CN114931079A

CN114931079A - 内生真菌p-b313在提高石斛耐低磷胁迫中的应用

Info

Publication number: CN114931079A
Application number: CN202210469830.3A
Authority: CN
Inventors: 王舒扬; 林洁; 梁世伟; 林福呈; 苏珍珠; 李琳
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2042-04-28
Also published as: CN114931079B

Abstract

本发明公开了内生真菌P‑B313在提高石斛耐低磷胁迫中的应用，属于植物病害防治技术领域。所述内生真菌P‑B313保藏号为CCTCC NO:M2021504，分类命名为假瓶霉(Pseudophialophora sp.)。本发明提供了内生真菌P‑B313应用于石斛以提高石斛耐低磷胁迫性能的新用途。将内生真菌P‑B313菌株与石斛共培养，使其定殖于石斛苗根部，增强石斛苗对低磷胁迫的抗性，提高石斛对缺素环境的适应性，促进石斛生长并提升其品质。内生真菌P‑B313菌株对石斛显著的共生互作效果使其在农业领域内的推广应用具有巨大价值。

Description

内生真菌P-B313在提高石斛耐低磷胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术领域，具体涉及一株假瓶霉内生真菌菌株P-B313在促进石斛耐低磷胁迫方面的应用。

背景技术

铁皮石斛(拉丁学名：Dendrobium officinaleKimura et Migo)属兰科石斛属草本植物，因表皮呈铁绿色而得名，享有“救命仙草”之美誉，是一种药食两用中药材，其功能性成分主要包括多糖类、黄酮类及酚酸类等，具有增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长、降低血糖和抗衰老等药理活性。野生石斛对自然生长环境要求极为苛刻，加上自身繁殖能力低下以及过度采摘，野生资源基本枯竭。近几十年通过现代生物工程技术，实现了对石斛的保种及合理开发利用。

目前，石斛多为人工栽培。铁皮石斛种植方式主要为大棚种植、树上仿原生态种植。专利文献CN 103918552 A公开了一种快速组织培养石斛种苗的方法，包括：首先从野生石斛的生活根中分离出共生真菌，再将组培苗与共生菌共同培养，然后菌根化组培苗的炼苗培养。

天然真菌在石斛共生萌发以及生长发育过程中都起到重要的促进生长作用。野生铁皮石斛在自然条件下生长，根上共生着根菌，也称根际微生物，属真菌类，根菌是石斛的种植条件不可缺的因素之一，类似豆科作物的根瘤菌，石斛和根菌有着共生关系。根菌为了自身的生长繁殖需要，必须从空气中获得氮肥(固定空气中的氮气)，分解培养基质上的动植物残体获得矿物营养，又需从铁皮石斛根系中吸收养分(如胺基酸、糖类等碳水化合物)，从而需要不断壮大根菌群体，而石斛根系通过分解根菌残体，间接获取生长发育所必须的各类营养物质，因此没有根菌间接输送养分，石斛就很难生存，没有石斛为根菌提供寄住条件，根菌也很难生长繁殖，这就是石斛与根菌的“共生性”。因此，在人工栽培石斛时需要与共生菌共培养。

虽然石斛大棚种植技术比较成熟，但是在种植过程中，肥料、植物激素的应用导致其生长环境中营养成分过剩，栽培密度高导致其病害严重、品质不佳。因此，模拟石斛天然生产环境进行栽培以提高石斛品质，但是天然生产环境营养贫瘠尤其是磷元素的匮乏导致石斛组培苗生长受阻。共生真菌可以为石斛生长提供养分，因此开发优质的共生真菌有望解决该问题。目前人工栽培采用的共生真菌多采集于石斛根部及培养基质中的原始菌群。与异源物种内生真菌建立共生体系的技术鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够促进石斛适应低磷胁迫环境的共生真菌，利用其与石斛的共生互作实现石斛在模拟天然生产环境(缺素环境)下的正常生长，并提高其品质。

为实现上述目的，本申请采用如下技术方案：

本发明提供了内生真菌P-B313在提高石斛耐低磷胁迫中的应用，所述内生真菌P-B313保藏号为CCTCC NO:M 2021504，分类命名为假瓶霉(Pseudophialophora sp.)。

