CN114902962A - 一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，属于箭叶淫羊藿块根消毒技术领域，包括以下步骤，(1)外植体预处理：将箭叶淫羊藿整株完整拔起，洗净全株泥土后初步杀菌埋入无菌基质内，进行间歇消毒；(2)外植体制备：待箭叶淫羊藿植株产生萌孽芽后整株拔起，用洗洁精溶液清洗干净剪下的带芽块茎，再以萌孽芽为单位剪成带芽的根段，置于清水冲洗；(3)内部消毒：采用内生消毒液消毒；(4)表面消毒：将内部消毒后的外植体转入超净工作台，采用升汞溶液间歇消毒，本发明的方法可以同时对箭叶淫羊藿块根进行内外消毒，降低有害菌群数量，提高增殖效率，提高成活率。

Description

一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法

技术领域

本发明涉及箭叶淫羊藿块根消毒技术领域，尤其涉及一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法。

背景技术

箭叶淫羊藿是药典收录的淫羊藿品种之一，药用成分含量高，药效显著。采用块根萌蘖芽做外植体进行组织培养，具有启动率高、增殖周期短、增殖系数高的优点，是发展箭叶淫羊藿产业的优良培育方法。

组织培养污染指在培养过程中由于真菌、细菌或病毒的侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象，包括材料带菌，接种污染，培养过程污染。淫羊藿新生块根萌蘖芽埋于土壤，土壤菌群含量高，种类丰富，且萌蘖芽隐藏于多而密且相对较硬的根之中，难以彻底消毒获得无菌外植体，此外，切下后的带芽块根置于酒精、升汞等常用外植体消毒剂中极难把握消毒时间，容易出现消杀致死或是污染率较高、褐化的情况。除此之外，内生菌也会造成组织培养污染。内生菌普遍存在于植物组织中，且难以用常规方法彻底消灭，当植物组织进行离体培养时，这些内生菌就容易引起污染。在正常的灭菌条件下，由内生菌产生的污染占所有污染源的四分之一，若污染发生在培养过程早期，往往导致增殖效率降低，材料生长减缓，玻璃化苗增加，甚至培养失败，若污染发生在后期，会导致组培苗移栽困难和死亡，更甚污染还会引起培养材料的遗传物质变异。因此选取启动率高的无菌外植体成为培育淫羊藿优质种苗，同时对箭叶淫羊藿外植体进行体内外消毒，同时可以有效保持淫羊藿块根和萌孽芽活力以及生命力是对扩大淫羊藿种植发展大有裨益的。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，同时对箭叶淫羊藿块根进行内外消毒，降低有害菌群数量，提高增殖效率，提高成活率。

本发明同过以下技术方案解决上述问题：

一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，所述步骤如下：

(1)外植体预处理：将箭叶淫羊藿整株完整拔起，洗净全株泥土后，用多菌灵溶液浸泡30min后埋入无菌基质内，浇黄腐酸钾溶液定根后置于阴凉通风处；箭叶淫羊藿植株长出新根还未发芽以前浇甲基硫菌灵溶液和磷酸二氢钾溶液保持盆土湿润，发芽后采用黄腐酸钾溶液和甲霜·恶霉灵溶液间隔浇水；

(2)外植体制备：待箭叶淫羊藿植株产生萌孽芽后整株拔起，冲洗干净，剪掉多余的枝叶以及须根，仅留下块根主体以及萌孽芽点，用洗洁精溶液清洗剪下带芽块茎，以萌孽芽为单位剪成1cm左右带芽的根段，置于清水冲洗；

(3)内部消毒：将冲洗后的根段加入内生消毒液中，随后进行低温降压处理8-12min后恢复至常温继续浸泡10-15min，用无菌水冲洗干净后控干水分，得到内部消毒的外植体；

(4)表面消毒：将内部消毒后的外植体转入超净工作台，酒精震荡消毒后用无菌水漂洗，控干水分后转入升汞溶液充分震荡消毒，再次用清水漂洗后控干水分，随后重复以上升汞消毒后得到无菌外植体。

