CN115568418B - 一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，属于淫羊藿繁殖技术领域，以块根萌蘖芽为原料制备外植体，通过外植体活体消毒、外植体处理、防褐化处理、启动增殖一体化培养、生根培养，在防褐化步骤中，本发明还制备了一种防褐凝胶。综合以上其他步骤，改善了箭叶淫羊藿组培过程中的褐化率，和以块根为外植体污染率较高的问题。

Description

一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法

技术领域

本发明涉及淫羊藿繁殖技术领域，尤其涉及一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法。

背景技术

箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.属于小檗科淫羊藿属多年生草本植物。它是我国传统中药，其干燥叶作为中药淫羊藿入选2015年《中华人民共和国药典》一部，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效。产于广东、广西、福建、贵州、陕西、甘肃、四川、重庆等地，主要生于海拔200-1750m的林下、水沟边、灌丛中或岩边石缝中。由于需求量大，箭叶淫羊藿的野生资源一度被掠夺式采挖，导致一些地区野生资源枯竭。但野生种源品质大多无法达到药典标准，种子育苗后代良莠不齐，品质无法得到保障。通过无性繁殖培养可以将筛选出具有符合药典要求的箭叶淫羊藿优株进行快速繁育，从而保障种苗的优良性，快速有效地推动淫羊藿产业发展。

目前，传统的箭叶淫羊藿繁殖方式主要是地下根茎的分株繁殖和种子繁殖，分株繁殖系数低，种子繁殖周期长，难以满足箭叶淫羊藿规模化种植对种苗的需求，而组培技术在箭叶淫羊藿种苗生产上应用较少，前人通过叶柄等器官成功繁育出柔毛淫羊藿组培种苗，但是组培种苗暂未投入生产，市场上也暂无淫羊藿组培种苗出售和流通。一方面是淫羊藿的组培快繁外植体启动较难，采用花作为外植体培育时间受限，且材料较少；淫羊藿叶柄较为坚硬，培育周期较长；块根萌蘖芽因埋于地下，且有大量须根，还附有包衣，消毒不易彻底污染率较高。另一方面是增殖过程中容易出现褐化等现象，在组织培养过程中会生成致死的褐化物，不仅会向外扩散污染培养基，还会严重影响外植体的脱分化和器官分化直至死亡，因此大多仅处于试验阶段，无法复制大批量投入生产，因此需要能够有效控制组织培养中的褐化问题，同时寻求简单高效的方法以实现工厂化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，以解决箭叶淫羊藿在组织培养过程中褐化和以块根为外植体污染率较高的问题。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，无性系快繁育苗方法包括以下步骤：

(1)外植体活体消毒：选取刚萌动长度为1cm的箭叶淫羊藿块根萌蘖芽种植于土壤中进行活体消毒处理，直至破土长出芽点；

(2)外植体处理：取出活体消毒后的块根萌蘖芽，剪掉多余的叶子和茎秆，洗净后剪掉块茎的须根，用水冲洗1h，随后用1g/L的洗洁精震荡清洗一遍，再放到流动的水下冲洗2h，剥掉包衣，洗净后将块茎切成小段，即得到萌蘖芽外植体；

(3)防褐化处理：切下来的萌蘖芽外植体用清水冲洗干净后立即插入防褐凝胶中处理1-3h，取出后再用流动的水冲洗30min；

(4)启动增殖一体化培养：将防褐化处理后的萌蘖芽外植体转入启动增殖一体化培养基中，进行一次转接28d的继代培养后继续转入启动增殖一体化培养基，转接3-5次，转接时间总计84-140天，得到增殖丛芽；

(5)生根培养：将增殖丛芽切成单芽后转入生根培养基培养得到生根瓶苗。

进一步，所述步骤(1)中活体消毒处理具体步骤为：在冬季12月份，将土壤连带外植体用1g/L的多菌灵溶液消毒，干透后再采用1g/L的黄腐酸钾溶液消毒，重复上述操作，直至长出1cm长度的芽点。

进一步，所述步骤(2)中萌蘖芽外植体的具体切段步骤为：将洗净后的块茎以萌发的芽点为单位，连着块根，切成0.8-1.2cm的小段。

进一步，所述步骤(3)中防褐凝胶包括以下质量原料：12-18份的质量浓度为2‰的PVP溶液、0.5-1份核黄素、0.05-0.1份二茂铁、0.2-0.7份羟氨羧酸苄酯、5-15份瓜尔豆胶、10-30份二甲基亚砜、1-3份乙基环丙烷。

