CN1934933A - 何首乌的组织培养快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种何首乌的组织培养快繁方法，包括准备外植体、诱导培养、分化培养、生根培养，具体步骤为1)何首乌一年生枝条经0.1％升汞消毒后切成1～2cm长的带侧芽的茎段，接种到具有6－BA和IBA的MS培养基中进行初代诱导培养，培养30～35天形成丛生芽；2)将初代诱导培养得到的丛生芽分成1～2cm长的单个小芽，接种到具有6－BA和IBA的MS培养基中进行继代培养；3)当芽苗长至4～5cm时接种到1/2MS培养基中进行生根培养。本发明方法繁殖何首乌，不仅可以节约培育成本、提高生产效率，而且不受外界条件的限制，四季皆可进行，节约育苗占地面积，可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。

Description

何首乌的组织培养快繁方法
技术领域
本发明涉及通过组织培养技术的植物再生方法，特别涉及何首乌的组织培养快繁方法。
背景技术
何首乌作为我国一种名贵的大宗中草药材，除了应用于中药外，还可用于制取洗发水、首乌酒、保健品、食品和饲料添加剂等，开发前景十分广阔，但是，近几十年来对野生何首乌掠夺性采挖现象非常严重，导致何首乌野生资源急剧下降，对当地植被和区域生态平衡造成严重破坏。因此，保护现有何首乌野生资源，大力发展何首乌人工栽培，具有重要的生态和经济意义。目前在广东、山东及河南等地虽有人工栽培，但品种混杂、产量较低。何首乌的组织培养快繁技术为其优良种源快速选育、遗传改良以及工厂化生产优质的无菌苗具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种何首乌的组织培养快繁方法，以便进行工厂化生产以满足市场需求。
本发明的何首乌的组织培养快繁方法，其步骤如下：
(1)何首乌一年生枝条外植体经消毒后切成1～2cm长的带侧芽茎段，接种到具有6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，以下简称6-BA)和萘乙酸(naphthyleneacetic acid，以下简称NAA)或6-BA和吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，以下简称IBA)的MS培养基(Murashige and Skoog mediums)中进行初代诱导培养，培养30～35天形成丛生芽；
(2)将初代诱导培养得到的丛生芽切成1～2cm长的单个小芽，接种到具有6-BA和IBA的MS培养基中进行继代培养；
(3)当芽苗长至4～5cm时接种到1/2MS生根培养基中生根培养至生根成苗。
本发明优选消毒方式是将外植体茎段用洗衣粉溶液浸泡并用柔软毛刷轻轻涮洗表面5min，然后用自来水冲洗干净，再在无菌操作条件下用0.1％氯化汞消毒4～5min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。
其中，优选初代诱导培养所用培养基中含有6-BA1.0～1.2mg/L+NAA0.08mg/L或6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L；继代培养所用培养基中含有6-BA0.75～1.5mg/L+IBA0.05～0.1mg/L，优选6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L或6-BA0.75mg/L+0.05mg/L；生根培养所用培养基中含有6-BA0.5mg/L+IBA0.5～1.0mg/L。
其中，MS培养基中蔗糖重量用量为3％，琼脂重量用量为0.7％，培养基消毒方式为在121℃下灭菌17min，培养基的pH值为5.8；优选培养条件为温度25±2℃，采用光照强度为1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。
采用本发明的方法繁殖何首乌，不仅可以节约大量外汇，而且不受外界条件的限制，四季皆可进行，节约育苗占地面积，降低生产成本。本发明的何首乌组织培养快繁方法利用细胞的全能性，采取植物体上的细胞团或一块组织，通过人为条件的控制，使这些组织形成千百万植株，并且保存了母本的全部优良性状，且遗传性状稳定。这种方法可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。
本发明方法具有以下优点：
1.诱导培养中采用IBA作为调节剂时，腋芽开始萌动生长的时间较短，仅为为10天左右，因此可以节约培育成本，并且提高了生产效率。
2.培养基中采用IBA作为生长调节剂，只要采用具有很低浓度生长调节剂(仅为0.05～1.0mg/L)的培养基就可促进何首乌茎段的生根、生长并达到较高的增殖率，继代培养30天后的芽增值率达到3.56-4.02，生根培养20天后的生根率达到91.6-96.3％，继代培养两三代之后，试管苗生长更好，枯死现象几乎不存在，经继代培养之后试管苗生活力和抗逆性明显提高。而且，由于培养基中采用的生长调节剂浓度较低，降低了在工厂化组培育苗中的生产成本投入。
具体实施方式
下面结合实例说明本发明何首乌的组织培养快繁方法。
实施例1
采取以下步骤繁殖何首乌：
1.取何首乌一年生枝条，用洗衣粉溶液浸泡并用柔软毛刷轻轻涮洗表面5min，然后用自来水冲洗干净，再在超净工作台内进行无菌操作，用0.1％氯化汞消毒4～5min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，最后将其切成1～2cm长的带侧芽茎段，接种入诱导培养基中。
2.初代诱导培养。将带腋芽的茎段接种在诱导培养基上，诱导培养基的组成是：以MS为基本培养基，加入6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L，蔗糖用量为3％，琼脂为0.7％，pH值为5.8。培养基在121℃下灭菌17min。培养温度为25+2℃，采用日光灯照明，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～14h/d。其中采用IBA作为调节剂时，腋芽开始萌动生长的时间为10天左右，培养30～35d后均形成丛生芽。
3.继代培养。将初代诱导培养得到的不定芽切成，1～2cm长的单个小芽，接种在附加不同生长调节剂的继代培养基中进行继代培养，继代培养基的组成是：以MS为基本培养基，加入6-BA0.75mg/L+IBA0.05mg/L，蔗糖用量为3％，琼脂用量为0.7％，pH值为5.8。培养基在121℃下灭菌17min。培养温度为25±2℃，采用日光灯照明，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～14h/d。
在本步骤中，芽培育到第20天时，取25株测量其株高，取其平均值为原始平均高H1；培养至第30天时测量的每组各株高的平均值为平均高度H2，根据测得的H1和H2的值，计算出实际的增高值ΔH(ΔH＝H2-H1)。另外，计算增殖率(增殖率＝培养30天后分化总芽数/接种外植体数)。具体数据见表一。
4.生根培养。当芽苗长至4～5cm时，接于不同生长调节剂浓度的生根培养基上，生根培养基的组成是：以1/2MS(大量元素减半，其它成分不变)为基本培养基，加入6-BA0.5mg/L+IBA0.5mg/L。蔗糖用量为3％，琼脂为0.7％，pH值为5.8。培养基在121℃下灭菌17min。培养温度25±2℃，采用日光灯照明，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～14h/d。4～5d后，芽基部开始出现一层白色半透明的愈伤组织。10～12d时，开始有少量根须出现。至15d时，仍仅有少量植株发根，且根量少、短，未能体现出各处理间的差异。至20d时，处理的优劣已能很好地体现出来，生长调节剂配比不同则何首乌芽苗生根率、根数及根的长度表现出差异。
在本步骤中，将芽苗培养至20天时，取50株苗计算其生根率(生根率＝生根个数/接种个数×100％)，取其平均值为平均生根率；记录根数，并计算根平均长度(根平均长度＝根总长/根数)具体数据见表二。
实施例2
除生根培养基中所用生长调节剂的浓度和配比为6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L外，其余均与实施例1相同。
实施例3
除继代培养基中所用生长调节剂的浓度和配比为6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L、外，其余均与实施例1相同。
实施例4
除继代培养基中所用生长调节剂的浓度和配比为6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L外，生根培养基中所用生长调节剂的浓度和配比为6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L外，其余均与实施例1相同。
下面的表一和表二分别给出了实施例1至4中植物激素对继代培养和生根培养阶段何首乌生长的影响数据。
表一继代培养基对何首乌茎段培养的影响
 植物激素(mg/L)     原始平均高H1(cm)     平均高度H2(cm) ΔH＝H2-H1(cm) 增殖率
 6BA+NAA
  实施例1  0.75+0.05     1.87     3.01     1.14     3.56
  实施例2  0.75+0.05     1.87     3.01     1.14     3.56
  实施例3  1.5+0.1     2.00     3.58     1.58     4.06
  实施例4  1.5+0.1     2.00     3.58     1.58     4.06
表二生根培养基对何首乌生根培养的影响
  植物激素(mg/L) 生根率(％) 根粗度 根数(根) 根平均长度(cm)
  6BA+NAA
  实施例1   0.5+0.5     91.6     中等     ＞10     3.6
  实施例2   0.5+1.0     96.3     粗     ＞12     3.0
  实施例3   0.5+0.5     91.6     中等     ＞10     3.6
  实施例4   0.5+1.0     96.3     粗     ＞12     3.0