进一步，所述多菌灵溶液、黄腐酸钾溶液、甲基硫菌灵溶液、磷酸二氢钾溶液、甲霜·恶霉灵溶液、洗洁精溶液的浓度均为1wt‰。

由于箭叶淫羊藿的新生块根萌蘖芽埋于土壤，土壤菌群含量高，种类丰富且萌蘖芽隐藏于多而密且相对较硬的根之中，所以在外植体预处理和外植体制备过程中采用黄腐酸钾溶液、甲基硫菌灵溶液、甲霜·恶霉灵溶液对块根进行间歇逐步消毒，即可以逐渐降低土壤及块根中的有害菌群数量，还可以降低外植体的耐药性，避免后续的种植过程中对杀菌剂产生耐药性，进而导致箭叶淫羊藿植株抗病害困难，难以大规模种植。

进一步，所述升汞溶液的浓度为1wt‰。

进一步，所述内生消毒液的原料包括：ABA、蔗糖、水杨酸、维生素B3。

进一步，所述内生消毒液中ABA的浓度为3-4mol/L、水杨酸浓度为0.3-0.5mol/L。

进一步，所述内生消毒液中维生素B3浓度为2-3g/L、蔗糖的浓度为40-45g/L。

进一步，所述低温降压处理的具体操作为：将根段加入内生消毒液后降压至0.7-0.8个标准大气压，置于4-5℃的低温下处理8-12min。

当箭叶淫羊藿的块根在低温、降低的条件下细胞的通透性改变，再结合浸泡内生消毒液，渗透调节物质含量增加，渗透压提高，易于穿过细胞的低分子量化合物蔗糖、维生素B3、水杨酸、ABA等内生消毒液进入植株细胞内部，使细菌无法继续发育进而杀死内生病菌，增强杀菌效果，同时适宜浓度的蔗糖与ABA与磷脂相互作用而稳定细胞膜，防止在低温条件下破坏外植体的活性。

进一步，所述表面消毒的具体操作步骤为：将内部消毒后的外植体转入超净工作台，酒精震荡消毒15s后用无菌水漂洗三次，控干水分后转入升汞溶液充分震荡消毒2min，再次用清水漂洗后控干水分，随后重复以上升汞消毒2次后得到无菌外植体。

由于酒精、升汞溶液等常用外植体消毒剂中极难把握消毒时间，容易出现消杀致死或是污染率较高、褐化的情况，所以本发明采用间歇消毒方式缩短升汞溶液单次消毒时间，低浓度间歇性的活体消毒过程可以有效保持淫羊藿块根和萌孽芽活力以及生命力，保证外植体的启动率。

进一步，所述无菌基质是由无菌蛭石、草炭、园土、河沙按照体积比为2：0.5：0.5：1的比例混合而成，所述无菌基质使用前用1wt‰多菌灵溶液浇透，自然晾干后再浇2wt‰黄腐酸钾溶液至基质微潮，以手捏成团却不滴水为准，密封15天后使用。

有益效果：

本发明采用鸡尾酒式的混合间歇消毒方式结合内部消毒步骤，可最大程度降低土壤以及块根中的有害菌群数量以及消灭植物组织中的内生细菌，防止离体培养时引起污染，同时采用间歇消毒杀菌，避免淫羊藿块根产生耐药性，提高后期种植成本。低浓度间歇性的活体消毒与内部消毒的过程可以有效保持淫羊藿块根和萌孽芽活力以及生命力，保持植株健康生长，同时提高外植体启动率和成活率，开启箭叶淫羊藿优株无性系工厂化繁育。

附图说明

图1：实施例1消毒后的外植体生长图；

图2：对比例1消毒后的外植体生长图；

图3：对比例5消毒后的外植体生长图；

图4：对比例9消毒后的外植体生长图；

图5：对比例10消毒后的外植体生长图；

图6：对比例11消毒后的外植体生长图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明：

实施例1：箭叶淫羊藿活体消毒

本实施例用的无菌基质是由无菌蛭石、草炭、园土、河沙按照体积比为2：0.5：0.5：1的比例混合而成，无菌基质使用前用1wt‰多菌灵溶液浇透，自然晾干后再浇2wt‰黄腐酸钾溶液至基质微潮，以手捏成团却不滴水为准，密封15天后即可使用。