进一步，所述启动增殖一体化培养基的配方为：MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 1mg/L+维生素H1.5mg/L。

进一步，所述生根培养基的配方为：1/2MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+维生素H1.5mg/L。

进一步，所述启动增殖一体化培养的步骤为：在温度25℃、光照1600lux的条件下光照12h/d，培养28d；

进一步，所述生根培养的步骤为：在生根培养基中以20℃、光照1600lux的培养条件培养15d；最后转入温度25℃、光照1600lux、光照周期12h/d的条件下培养15d。

进一步，所述凝胶的制备方法为：

(1)将二茂铁、羟氨羧酸苄酯加入二甲基亚砜中搅拌溶解制成混合液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌1-3min得到胶液；

(2)将核黄素和水混合配制成5mg/L的核黄素溶液，再将乙基环丙烷和水混合得到800mg/L的乙基环丙烷溶液；

(3)将质量浓度为2‰的PVP溶液、核黄素溶液、乙基环丙烷溶液混合后，加入混合液充分混匀后在20-30KHz下超声10min，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。

在植物组织培养过程中，羟氨羧酸苄酯在氧气的条件下和多酚氧化酶脱水聚合反应，同时和二茂铁协同，阻断自由基，持续和中间产物反应，从而阻断黑色素的生成，加入PVP后进一步通过氢键与酚类物质结合，从而减少酚类物质的毒害，降低褐化率。但是羟氨羧酸苄酯和二茂铁不溶于水，加入二甲基亚砜不仅刺激植物的脂质双层结构，增加通透性，使羟氨羧酸苄酯和二茂铁溶解，同时降低细胞膜电位，增加饱和脂肪酸比例，使得乙基环丙烷在植物细胞内发生非特异性烷基化作用，降低培养过程中的污染率，能够激发几丁质酶的活性，这可以使得植物中的微生物的正常生化反应好新陈代谢受阻，以避免植物细胞中的微生物产生有害的代谢物质，给箭叶淫羊藿造成不可逆的伤害。

有益效果：

1、该技术采用箭叶淫羊藿块根萌蘖芽为外植体，经过启动－增殖一体化培养和生根培养两个阶段即可得到箭叶淫羊藿生根苗，缩短了组培时间和繁殖周期，增殖系数大，生根率高。

2、外植体在启动的时候即开始增殖，采用同一配方，通过连续转接可以得到大量增殖瓶苗，切为单芽后转入生根培养基进行生根培养。方法简单，易重复，成本低，有利于工厂化生产淫羊藿优株无性系种苗。

3、本发明采用的防褐凝胶能有效降低箭叶淫羊藿在组织培养中的褐化率和以块根为外植体时的污染率问题，同时通过控制继代周期，本发明最佳的继代培养时间为28天，可以减轻箭叶淫羊藿培养苗的褐化现象。

说明书附图

图1：转接三次的箭叶淫羊藿增殖瓶苗；

图2：实验组1培养的箭叶淫羊藿增殖瓶苗；

图3：对比组2培养的箭叶淫羊藿生根瓶苗。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明进行详细说明：

本发明提供了一种箭叶淫羊藿的育苗方法，但是在进行育苗之前需要先制备防褐凝胶，本发明制备的防褐凝胶的原料按照表1的数据进行称取，其中PVP溶液的质量浓度为2‰，具体的配比如下所示：

表1(单位：g)

按照表1称取原料制备防褐凝胶，其中实施例1-3的制备方法如下：

(1)将二茂铁、羟氨羧酸苄酯加入二甲基亚砜中搅拌混合制成混合液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌2min得到胶液；

(2)将核黄素和水混合配制成5mg/L的核黄素溶液；将乙基环丙烷和水混合得到800mg/L的乙基环丙烷溶液；

(3)将质量浓度为2‰的PVP溶液、核黄素溶液、乙基环丙烷溶液混合后，加入混合液充分混匀后在25KHz下超声10min，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。

根据表1的配比称取原料，其中对比例1-5的制备方法分别如下：

对比例1：

(1)将二茂铁、羟氨羧酸苄酯加入二甲基亚砜中搅拌混合制成混合液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌2min得到胶液；

