CN110810250B - 一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法,包括:(1)配制相应培养基，备用(2)取生长高度18～22cm,树龄10～14个月的椰枣幼苗的幼嫩茎段部分作为外植体(3)放在抗褐化剂中遮光浸泡,再用海藻酸钠溶液浸泡(4)依次在酒精、山梨酸钾水溶液、次氯酸钠溶液、升汞溶液中浸泡(5)将外植体切成0.8～1.2cm小段于培养基中(6)在黑暗条件下诱导培养；待嫩芽长至2.5～3.5cm,转至光照培养，并进行增殖培养、生根培养，直至获得9～12cm幼苗(7)幼苗移栽(8)水分、施肥及防病管理。本发明实现了将椰枣幼苗茎段作为外植体的组培快速繁殖,不定芽诱导率高,污染率和褐化率低,生长周期短,移栽成活率高。

Description

一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法

技术领域

本发明涉及棕榈植物繁殖技术领域，特别涉及一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法。

背景技术

目前国际上关于椰枣组培做的比较成熟的是阿联酋、埃及等国家。阿拉伯国家主栽椰枣树，其国内有丰富的椰枣资源，由于椰枣大树更容易取出茎尖，使用的外植体通常来自3～5年生椰枣大树，将椰枣树砍伐，取整棵树的茎尖，诱导从生芽，但棕榈科植株生长周期漫长，至诱导丛生芽整个过程需要至少12个月的时间，而且取材成本高，生长周期漫长。而对于椰枣幼苗茎尖生长点较小，不易取出，且在组织培养的过程中极其容易褐化和死亡，故在现有技术中难以有效利用椰枣幼苗作为外植体。

我国处于引种椰枣树阶段，椰枣资源匮乏，多年生的优良椰枣大树资源更是紧缺。传统育苗生长周期漫长，繁殖系数低，因此，研究采用椰枣幼苗的茎段作为外植体，通过组织培养技术在短期内快速建立椰枣植株再生体系的方法，以实现不定芽的快速诱导，缩短育苗生长周期，为种苗的供应提供技术支撑具有重要意义。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，实现了将椰枣幼苗茎段作为外植体的组培快速繁殖，不定芽诱导率和增殖系数提高，且外植体处理污染率和褐化率低，成苗的生长速度快，生长周期短，移栽成活率高。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)配制培养基

改良MS基本培养：在MS基本培养基中加入谷氨酸195～205mg/L、肌醇98～102mg/L、磷酸二氢钾0.16～0.18mg/L、腺嘌呤38～42mg/L、维生素B1 0.2～0.4mg/L、烟酸0.2～0.4mg/L；

诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.05～0.15mg/L 2,4-D、0.5～1.5mg/LNOA、0.05～0.15mg/L 2-IP、0.2～0.8mg/L KT、0.5～1.5mg/L 6-BA、33～38g/L蔗糖、6.0～7.0g/L琼脂，pH 5.5～5.9；

增殖培养基：在改良MS培养基中添加0.1～0.3mg/L 2,4-D、0.5～1.5mg/L NAA、0.05～0.15mg/L 2-ip、0.5～1.5mg/L 6-BA、蔗糖32～38g/L；

生根培养基：在改良MS培养中添加0.5～1.5mg/L NAA、0.3～0.8mg/L GA3、0.5～1.5mg/L 6-BA、蔗糖28～32/L；

将上述培养基在120～122℃，0.13～0.16MPa高温高压下灭菌18～22分钟，放置凝固后备用；

(2)选取外植体

取生长高度为18～22cm，树龄为10～14个月的椰枣幼苗，将幼苗的外部叶片剥离，取出裸露出幼嫩的茎段部分作为外植体；

(3)外植体防褐化处理

将外植体在抗褐化剂中遮光浸泡2.5～3.5小时后，采用0.1～0.3％的海藻酸钠溶液中浸泡5～10min；所述抗褐化剂包括145～155mg/L的抗坏血酸和95～105mg/L柠檬酸；

(4)外植体灭菌处理

将浸泡后的外植体进行消毒灭菌处理，消毒灭菌程序为：先将外植体于73～78％的酒精中浸泡25～35秒，用无菌水冲洗；采用浓度为0.01～0.02g/L山梨酸钾水溶液中浸泡1～2分钟，用无菌水冲洗；采用浓度为0.02～0.03％次氯酸钠溶液浸泡1～2分钟，用无菌水冲洗；再在浓度0.05～0.15％的升汞溶液中浸泡6～10分钟，用无菌水冲洗；

