能必然提高水稻产量。因此，挖掘更多野生稻内生真菌资源，利用与水稻共生互作增加水稻产量是本领域技术人员需要解决的技术问题。
申请号为202110529926.X的中国发明专利公开了一株假瓶霉属内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313，该内生真菌定殖于水稻根部组织后，增强了水稻苗期对苗叶瘟的抗病性。目前尚无报道指出该属内生真菌菌株在提高水稻苗素质、增加水稻产量方面的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够促进水稻生长，增加谷粒产量的野生稻内生真菌，利用其与水稻的共生互作实现水稻的稳定高产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌Pseudophialophorasp.P-B313在提高水稻种苗素质中的应用。
本发明研究发现，将Pseudophialophora sp.P-B313定殖于水稻幼苗根部组织中，可以显著提高水稻秧苗素质，表现为秧苗生长健壮，种苗叶绿色含量、地上部高度、地上部鲜重等方面显著提高，且无明显病虫害发生。
所述应用包括：内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313与水稻种子共培养，使内生真菌定殖于水稻幼苗根部组织中。
进一步的，所述应用包括：将内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313制备成固体菌肥，再混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中，育苗培养获得水稻种苗。
本发明研究表明，内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313定殖于水稻植株根部，促进水稻根系对营养元素的吸收，增加营养元素在组织中的含量。
进一步的，所述营养元素包括氮元素和钾元素。
本发明还提供了保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌Pseudophialophorasp.P-B313在提高水稻谷粒产量中的应用。
本发明研究发现，内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313定殖于水稻根部组织后，对水稻具有增产效果，实际增产达到5.27％。
所述应用包括：内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313与水稻种子共培养，使内生真菌定殖于水稻根部组织中。
进一步的，所述应用包括：将内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313制备成固体菌肥，再混合到育苗基质中，水稻种子萌发后播种于育苗基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获。
本发明还提供了一种提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，包括以下步骤：
(1)将保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313接种至液体发酵培养基中，培养获得发酵液，再将发酵液接种于无菌大麦粒上，黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得P-B313固体菌肥；
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾；
(2)将P-B313固体菌肥混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中，育苗培养获得水稻秧苗；
(3)移栽水稻秧苗至大田，培育至收获。
进一步的，步骤(1)中，液体发酵之前，先将内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。
进一步的，液体发酵的条件为25℃，转速150rpm，培养7天。
进一步的，发酵液与无菌大麦粒按照100mL：500g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒。
进一步的，步骤(2)中，制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。
进一步的，将水稻种子用25％氰烯菌酯3000倍液浸泡2天进行种子消毒，随后放于30℃黑暗恒温箱中催芽1-2天。
本发明具备的有益效果：
本发明提供了假瓶霉内生真菌P-B313在促进水稻生长，增加谷粒产量方面的新用途，通过将内生真菌P-B313定殖于水稻根部组织，可以显著提升水稻种苗素质、增加水稻产量。内生真菌P-B313对水稻显著的共生互作效果使其在农业领域内的推广应用具有巨大价值。
附图说明
图1为实施例1中内生真菌P-B313固体菌肥对水稻苗影响的照片，A图为接种和未接种P-B313固体菌肥的盆栽水稻苗照片；B图为接种和未接种P-B313固体菌肥的盆栽水稻苗细节照片。
图2为实施例1中内生真菌P-B313固体菌肥对水稻苗素质的影响，其中A为叶绿素含量，B为地上部高度，C为根长，D为地上部鲜重，E为根鲜重，F为植株干重。显著性采用t-test，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图3为实施例2中P-B313固体菌肥对水稻谷粒的影响。
图4为实施例3中P-B313固体菌肥对水稻营养元素吸收的影响，其中A图为地上部营养元素含量，B图为根部营养元素含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
内生真菌P-B313由浙江省农业科学院林福呈教授实验室馈赠，该菌已保藏于中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2021504，分类命名为假瓶霉(Pseudophialophora sp.)，参见申请号为202110529926.X的中国发明专利。
实施例1 P-B313对水稻秧苗素质的影响
1、P-B313菌株培养与发酵
供试植物：水稻Oryza sativa L.，杂交品种，CO39。