(2)将核黄素和水混合配制成5mg/L的核黄素溶液；将乙基环丙烷和水混合得到800mg/L的乙基环丙烷溶液；

(3)将核黄素溶液、乙基环丙烷溶液混合后，加入混合液充分混匀后在25KHz下超声10min，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。

对比例2：

(1)将二茂铁羟氨羧酸苄酯溶于二甲基亚砜中搅拌溶解制成混合液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌2min得到胶液；

(2)乙基环丙烷和水混合得到800mg/L的乙基环丙烷溶液；

(3)将质量浓度为2‰的PVP溶液、乙基环丙烷溶液混合后，加入混合液充分混匀后在25KHz下超声10min，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。

对比例3：

(1)将羟氨羧酸苄酯加入二甲基亚砜中搅拌溶解制成羟氨羧酸苄酯溶液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌2min得到胶液；

(2)将核黄素和水混合配制成5mg/L的核黄素溶液；再将乙基环丙烷和水混合得到乙基环丙烷溶液；

(3)将质量浓度为2‰的PVP溶液、核黄素溶液、乙基环丙烷溶液混合后，加入羟氨羧酸苄酯溶液充分混匀后在25KHz下超声10min，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。

对比例4：

(1)二茂铁加入二甲基亚砜搅拌溶解制成二甲基亚砜溶液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌2min得到胶液；

(2)将核黄素和水混合配制成5mg/L的核黄素溶液；再将乙基环丙烷和水混合得到800mg/L的乙基环丙烷溶液；

(3)将质量浓度为2‰的PVP溶液、核黄素溶液、乙基环丙烷溶液混合后，加入二茂铁溶液充分混匀后在25KHz下超声10min，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。

对比例5：

(1)将二茂铁、羟氨羧酸苄酯加入二甲基亚砜中搅拌溶解制成混合液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌2min得到胶液；

(2)将核黄素和水混合配制成5mg/L的核黄素溶液；

(3)将质量浓度为2‰的PVP溶液、核黄素溶液混合后，加入混合液充分混匀后超在25KHz下超声10min，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。

实施例4：

制备启动增殖一体化培养基：

每升启动增殖一体化培养基含有MS基础培养基、0.2mg/L NAA、1mg/L 6-BA、维生素H1.5mg/L。

实施例5：

制备生根培养基：

每升生根培养基含有1/2的MS基础培养基、0.5mg/L IBA、0.2mg/L NAA、维生素H1.5mg/L。

实施例6：

进行箭叶淫羊藿无性繁殖培养：

(1)外植体活体消毒：选取符合药典标准的刚萌动的长度1cm，未破土的箭叶淫羊藿块根萌蘖芽种植于土壤中。在冬季12月份开始，先采用1g/L多菌灵溶液浇透土壤，待土壤干了以后采用1g/L黄腐酸钾溶液浇透，期间不采用清水浇，如此间歇性循环进行四次活体消毒，直至破土长出1cm长度的芽点；

(2)外植体处理：将块茎取出，剪掉多余的叶子和茎秆，洗干净表面的泥土后再慢慢剪掉所有的须根。放在流动的水下大水冲洗1h，随后用1g/L的洗洁精震荡清洗一遍，再放到流动的水下冲洗2h。剥掉表面附着的包衣，整体洗净后再以萌发的芽点为单位，连着块根，切成1cm的小段，即为萌蘖芽外植体；

(3)防褐化处理：切下来的萌蘖芽外植体用清水冲洗干净后立即插入防褐凝胶中3h，随后再用流动的水冲洗30min；

(4)启动增殖一体化培养：将处理干净的萌蘖芽外植体转入启动增殖一体化培养基中，于25℃、1600lux下光照12h/d，如此培养28天后继续转入该培养基，转接4次，转接时间总计112天；