(1)外植体预处理：将箭叶淫羊藿整株完整拔起，注意不要伤根，洗净全株泥土，1wt‰多菌灵浸泡30min后埋入无菌基质内，浇1wt‰黄腐酸钾溶液定根后置于阴凉通风处；箭叶淫羊藿植株长出新根还未发芽以前间隔浇1wt‰甲基硫菌灵溶液和1wt‰磷酸二氢钾溶液保持盆土湿润，每次浇水以浇透为宜，发芽后采用1wt‰黄腐酸钾溶液和1wt‰甲霜·恶霉灵溶液间隔浇水，仍以保持盆土微湿为标准，每次浇水以浇透为宜；

(2)外植体制备：待箭叶淫羊藿植株产生萌孽芽约1cm左右后整株拔起，将表面的基质冲洗干净，剪掉多余的枝叶以及须根，仅留下块根主体以及萌孽芽点，用1wt‰洗洁精溶液清洗剪下的带芽块茎，以萌孽芽为单位剪成1cm左右带芽的根段，置于清水下快速冲洗10min后转小水冲洗30min；

(3)内部消毒：将冲洗后的根段加入内生消毒液中，内生消毒液由ABA、水杨酸、蔗糖、维生素B3、水组成，每升内生消毒液中，ABA浓度为3-4mol/L、水杨酸浓度为0.3-0.5mol/L，维生素B3的浓度为2-3g/L，蔗糖的浓度为40-45g/L，本实施例选择的每升内生消毒液中原料浓度为：ABA 3mol/L、水杨酸0.5mol/L，维生素B33g/L，蔗糖45g/L，随后将根段与内生消毒液一起进行降压，降压至0.7个标准大气压，随后置于4℃的温度下处理12min后拿出，自然恢复至常温，继续浸泡10min后取出根段，用无菌水冲洗干净后用无菌吸水纸控干水分，得到内部消毒的外植体；

(4)表面消毒：将内部消毒后的外植体转入超净工作台，75wt％酒精震荡消毒15s后用无菌水漂洗三次，控干水分后转入1wt‰升汞溶液充分震荡消毒2min，再次用清水漂洗三次后控干水分，随后重复以上升汞消毒2次后得到无菌外植体。

实施例2：

本实施例与实施例1的区别仅在于内部消毒步骤不同，内部消毒：将冲洗后的根段加入内生消毒液中，内生消毒液由ABA、水杨酸、蔗糖、维生素B3、水组成，每升内生消毒液中，ABA浓度为3-4mol/L、水杨酸浓度为0.3-0.5mol/L，维生素B3的浓度为2-3g/L，蔗糖的浓度为40-45g/L，本实施例选择的浓度为：ABA 3.5mol/L、水杨酸0.4mol/L，维生素B32.5g/L，蔗糖43g/L，随后将根段与内生消毒液一起进行降压，降压至0.75个标准大气压，随后置于4℃的温度下处理10min后拿出，自然恢复至常温，继续浸泡13min后取出根段，用无菌水冲洗干净后用无菌吸水纸控干水分，得到内部消毒的外植体。

实施例3：

本实施例与实施例1的区别仅在于内部消毒步骤不同，内部消毒：将冲洗后的根段加入内生消毒液中，内生消毒液由ABA、水杨酸、蔗糖、维生素B3、水组成，每升内生消毒液中，ABA浓度为3-4mol/L、水杨酸浓度为0.3-0.5mol/L，维生素B3的浓度为2-3g/L，蔗糖的浓度为40-45g/L，本实施例选择的浓度为：ABA 4mol/L、水杨酸0.3mol/L，维生素B32g/L，蔗糖40g/L，随后将根段与内生消毒液一起进行降压，降压至0.8个标准大气压，随后置于5℃的温度下处理8min后拿出，自然恢复至常温，继续浸泡15min后取出根段，用无菌水冲洗干净后用无菌吸水纸控干水分，得到内部消毒的外植体。