本发明研究发现，将Pseudophialophora sp.P-B313定殖于石斛根部组织中，可以显著提高石斛耐低磷(生长环境中磷含量低于生长所需或无磷环境)能力，其长势和品质显著优于对照组，表现为：在缺磷条件下，P-B313菌株处理组石斛苗的生长健壮、植株高、茎秆粗、叶片绿，根系发达；石斛内的多糖、总黄酮、总多酚等活性物质含量显著高于对照组。

所述应用包括：将内生真菌P-B313定殖于石斛根部组织，以提高石斛对低磷胁迫的抗性。

本发明研究表明，内生真菌P-B313定殖于石斛根部组织后，促进石斛根系对营养元素的吸收，增加组织中营养元素的含量。

进一步的，所述营养元素包括氮、钾、铁、镁。

进一步的，所述应用包括：将内生真菌P-B313与石斛组培苗共培养，使其定殖于石斛苗根部，以提高石斛苗在缺磷环境下的长势及品质。所述长势由株高、茎基宽、叶绿素含量、干重、鲜重、根长及根数等生长指标表征；所述品质由石斛组织内多糖、总黄酮、总多酚等活性物质含量表征。

优选的，石斛愈伤组织生根后接入含有内生真菌P-B313的培养基中进行共培养。

优选的，所述共培养的条件为：22-25℃下培养60-90天，每天光照16h，暗培养8h。

本发明还提供了一种提高石斛耐低磷胁迫性能的方法，包括以下步骤：

(1)将保藏号为CCTCC NO:M 2021504的内生真菌P-B313接种至PDA固体培养基上活化培养；

(2)将消毒后的石斛愈伤组织接种到1/2MS培养基上，培养得到生根的石斛苗，再将石斛苗接种到含有内生真菌P-B313菌饼的1/2MS培养基上，培养获得根部定殖有内生真菌P-B313的石斛苗。

优选的，步骤(1)中，活化培养条件为：25℃黑暗培养5-7天。

优选的，步骤(2)中，石斛愈伤组织经表面消毒后于22-25℃条件下萌发，培养7-10天获得生根的石斛苗。具体方法：将石斛愈伤组织用1％的NaClO表面消毒15分钟，用无菌水清洗3次。再将消毒后的石斛愈伤组织放在1/2MS培养基上，在恒温培养箱培养7-10天，待其生根。

石斛愈伤组织生根后移入新的1/2MS培养基，同时接入内生真菌P-B313菌饼。

优选的，共培养的条件为：22-25℃下培养，每天光照16h，暗培养8h。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了假瓶霉属内生真菌P-B313应用于石斛以提高石斛耐低磷胁迫性能的新用途。将内生真菌P-B313菌株与石斛共培养，使其定殖于石斛苗根部，增强石斛苗对低磷胁迫的抗性，提高石斛对缺素环境的适应性，促进石斛生长并提升其品质。内生真菌P-B313菌株对石斛显著的共生互作效果使其在农业领域内的推广应用具有巨大价值。

附图说明

图1为内生真菌P-B313菌株提高石斛苗耐低磷胁迫的照片。

图2为光学显微镜下内生真菌P-B313菌株在石斛根部的定殖。标尺为50μm。其中被台盼蓝染色的蓝色部分为菌株的厚垣孢子。

图3为内生真菌P-B313菌株提高石斛苗耐低磷胁迫的生长指标。图中数据为平均数±标准误。显著水平(t-test)：*P<0.1，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图4为内生真菌P-B313对石斛活性成分的影响。图中数据为平均数±标准误。显著水平(t-test)：*P<0.1，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图5为在逆境条件下内生真菌P-B313促进石斛营养吸收。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

内生真菌P-B313由浙江省农业科学院林福呈教授实验室馈赠，该菌分离自云南疣粒野生稻根系，已保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO:M 2021504，分类命名为假瓶霉(Pseudophialophora sp.)，参见申请号为202110529926.X的中国发明专利。