(5)生根培养：将增殖丛芽切成单芽，转入生根培养基。先置于20℃环境培养15天，随后转入25℃、1600lux下一天光照12h，再培养15天，得到生根瓶苗。

对比例6：同实施例4，仅将步骤(1)的活体消毒步骤间歇性循环2次。

对比例7：同实施例4，仅去除步骤(3)防褐化处理。

对比例8：同实施例4，仅将步骤(4)的一次继代时间为28天，转接时间总计112天替换为一次继代时间为23天，转接时间总计92天。

对比例9：同实施例4，仅将步骤(4)的一次继代时间为28天，转接时间总计112天替换为一次继代时间为24天，转接时间总计96天。

对比例10：同实施例4，仅将步骤(4)的一次继代时间为28天，转接时间总计112天替换为一次继代时间为32天，转接时间总计128天。

对比例11：同实施例4，仅将步骤(4)的一次继代时间为28天，转接时间总计112天替换为一次继代时间为33天，转接时间总计132天。

防褐化试验：

1、育苗方法：

实验组1：实验组1为采用实施例4的育苗方法，其中实施例4选用的为实施例1的防褐凝胶；

对照组：对照组1-5采用实施例4的育苗方法进行育苗，但防褐凝胶分别选用对比例1-5制备的防褐凝胶；对照组6-11采用对比例6-11的育苗方法进行育苗，育苗过程中的防褐凝胶均选用实施例1制备的防褐凝胶；

2、外植体选取：选取2400株相同品种、相同管理方法的两年生刚萌动的长度1cm左右，未破土的箭叶淫羊藿萌蘖芽作为母株，分成12组，每组100株，三个重复。

3、具体实验方法：根据实验组和对照组的育苗方法，于生根培养后检测生根苗的褐化率、污染率和生根率测试，得到的数据如表1-3所示：

其中，抗褐化率(％)＝未褐化株数/接种总数×100％

生根率＝生根的植株数/植株的总数×100％

污染率＝被污染的植株数/植株的总数×100％

增殖系数＝增殖数/原个体数

表1：不同原料制备的防褐凝胶

	抗褐化率/％	生根率/％	污染率/％	增殖系数
					实验组1	95％	92％	1％	4.1
对比组1	82％	79％	2％	3.7
					对比组2	86％	81％	3％	3.8
对比组3	74％	72％	5％	3.3
					对比组4	79％	76％	4％	3.5
对比组5	77％	70％	20％	3.1

分析表1的数据可知：

1、与实验组1相比对比组1中未添加PVP溶液、对比组3未添加二茂铁，对比组4未加入羟氨羧酸苄酯。与实施例1相比，对比组1的生根率降低13％、污染率升高1％，抗褐化率降低13％，对比组3的生根率降低20％、污染率升高4％，抗褐化率降低21％，对比组4的生根率降低16％、污染率升高3％，抗褐化率降低16％，为，这是由于二茂铁能和羟氨羧酸苄酯协同，阻断自由基，持续和中间产物反应，从而阻断黑色素的生成，未添加羟氨羧酸苄酯时也不能在氧气的条件下和多酚氧化酶发生脱水聚合反应，降低酶氧化酚类物质的速度进而很好的阻止外植体在培养过程中褐化，造成了褐化率提高，同时由于未添加PVP溶液时，没有氢键与酚类物质结合，导致酚类物质的毒害未能减弱，褐化率进一步升高，使组培苗坏死亡，使得培养基内的细菌和真菌得以繁殖，进而影响培养过程中组培苗的生根率和污染率，即PVP溶液、二茂铁、羟氨羧酸苄酯协同作用于营养或的育苗方法，共同降低褐化率，提高成活率。

2、对比组5未添加二甲基亚砜和乙基环丙烷，制备的过程中无法溶解二茂铁和羟氨羧酸苄酯，同时也无法降低细胞膜电位，增加饱和脂肪酸比例，没有乙基环丙烷在植物细胞内发生非特异性烷基化作用，不能激发几丁质酶的活性使得植物中的微生物的正常生化反应好新陈代谢受阻，因此效果不佳。观察各实验组的污染率，仅有对比组5的污染率最大为20％，原因是未加入乙基环丙烷和二甲基亚砜，未能进一步消灭组织培养过程中箭叶淫羊藿内部的细菌，使得污染率变高。

表2：不同处理步骤制备的絮凝剂

	抗褐化率/％	生根率/％	污染率/％	增殖系数
					实验组1	95％	92％	1％	4.1
对比组6	53％	35％	50％	1.9
					对比组7	72％	70％	6％	3.1