将P-B313菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行培养，25℃，黑暗培养7d。用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，将菌饼(5个)接种至含有500mL液体发酵培养基的三角瓶中，置于摇床中(25℃，转速150)培养7d。然后将液体发酵液接种于装有无菌麦粒培养瓶中(500g麦粒/瓶，100mL发酵液：500g麦粒)，25℃黑暗培养箱中培养10-15d，待菌丝生长布满麦粒，备用。
PDA培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯(200g/L)，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。
液体发酵培养基：豆饼粉0.4％，玉米粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，按比例配制，加水至250ml；120℃湿热灭菌15min。
2、P-B313固体菌肥的盆栽应用
水稻种子表面消毒：将水稻种子去壳，经75％酒精浸泡5min，随后用1％的NaClO表面消毒8-10min，经无菌水多次清洗后均匀平铺在吸水纸上，保湿，30℃恒温催芽48小时。
48小时后，将生长相对一致的萌发种苗移入营养钵(口径10cm)，同时接入P-B313固体菌肥，10g/盆，30株苗/盆。25℃培养(16h光照/8h黑暗)，对照组为无菌麦粒。设5个重复，每个重复3盆。
3、水稻秧苗素质测定
待水稻苗在育苗盘中生长25天后，测定秧苗素质。如图1、图2所示，内生真菌固体菌肥处理的水稻苗生长健壮，长势平衡，无明显病虫害发生。
实施例2 P-B313固体菌肥的基质育秧及对水稻产量的影响
供试植物：水稻Oryza sativa L.，甬优1450。
1、P-B313固体菌肥的基质育秧
将发酵好的固体菌肥与常规育苗基质混合后，平铺于育苗盘中，每育苗盘含有10g固体菌肥。将水稻种子用25％氰烯菌酯3000倍液浸泡2天进行种子消毒，随后放于30℃黑暗恒温箱中催芽1-2天。待种子露白，将其均匀播种于育苗盘中，放入秧田育苗培养，正常浇水管理。
2、水稻秧苗移栽
待秧苗在育苗盘中生长23-25天后，将秧苗拔出，移栽至大田。移栽时，每丛3株苗，每丛株距10-15cm，行距30cm。正常水肥管理，整个生育期内不施用任何杀菌剂，培育至收获。
3、稻谷测产
内生真菌菌肥育秧示范田位于浙江省桐庐县莲花村，总面积203亩，以常规营养土育秧机插为对照。播种期5月22日，机插期6月17日，成熟日期10月15日。水稻成熟时，发现内生真菌育秧机插连作单季稻生长健壮，长势平衡，青杆黄熟，无明显病虫害发生，穗长增加，谷粒饱满(图3)。
理论测产：经过内生真菌固体菌肥育秧的水稻平均理论亩产为628.27kg/亩，未使用内生真菌菌肥的对照组平均理论亩产为592.06kg/亩，理论增产6.12％(表1)。
表1内生真菌P-B313固体菌肥对水稻的理论增产表
实际测产：内生真菌固体菌肥育秧和对照各取1块田，面积分别为1.5766亩1.4565亩。经全田机械收割、实测含水量，稻谷称重，按照1.0％扣除杂质，按籼粳杂交稻含水率13.5％的标准折算，内生真菌固体菌肥育秧机插实收稻谷675.7公斤/亩，对照为640.1公斤/亩，实际增产5.27％。
百亩方测产：按农业农村部水稻产量测产验收办法，对内生真菌基质育秧机插连作晚稻百亩方进行测产，换算公式：湿谷重*(100-杂质)％*(100-水分)/(100-13.5)，结果如表2，经算术平均，示范方平均亩产683.20公斤/亩。
表2内生真菌P-B313固体菌肥百亩示范方测产结果
实施例3 P-B313固体菌肥对营养元素的影响
1、营养元素含量测定
分别采集水稻地上部组织和根部，置于烘箱内(80℃)，干燥至恒重，粉碎、研磨成干粉。称取0.5g干粉样品置于消解罐中，加入酸组合(5mL浓硝酸，1mL过氧化氢)，摇匀后静置1min，后进行消解。消化结束后，在电炉上加热赶酸，冷却后用2％的硝酸定容至200mL。最后用全谱型等离子体原子发射光谱仪ICP-OES(IRIS Intrepid II XSP,Thermo,USA)进行Fe、K、Mg、P元素测定。N含量的测定采用凯氏定氮法。
通过对水稻植株地上部和根部营养元素含量分析，结果发现：接种P-B313固体菌肥后，水稻植株地上部组织中N和K元素含量显著增加，相较于对照组分别增加15.28％和3.88％(图4A)。P、Fe和Mg等元素含量没显著变化。同样地，处理组根系中N、P和Mg等元素含量也显著提高，分别提高12.35％、3.29％和0.36％(图4B)。因此，P-B313菌株的根部定殖能够有效促进水稻根系对N和K营养元素的吸收，增加营养元素在组织中的含量。
2、P-B313对水稻营养吸收相关基因表达的影响
待水稻生长至三叶一心期(21d)时，采集新鲜水稻叶片，利用TRIzol(Invitrogen)提取叶片总RNA，随后用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect RealTime，TaKaRa)试剂盒进行反转录。
对调控N、P、K、Mg和Fe等营养元素吸收的关键基因进行定量分析。
Real-time PCR检测参照荧光定量试剂盒Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)使用说明(TaKaRa)，Real-time PCR扩增引物序列见表3。
反应体系25μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μL、引物(10μmol/L)各0.5μL、模板cDNA(稀释5倍)1μL、dd H2O补足到25μL。
反应条件:95℃5min，40个循环(95℃10s、60℃15s)，设置溶解曲线。通过2–ΔΔCt的方法计算基因表达的相对表达量。
对调控N、P、K、Mg和Fe等营养元素吸收的关键基因进行表达量分析。结果发现，P-B313菌株的根部定殖引起硝酸盐转运蛋白OsPTR9和钾转运蛋白OsHAK16基因显著上调表达，分别是对照组的7.28和2.57倍(表4)；然而，NH4+转运蛋白OsAMT3；2基因显著下调0.22倍，磷转运蛋白OsPT4基因显著下调表达0.68倍，镁转运蛋白OsMRS2-8显著下调表达0.43倍，铁吸收的转录因子OsIRO2下调表达0.40倍，铁载体转运蛋白OsYSL15显著上调表达0.27倍(表4)。由此可见，稻假瓶霉P-B313侵染定殖在水稻根系后，能够诱导N和K元素吸收相关的基因显著上调表达，从而促进营养元素吸收。