对比例1：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料浓度不同，本对比例的浓度为：ABA 3mol/L、水杨酸0.5mol/L，维生素B33g/L，蔗糖30g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例2：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料浓度不同，本对比例的浓度为：ABA 1mol/L、水杨酸0.5mol/L，维生素B33g/L，蔗糖45g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例3：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料浓度不同，本对比例的浓度为：ABA 3mol/L、水杨酸0.1mol/L，维生素B33g/L，蔗糖45g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例4：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料浓度不同，本对比例的浓度为：ABA 3mol/L、水杨酸0.5mol/L，维生素B31g/L，蔗糖45g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例5：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料不同，本对比例的原料及浓度为：ABA 3mol/L、水杨酸0.5mol/L，维生素B31g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例6：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料不同，本对比例的原料及浓度为：ABA 3mol/L、水杨酸0.5mol/L，蔗糖45g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例7：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料不同，本对比例的原料及浓度为：ABA 3mol/L、维生素B31g/L，蔗糖45g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例8：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤中的内生消毒液原料不同，本对比例的原料及浓度为：水杨酸0.5mol/L，维生素B31g/L，蔗糖45g/L，其余步骤与实施例1相同。

对比例9：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于内部消毒步骤的条件不同，具体操作为：将冲洗后的根段加入内生消毒液后，在常温常压下处理20min后取出根段，用无菌水冲洗干净后用无菌吸水纸控干水分，得到内部消毒的外植体，其余步骤与实施例1相同。

对比例10：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于表面消毒步骤不同，具体操作为：将内部消毒后的外植体转入超净工作台，75wt％酒精震荡消毒15s后用无菌水漂洗三次，控干水分后转入1wt‰升汞溶液充分震荡消毒10min，再次用清水漂洗三次后控干水分，得到无菌外植体，其余步骤与实施例1相同。

对比例11：

本对比例与实施例1形成对比，其区别仅在于未进行内部消毒步骤，外植体制备后直接进行表面消毒，得到无菌外植体。

将实施例1和对比例1-11制备得到无菌外植体分组进行组织培养，每组10个组培瓶，每个组培瓶内一个外植体，重复三次，具体的繁殖步骤如下：

(1)愈伤组织诱导：愈伤组织诱导培养基配方：MS+2,4-D 2mg/L+NAA0.5mg/L+IBA2mg/L+琼脂10g/L，pH＝6.0，2500lx光照强度下，以12h/天的光照进行培养，培养温度24-26℃，培养10天；

(2)分化与增殖培养：将愈伤组织置于增殖培养基，分化培养基配方：MS+6-BA2mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L+琼脂10g/L，pH值调至6.0，进行芽的再生培养，2500lux光照强度下，12h/天的光照进行培养，培养温度24-26℃，培养20天，统计每组外植体丛生芽生长情况，得到的数据如表1所示：

表1外植体污染及启动生长情况

分析数据：

1、根据表1的数据可知，实施例1的外植体存活率为100％，长势较好且未出现发霉或褐化现象，说明经过实施例1的内部消毒步骤和表面消毒步骤之后箭叶淫羊藿的整体长势较好，能有效保持淫羊藿块根和萌孽芽活力以及生命力。与对比例11相对比，对比例11未采用内部消毒步骤导致外植体纤弱矮小且颜色发黄，说明外植体发育较差，增殖效率降低，未存活植株的培养基内出现酸味，说明出现内生菌侵染。由此可以说明，内部消毒步骤可以降低内生菌污染，提高增殖效率，提高启动率。

2、对比例1-4与实施例1的区别在于与原料的配比不同，对比例1-3的植株整体长势弱于实施例1，且出现叶片尖部卷曲，说明生长较缓；未存活植株出现褐化或发霉现象，是因为内生菌污染根部，导致植株死亡腐烂。说明若内生消毒液中的浓度较低会造成消毒不彻底现象出现。