(5)接种

将消毒灭菌后的外植体用无菌滤纸吸干水分后，切成若干0.8～1.2cm小段，并根据植物形态学竖立放置于诱导培养基中，让外植体的基部充分接触培养基；

(6)培养

将接种后的培养基在温度25～30℃的黑暗条件下诱导培养18～22天；待嫩芽长至2.5～3.5cm，转至26～28℃，12h/d的光照下培养，光照强度1500lux～2000lux；

培养18～20天后，接种至增殖培养中进行继代增殖培养，在12h/d的光照下培养，光照强度为1800lux～2000lux；

培养10～15天后，接种至生根培养基中进行诱导生根，在16h/d的光照下培养，光照强度为2000lux～2500lux，直至获得9～12cm高的幼苗；

(7)移栽

将幼苗连瓶先放于控温大棚中20～23℃炼苗一周，再转移至常温下炼苗2～3天，再打开盖子炼苗1～2天，洗净根部后移栽至灭菌后的移栽基质中；

移栽基质为：泥炭土、椰糠、珍珠岩和蛭石按体积比为(1～2):(3～5):(3～5):1混合而成，浇透水并覆盖薄膜保湿；移栽前，先对基质浅翻，耙平后用细木棍打孔，孔深为1～2cm，将幼苗根部放到孔中，并把周围的基质填充，稍压实，喷雾淋定根水；

(8)水分、施肥及防病管理

移栽一周前，基质湿度保持80％～85％，遮阴度为60％～70％；移栽一周后，基质湿度逐渐降低至75％，遮阴度逐渐减少至50％；空气湿度始终保持65～70％；移栽15～20天后，采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾，并用清水淋洗，每7～10d施肥1次；利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，每7～10天喷施一次。

进一步说明，步骤(1)中，改良MS基本培养：在MS基本培养基中加入谷氨酸200mg/L、肌醇100mg/L、磷酸二氢钾0.17mg/L、腺嘌呤40mg/L、维生素B1 0.3mg/L、烟酸0.3mg/L；

诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.1mg/L 2,4-D、1mg/L NOA、0.1mg/L 2-IP、0.5mg/L KT、1mg/L 6-BA、蔗糖35g/L、琼脂6.5g/L，pH 5.7；

增殖培养基：在改良MS培养基中添加0.2mg/L 2,4-D、1mg/L NAA、0.1mg/L2-ip、1mg/L 6-BA、蔗糖35g/L；

生根培养基：在改良MS培养中添加1mg/L NAA、0.5mg/L GA3、1mg/L 6-BA、蔗糖30/L。

进一步说明，步骤(1)中，将培养基在温度121℃，0.15MPa的高温高压下灭菌20分钟。

进一步说明，步骤(2)中，椰枣幼苗的生长高度为20cm，树龄为12个月。若椰枣幼苗的生长高度太低，则幼苗太小，茎段无法完整取出，褐化率高；幼苗太高，茎段老化严重，分化能力下降，影响诱导周期，因此，控制该生长高度的幼苗，其茎段的长短粗细的生长状态更有利于进行有效的外植体组培。

进一步说明，步骤(3)中，所述抗褐化剂包括150mg/L的抗坏血酸和100mg/L柠檬酸，所述外植体在褐化剂中浸泡3小时。

进一步说明，步骤(3)中，将外植体在褐化剂中的浸泡后，采用0.2％的海藻酸钠溶液中浸泡8min。通过采用抗褐化试剂与海藻酸钠溶液组合浸泡处理，可有效的减轻椰枣外植体的褐化，减轻伤口处多酚氧化酶的伤害，避免了现有在培养基中加入的PVP等抗褐化剂所容易导致在椰枣的组织培养中引起毒性，对棕榈类植物产生伤害，不利于外植体的分化诱导的问题。

进一步说明，步骤(4)中，将外植体于75％的酒精中浸泡30秒，用无菌水冲洗1～2次；用浓度为0.01g/L山梨酸钾水溶液中浸泡90秒，用无菌水冲洗1～3次；采用浓度为0.02～0.03％次氯酸钠溶液浸泡1～2分钟，用无菌水冲洗；再在浓度0.1％的升汞溶液中浸泡8分钟，用无菌水冲洗4～6次，采用多步骤灭菌处理，有利于减少不定芽污染率，起到有效的抑菌作用，且降低了对外植体的损伤。