通过表2可知，在外植体活体消毒阶段需要进行多次活体消毒，消毒不彻底会导致外植体受污染，从而影响箭叶淫羊藿的成活率，也导致最终的抗褐化率和生根率效果不理想。对比组7同实验组1相比，仅去除防褐化处理，但是抗褐化率降低23％，生根率下降22％。对比组6的污染率过大事因为外植体消毒处理不到位，使得大部分细菌能够存活，因此污染率极高。

表3：不同继代周期下制备的絮凝剂

	继代周期	抗褐化率/％	生根率/％	增殖系数
					实验组4	28d	95％	92％	4.1
对比组8	23d	98％	78％	3.6
					对比组9	24d	97％	82％	3.8
对比组10	32d	84％	79％	3.7
					对比组11	33d	79％	75％	3.4

通过表3可知，继代周期短可以抑制箭叶淫羊藿褐化，但时间过短导致生根率不高，继代周期增长，组织培养中的箭叶淫羊藿所需的营养物质已经消耗殆尽，同时培养基中累积了许多代谢产物，抗褐化率降低，诱导率也降低，本发明的继代周期既可以控制箭叶淫羊藿较低的褐化率，又兼得较高的生根率。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (5)

1.一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，其特征在于，无性快繁的育苗方法包括以下步骤：

（1）外植体活体消毒：选取刚萌动长度为1cm的箭叶淫羊藿块根萌蘖芽种植于土壤中进行4次活体消毒处理，直到破土长出芽点；所述活体消毒处理具体步骤为：在冬季12月份，将土壤连带外植体用1g/L的多菌灵溶液消毒，干透后再采用1g/L的黄腐酸钾溶液消毒，重复上述操作，直至长出1cm长度的芽点；

（2）外植体处理：取出活体消毒后的块根萌蘖芽，剪掉多余的叶子和茎秆，洗净后剪掉块茎的须根，用水冲洗1h，随后用1g/L的洗洁精震荡清洗一遍，再放到流动的水下冲洗2h，剥掉包衣，洗净后将块茎切成小段，即得到萌蘖芽外植体；

（3）防褐化处理：切下来的萌蘖芽外植体用清水冲洗干净后立即插入防褐凝胶中处理1-3h，取出后再用流动的水冲洗30min；所述防褐凝胶包括以下质量原料：12-18份的质量浓度为2‰的PVP溶液、0.5-1份核黄素、0.05-0.1份二茂铁、0.2-0.7份羟氨羧酸苄酯、5-15份瓜尔豆胶、10-30份二甲基亚砜、1-3份乙基环丙烷；

（4）启动增殖一体化培养：将防褐化处理后的萌蘖芽外植体转入启动增殖一体化培养基中，进行一次转接28d的继代培养后继续转入启动增殖一体化培养基，转接3-5次，转接时间总计84-140天；得到增殖丛芽；所述启动增殖一体化培养基的配方为：MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 1mg/L+维生素H 1.5mg/L；

（5）生根培养：将增殖丛芽切成单芽，将单芽转入生根培养基培养得到生根瓶苗，所述生根培养基的配方为：1/2 MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+维生素H 1.5mg/L。

2.根据权利要求1所述的一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，其特征在于，所述步骤（2）中萌蘖芽外植体的具体切段步骤为：将洗净后的块茎切成0.8-1.2cm的小段。

3.根据权利要求2所述的一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，其特征在于，所述启动增殖一体化培养的步骤为：在温度25℃、光照1600lux的条件下光照12h/d，一共培养28d。

4.根据权利要求3所述的一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，其特征在于，所述生根培养的步骤为：在生根培养基中以20℃、光照1600lux的培养条件培养15d，最后转入温度25℃、光照1600lux、光照周期12h/d的条件下培养15d。

5.根据权利要求4所述的一种箭叶淫羊藿优株块根无性快繁的育苗方法，其特征在于，所述凝胶的制备方法为：

（1）将二茂铁、羟氨羧酸苄酯加入二甲基亚砜中搅拌溶解制成混合液；将瓜尔豆胶和水混合，在500r/min的转速下搅拌1-3min得到胶液；

（2）将核黄素和水混合配制成5mg/L的核黄素溶液；将乙基环丙烷和水混合得到800mg/L的乙基环丙烷溶液；

（3）将质量浓度为2‰的PVP溶液、核黄素溶液、乙基环丙烷溶液混合后，加入混合液充分混匀后在20-30KHz下超声，最后加入胶液搅拌，形成防褐凝胶。