3、对比例5-8与实施例1的区别在于原料不同，对比例5-8的外植体生长情况显著差于实施例1，且与对比例1-4相比也较差，存活率仅有50％左右，这是由于内生消毒液复配协同作用于外植体即可以杀死内生细菌，也可以在低温降压的条件下保护植株细胞的活性，提高成活率。

4、对比例9加入内生消毒液后未进行低温降压处理，直接在常温下浸泡，由于常温条件下细胞的通透性几乎不变，内生消毒剂不易进入组织内部进行消毒杀菌从而导致消毒效果较差，植株出现感染进而生长缓慢，出现褐化现象。

5、对比例10与实施例1形成对比，直接采用升汞溶液消毒10min，由于对比例10消毒时间过长导致外植体还未出现感染现象直接死亡，进而造成成活率较低且长势较差，由此可以说明实施例1的间歇消毒方式缩短升汞溶液单次消毒时间，低浓度间歇性的活体消毒过程可以有效保持淫羊藿块根和萌孽芽活力以及生命力，保证外植体的启动率。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (9)

1.一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述步骤如下：

(1)外植体预处理：将箭叶淫羊藿整株完整拔起，洗净全株泥土后，用多菌灵溶液浸泡30min后埋入无菌基质内，浇黄腐酸钾溶液定根后置于阴凉通风处；箭叶淫羊藿植株长出新根还未发芽以前浇甲基硫菌灵溶液和磷酸二氢钾溶液保持盆土湿润，发芽后采用黄腐酸钾溶液和甲霜·恶霉灵溶液间隔浇水；

(2)外植体制备：待箭叶淫羊藿植株产生萌孽芽后整株拔起，冲洗干净，剪掉多余的枝叶以及须根，仅留下块根主体以及萌孽芽点，用洗洁精溶液清洗后剪下带芽块茎，以萌孽芽为单位剪成带芽的根段，置于清水冲洗；

(3)内部消毒：将冲洗后的根段加入内生消毒液中，随后进行低温降压处理8-12min后恢复至常温继续浸泡10-15min，用无菌水冲洗干净后控干水分，得到内部消毒的外植体；

(4)表面消毒：将内部消毒后的外植体转入超净工作台，75％酒精震荡消毒后用无菌水漂洗，控干水分后转入升汞溶液充分震荡消毒，再次用清水漂洗后控干水分，随后重复以上升汞消毒后得到无菌外植体。

2.根据权利要求1所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述多菌灵溶液、黄腐酸钾溶液、甲基硫菌灵溶液、磷酸二氢钾溶液、甲霜·恶霉灵溶液、洗洁精溶液的浓度均为1wt‰。

3.根据权利要求2所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述升汞溶液的为1wt‰。

4.根据权利要求3所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述内生消毒液的原料包括：ABA、蔗糖、水杨酸、维生素B3。

5.根据权利要求4所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述内生消毒液中ABA的浓度为3-4mol/L、水杨酸浓度为0.3-0.5mol/L。

6.根据权利要求5所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述内生消毒液中维生素B3浓度为2-3g/L、蔗糖的浓度为40-45g/L。

7.根据权利要求6所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述低温降压处理的具体操作为：将根段加入内生消毒液后降压至0.7-0.8个标准大气压，置于4-5℃的低温下处理8-12min。

8.根据权利要求7所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述表面消毒的具体操作步骤为：将内部消毒后的外植体转入超净工作台，酒精震荡消毒15s后用无菌水漂洗三次，控干水分后转入升汞溶液充分震荡消毒2min，再次用清水漂洗后控干水分，随后重复以上升汞消毒2次后得到无菌外植体。

9.根据权利要求8所述的一种箭叶淫羊藿块根无性系繁育的活体间歇消毒方法，其特征在于，所述无菌基质是由无菌蛭石、草炭、园土、河沙按照体积比为2：0.5：0.5：1的比例混合而成，所述无菌基质使用前用1wt‰多菌灵溶液浇透，自然晾干后再浇2wt‰黄腐酸钾溶液至基质微潮，以手捏成团却不滴水为准，密封15天后使用。

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