进一步说明，步骤(4)中，在外植体浸泡升汞溶液时，每间隔30～40s进行轻微摇晃，保证灭菌溶液与被灭菌物充分接触，提高灭菌效率。

进一步说明，步骤(6)中，将接种后的培养基在温度28℃的黑暗条件下诱导培养20天；待嫩芽长至2.8～3.2cm，转至27℃，12h/d的光照下培养，光照强度1800lux；培养19天后，接种至增殖培养中进行继代增殖培养，在12h/d的光照下培养，光照强度为1900lux；培养13天后，接种至生根培养基中进行诱导生根，在16h/d的光照下培养，光照强度为2300lux，直至获得10cm高的幼苗。控制接种后的芽诱导、继代培养和生根培养的条件，提高不定芽诱导率和增殖系数，降低外植体污染率和褐化率，提高成苗的生长速度。

进一步说明，步骤(7)中，所述移栽基质中的泥炭土、椰糠、珍珠岩和蛭石按体积比为2:4:4:1混合，提高移栽成活率。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过选取合适的生长高度的椰枣幼苗作为外植体，并严格控制外植体的防褐化和灭菌处理，优化适合椰枣组培快繁的培养基，同时控制接种培养的条件和后期移栽、水分等管理条件，从而成功实现了将椰枣幼苗茎段作为外植体的组培快速繁殖，不定芽诱导率可达87％，1周期的不定芽增殖系数最高为3.2，外植体处理污染率可低至13.4％，外植体处理褐化率可低至11.6％，成苗的生长速度快，由诱导至生根和生根至移栽的周期明显缩短，移栽成活率可达95％。

附图说明

图1为本发明实施例的椰枣幼苗幼嫩的茎段部分图；

图2为本发明实施例的椰枣幼苗外植体芽分化图；

图3为本发明实施例的椰枣幼苗外植体不定芽诱导图；

图4为本发明实施例的椰枣幼苗外植体生根诱导图；

图5为本发明实施例的椰枣幼苗转接继代培养为9～12cm幼苗图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、椰枣种苗快速繁殖

实施例1-一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)配制培养基

改良MS基本培养：在MS基本培养基中加入谷氨酸195mg/L、肌醇98mg/L、磷酸二氢钾0.16mg/L、腺嘌呤38mg/L、维生素B1 0.2mg/L、烟酸0.2mg/L；

诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.05mg/L 2,4-D、0.5mg/L NOA、0.05mg/L2-IP、0.2mg/L KT、0.5mg/L 6-BA、33g/L蔗糖、6.0g/L琼脂，pH 5.5；

增殖培养基：在改良MS培养基中添加0.1mg/L 2,4-D、0.5mg/L NAA、0.05mg/L 2-ip、0.5mg/L 6-BA、蔗糖32g/L；

生根培养基：在改良MS培养中添加0.5mg/L NAA、0.3mg/L GA3、0.5mg/L 6-BA、蔗糖28g/L；将上述培养基在120℃，0.13MPa高温高压下灭菌18分钟，放置凝固后备用；

(2)选取外植体

取生长高度为18cm，树龄为10个月的椰枣幼苗，将幼苗的外部叶片剥离，取出裸露出幼嫩的茎段部分作为外植体；

(3)外植体防褐化处理

将外植体在抗褐化剂中遮光浸泡2.5小时后，采用0.1％的海藻酸钠溶液中浸泡10min；所述抗褐化剂包括145mg/L的抗坏血酸和95mg/L柠檬酸；

(4)外植体灭菌处理

将浸泡后的外植体在超净工作台上进行消毒灭菌处理，消毒灭菌程序为：先将外植体于73％的酒精中浸泡25秒，用无菌水冲洗1次；采用浓度为0.01g/L山梨酸钾水溶液中浸泡1分钟，用无菌水冲洗1次；采用浓度为0.02％次氯酸钠溶液浸泡1分钟，用无菌水冲洗2次；再在浓度0.05％的升汞溶液中浸泡6分钟，每间隔30～40s进行轻微摇晃，用无菌水冲洗4次；

(5)接种

将消毒灭菌后的外植体在超净工作台上，用无菌滤纸吸干水分后，切成若干0.8～1.2cm小段，并根据植物形态学竖立放置于诱导培养基中，让外植体的基部充分接触培养基；

(6)培养

将接种后的培养基在温度25℃的黑暗条件下诱导培养18天；待嫩芽长至2.5～3.5cm，转至26℃，12h/d的光照下培养，光照强度1500lux；

培养18天后，接种至增殖培养中进行继代增殖培养，在12h/d的光照下培养，光照强度为1800lux；

培养10天后，接种至生根培养基中进行诱导生根，在16h/d的光照下培养，光照强度为2000lux，直至获得9cm高的幼苗；

(7)移栽

将幼苗连瓶先放于控温大棚中20～23℃炼苗一周，再转移至常温下炼苗2天，再打开盖子炼苗2天，洗净根部后移栽至灭菌后的移栽基质中；

移栽基质为：泥炭土、椰糠、珍珠岩和蛭石按体积比为1:3:3:1混合而成，浇透水并覆盖薄膜保湿；移栽前，先对基质浅翻，耙平后用细木棍打孔，孔深为1～2cm，将幼苗根部放到孔中，并周围的基质填充，稍压实，喷雾淋定根水；