表3引物序列
| Primer name | Primer sequences(5’-3’) |
| OsActin-F | GAGTATGATGAGTCGGGTCCAG |
| OsActin-R | ACACCAACAATCCCAAACAGAG |
| OsPTR9-F | TCTCGGGCGTACAGGTTT |
| OsPTR9-R | GGAGGTCGGATGGACTTATT |
| OsAMT3；2-F | TGTACTTCCAGTGCGTGTTC |
| OsAMT3；2-R | ACGGTGTAGGAGAAGGTGAG |
| OsMRS2-8-F | GGCAAAGTTCAAAAGGTCAGG |
| OsMRS2-8-R | TCTCCGTTAGGTGCAATGC |
| OsPT4-F | CTAGTGTACCAAACAAAATTACA |
| OsPT4-R | TGGCATTTATAATATCAACAGTAAC |
| OsHAK16-F | TGTGCTAAACCCTTCAGTCTC |
| OsHAK16-R | CAATCTTGTCAGTGCCAAACC |
| OsIRO2-F | GGCATGGCTCCCATCGT |
| OsIRO2-R | AACAAGCTGACCTGAACCATGA |
| OsYSL15-F | CAATGTGCCAGGGAGCTATAA |
| OsYSL15-R | TACGACCAAAGCCTTTCTTAGG |
表4水稻营养元素吸收相关基因表达
| Gene Name | Description | TIGR | Fold change |
| OsPTR9 | 硝酸盐转运蛋白 | Os06g0706400 | 7.28±0.84** |
| OsAMT3；2 | NH4+转运蛋白 | Os03g0838400 | 0.22±0.06** |
| OsMRS2-8 | 镁转运蛋白 | Os04g0430900 | 0.43±0.05** |
| OsPT4 | 磷转运蛋白 | Os04g0186400 | 0.68±0.02** |
| OsHAK16 | 钾转运蛋白 | Os03g0575200 | 2.57±0.80* |
| OsIRO2 | 铁吸收的转录因子2 | Os01g0952800 | 0.40±0.18** |
| OsYSL15 | 铁载体转运蛋白 | Os02g0650300 | 0.27±0.16** |
注:Independent-Samples T-Test，*和**分别表示P<0.05and P<0.01。
以上实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江中医药大学
<120> 一种利用内生真菌P-B313提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtatgatg agtcgggtcc ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaccaacaa tcccaaacag ag 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctcgggcgt acaggttt 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaggtcgga tggacttatt 20
<210> 5
<211> 20
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<400> 9
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tggcatttat aatatcaaca gtaac 25
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<212> DNA
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<400> 16
tacgaccaaa gcctttctta gg 22
Claims (6)
1.保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313在提高水稻种苗素质中的应用，其特征在于，所述应用包括：内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313与水稻种子共培养，使其定殖于水稻幼苗根部组织中，促进水稻根系对营养元素的吸收，增加营养元素在组织中的含量，所述营养元素为氮元素和钾元素。
2.保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313在提高水稻谷粒产量中的应用，其特征在于，所述应用包括：内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313与水稻种子共培养，使其定殖于水稻根部组织中。
3.一种提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌Pseudophialophorasp.P-B313接种至液体发酵培养基中，培养获得发酵液，再将发酵液接种于无菌大麦粒上，黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得P-B313固体菌肥；
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾；
(2)将P-B313固体菌肥混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中，育苗培养获得水稻秧苗；
(3)移栽水稻秧苗至大田，培育至收获。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，液体发酵之前，先将内生真菌Pseudophialophora sp.P-B313菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵液与无菌大麦粒按照100mL：500g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。
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