石斛品种为铁皮石斛，来源于浙江大学生物技术研究所。

无磷的1/2MS培养基：1L培养基中含无磷MS salt 2.2g，蔗糖5g，MES 0.5g，NaOH调节pH至5.7，琼脂粉8g。

实施例1

供试植物：石斛

1、P-B313菌株培养

将保存于滤纸片上的P-B313菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d，备用。

PDA培养基：每升含葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂15g。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。

2、P-B313菌株与石斛根部共培养

将石斛愈伤组织用1％的NaClO表面消毒15min，用无菌水清洗3次后备用。将消毒后的愈伤组织接到的1/2MS(Murashige and Skoog)培养基上，用Parafilm封口膜封口，置于25℃植物培养箱(16h光照/8h黑暗)。10天后，将生根的石斛苗接到无磷的1/2MS培养基上，接入3块P-B313菌饼(直径为0.5cm)。对照组为无菌PDA琼脂块。设3个重复。待60天后，观察石斛苗的表型(图1)以及根部内生真菌根部定殖(图2)，并测定石斛苗的生长指标。

结果发现：对照组石斛苗生长严重受阻，植株矮小，茎秆叶片发紫，根系稀疏细短。相比之下，P-B313菌株处理的石斛苗生长健壮、植株高、茎秆粗、叶片绿，根系发达(图1)，株高、茎基宽、叶绿素含量、干重、鲜重、根长及根数均显著高于对照组(图3)。

3、P-B313菌株对石斛活性成分的影响

将铁皮茎、叶分拣，去杂，各鲜品于50℃烘干备用。多糖含量测定参照《中国药典》，线性回归方程为Y＝0.08X+0.0021，R²＝0.9997；总黄酮含量测定参照李志强等的方法，线性回归方程为Y＝10.535X-0.0013，R2＝0.9999；总多酚含量测定参照李娟等的方法，线性回归方程为Y＝0.0823X+0.007，R2＝0.9992。具体结果见图4、表1。

表1低磷胁迫下内生真菌P-B313对石斛活性物质的影响

结果显示：在低磷胁迫下，P-B313菌株处理的石斛苗茎和叶部的多糖含量提高125.0％和308.6％，总黄酮含量提高420.9％和886.9％，总多酚含量提高506.2％和401.2％。

4、P-B313菌株促进石斛逆境条件下营养吸收

分析了P-B313促进石斛适应低磷胁迫时的营养元素含量。具体的，将铁皮茎分拣，去杂，鲜品于50℃烘干备用。取0.5g干粉样品，加入5ml浓硝酸和1ml双氧水，摇匀，静置1min，待硝化。酸硝化后，在电炉上加热赶酸，冷却后，用2％的硝酸定容至200mL。最后，用ICP-OES(IRIS Intrepid II XSP,Thermo,USA)测定P、K、S、Fe、Mg、Zn、Cu含量。采用凯氏定氮法测定氮(N)含量。

结果如图5所示，与内生真菌P-B313共生后，石斛茎秆中N、K、Fe、Mg含量显著增加，与对照相比显著增加了397.18％、360.42％、106.96％和160.66％(图5)。因此，P-B313定殖石斛后能有效促进石斛根系对营养元素的吸收，增加组织中营养元素的含量。

Claims

1.内生真菌P-B313在提高石斛耐低磷胁迫中的应用，其特征在于，所述内生真菌P-B313保藏号为CCTCC NO:M 2021504，分类命名为假瓶霉(Pseudophialophora sp.)。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将内生真菌P-B313定殖于石斛根部组织。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，内生真菌P-B313定殖于石斛根部组织后，促进石斛根系对营养元素的吸收，增加组织中营养元素的含量。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述营养元素包括氮、钾、铁、镁。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将内生真菌P-B313与石斛组培苗共培养，使其定殖于石斛苗根部，以提高石斛苗在缺磷环境下的长势及品质。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，石斛愈伤组织生根后接入含有内生真菌P-B313的培养基中进行共培养。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述共培养的条件为：22-25℃下培养60-90天，每天光照16h，暗培养8h。

8.一种提高石斛耐低磷胁迫性能的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，活化培养条件为：25℃黑暗培养5-7天。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，石斛愈伤组织经表面消毒后于22-25℃条件下萌发，培养7-10天获得生根的石斛苗。