(8)水分、施肥及防病管理

移栽一周前，基质湿度保持80％～85％，遮阴度为60％～70％；移栽一周后，基质湿度逐渐降低至75％，遮阴度逐渐减少至50％；空气湿度始终保持65～70％；移栽15～20天后，采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾，并用清水淋洗，每7～10d施肥1次；利用500倍多菌灵、500倍75％百菌清、800倍甲霜灵复合防病，每7～10天喷施一次。

实施例2-一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)配制培养基

改良MS基本培养：在MS基本培养基中加入谷氨酸205mg/L、肌醇102mg/L、磷酸二氢钾0.18mg/L、腺嘌呤42mg/L、维生素B1 0.4mg/L、烟酸0.4mg/L；

诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.15mg/L 2,4-D、1.5mg/L NOA、0.15mg/L2-IP、0.8mg/L KT、1.5mg/L 6-BA、38g/L蔗糖、7.0g/L琼脂，pH 5.9；

增殖培养基：在改良MS培养基中添加0.3mg/L 2,4-D、1.5mg/L NAA、0.15mg/L 2-ip、1.5mg/L 6-BA、蔗糖38g/L；

生根培养基：在改良MS培养中添加1.5mg/L NAA、0.8mg/L GA3、1.5mg/L 6-BA、蔗糖32g/L；

将上述培养基在122℃，0.16MPa高温高压下灭菌22分钟，放置凝固后备用；

(2)选取外植体

取生长高度为22cm，树龄为14个月的椰枣幼苗，将幼苗的外部叶片剥离，取出裸露出幼嫩的茎段部分作为外植体；

(3)外植体防褐化处理

将外植体在抗褐化剂中遮光浸泡3.5小时后，采用0.3％的海藻酸钠溶液中浸泡5min；所述抗褐化剂包括155mg/L的抗坏血酸和105mg/L柠檬酸；

(4)外植体灭菌处理

将浸泡后的外植体在超净工作台上进行消毒灭菌处理，消毒灭菌程序为：先将外植体于78％的酒精中浸泡35秒，用无菌水冲洗2次；采用浓度为0.02g/L山梨酸钾水溶液中浸泡2分钟，用无菌水冲3次；采用浓度为0.03％次氯酸钠溶液浸泡2分钟，用无菌水冲洗3次；再在浓度0.15％的升汞溶液中浸泡10分钟，每间隔30～40s进行轻微摇晃，用无菌水冲洗6次；

(5)接种

将消毒灭菌后的外植体在超净工作台上，用无菌滤纸吸干水分后，切成若干0.8～1.2cm小段，并根据植物形态学竖立放置于诱导培养基中，让外植体的基部充分接触培养基；

(6)培养

将接种后的培养基在温度30℃的黑暗条件下诱导培养22天；待嫩芽长至2.5～3.5cm，转至28℃，12h/d的光照下培养，光照强度2000lux；

培养20天后，接种至增殖培养中进行继代增殖培养，在12h/d的光照下培养，光照强度为2000lux；

培养15天后，接种至生根培养基中进行诱导生根，在16h/d的光照下培养，光照强度为2500lux，直至获得12cm高的幼苗；

(7)移栽

将幼苗连瓶先放于控温大棚中20～23℃炼苗一周，再转移至常温下炼苗3天，再打开盖子炼苗1天，洗净根部后移栽至灭菌后的移栽基质中：

移栽基质为：泥炭土、椰糠、珍珠岩和蛭石按体积比为1:5:5:1混合而成，浇透水并覆盖薄膜保湿；移栽前，先对基质浅翻，耙平后用细木棍打孔，孔深为1～2cm，将幼苗根部放到孔中，并周围的基质填充，稍压实，喷雾淋定根水；

(8)水分、施肥及防病管理

移栽一周前，基质湿度保持80％～85％，遮阴度为60％～70％；移栽一周后，基质湿度逐渐降低至75％，遮阴度逐渐减少至50％；空气湿度始终保持65～70％；移栽15～20天后，采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾，并用清水淋洗，每7～10d施肥1次；利用500倍多菌灵、500倍75％百菌清、800倍甲霜灵复合防病，每7～10天喷施一次。