Claims (9)

1.一种何首乌的组织培养快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)何首乌一年生枝条外植体经消毒后切成1～2cm长的带侧芽茎段，接种到具有6-BA和IBA的MS培养基中进行初代诱导培养，培养30～35天形成丛生芽；
(2)将初代诱导培养得到的丛生芽切成1～2cm长的单个小芽，接种到具有6-BA和IBA的MS培养基中进行继代培养；
(3)当芽苗长至4～5cm时接种到1/2MS生根培养基中生根培养至生根成苗。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述消毒是将一年生外植体用洗衣粉溶液浸泡并用柔软毛刷轻轻涮洗表面5min，然后用自来水冲洗干净，再在无菌操作条件下用0.1％氯化汞消毒4～5min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述初代诱导培养所用培养基中含有6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L或6-BA1.0～1.2mg/L+NAA0.08mg/L。
4.根据权利要求1至3任一所述方法，其特征在于所述继代培养所用培养基中含有6-BA0.75～1.5mg/L+IBA0.05～0.1mg/L。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于所述分化继代培养所用培养基中含有6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于所述分化继代培养所用培养基中含有6-BA0.75mg/L+IBA0.05mg/L。
7.根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于所述生根培养的培养基中含有6-BA0.5mg/L+IBA0.5～1.0mg/L。
8.根据权利要求1至7任一所述方法，其特征在于所述MS培养基中蔗糖重量用量为3％，琼脂重量用量为0.7％，培养基灭菌方式为在121℃下灭菌17min，培养基的pH值为5.8。
9.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于所述培养条件为温度25±2℃，采用光照强度1000～20001x的日光灯照明，光照时间10～14h/d。
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