实施例3-一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)配制培养基

改良MS基本培养：在MS基本培养基中加入谷氨酸200mg/L、肌醇100mg/L、磷酸二氢钾0.17mg/L、腺嘌呤40mg/L、维生素B1 0.3mg/L、烟酸0.3mg/L；

诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.1mg/L 2,4-D、1mg/L NOA、0.1mg/L 2-IP、0.5mg/L KT、1mg/L 6-BA、蔗糖35g/L、琼脂6.5g/L，pH 5.7；

增殖培养基：在改良MS培养基中添加0.2mg/L 2,4-D、1mg/L NAA、0.1mg/L 2-ip、1mg/L 6-BA、蔗糖35g/L；

生根培养基：在改良MS培养中添加1mg/L NAA、0.5mg/L GA3、1mg/L 6-BA、蔗糖30g/L；

将上述培养基在121℃，0.15MPa高温高压下灭菌20分钟，放置凝固后备用；

(2)选取外植体

取生长高度为20cm，树龄为12个月的椰枣幼苗，将幼苗的外部叶片剥离，取出裸露出幼嫩的茎段部分作为外植体；

(3)外植体防褐化处理

将外植体在抗褐化剂中遮光浸泡3.0小时后，采用0.2％的海藻酸钠溶液中浸泡8min；所述抗褐化剂包括145～155mg/L的抗坏血酸和95～105mg/L柠檬酸；

(4)外植体灭菌处理

将浸泡后的外植体在超净工作台上进行消毒灭菌处理，消毒灭菌程序为：先将外植体于75％的酒精中浸泡30秒，用无菌水冲洗2次；采用浓度为0.01g/L山梨酸钾水溶液中浸泡90秒，用无菌水冲洗2次；采用浓度为0.02％次氯酸钠溶液浸泡1.5分钟，用无菌水冲洗3次；再在浓度0.1％的升汞溶液中浸泡8分钟，每间隔30～40s进行轻微摇晃，用无菌水冲洗6次；

(5)接种

将消毒灭菌后的外植体在超净工作台上，用无菌滤纸吸干水分后，切成若干0.8～1.2cm小段，并根据植物形态学竖立放置于诱导培养基中，让外植体的基部充分接触培养基；

(6)培养

将接种后的培养基在温度28℃的黑暗条件下诱导培养20天；待嫩芽长至2.8～3.2cm，转至27℃，12h/d的光照下培养，光照强度1800lux；

培养19天后，接种至增殖培养中进行继代增殖培养，在12h/d的光照下培养，光照强度为1900lux；

培养13天后，接种至生根培养基中进行诱导生根，在16h/d的光照下培养，光照强度为2300lux，直至获得10cm高的幼苗；

(7)移栽

将幼苗连瓶先放于控温大棚中20～23℃炼苗一周，再转移至常温下炼苗3天，再打开盖子炼苗2天，洗净根部后移栽至灭菌后的移栽基质中：

移栽基质为：泥炭土、椰糠、珍珠岩和蛭石按体积比为2:4:4:1混合而成，浇透水并覆盖薄膜保湿；移栽前，先对基质浅翻，耙平后用细木棍打孔，孔深为1～2cm，将幼苗根部放到孔中，并周围的基质填充，稍压实，喷雾淋定根水；

(8)水分、施肥及防病管理

移栽一周前，基质湿度保持80％～85％，遮阴度为60％～70％；移栽一周后，基质湿度逐渐降低至75％，遮阴度逐渐减少至50％；空气湿度始终保持65～70％；移栽15～20天后，采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾，并用清水淋洗，每7～10d施肥1次；利用500倍多菌灵、500倍75％百菌清、800倍甲霜灵复合防病，每7～10天喷施一次。

对比例组1-根据椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，区别在于：

a1:诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.1mg/L 2,4-D、1mg/L NOA、0.1mg/L2-IP、0.5mg/L KT、1mg/L 6-BA、蔗糖35g/L、琼脂6.5g/L，pH 5.7；

增殖培养基：在MS基本培养基中添加0.2mg/L 2,4-D、1mg/L NAA、0.1mg/L 2-ip、1mg/L 6-BA、蔗糖35g/L；

生根培养基：在MS基本培养中添加1mg/L NAA、0.5mg/L GA3、1mg/L 6-BA、蔗糖30g/L；其余步骤与实施例3相同。

b1:诱导培养基为：以MS为基本培养基，并添加0.01mg/L 2,4-D、0.4mg/L NOA、0.03mg/L 2-IP、0.1mg/L KT、0.2mg/L 6-BA、蔗糖35g/L、琼脂6.5g/L，其余步骤与实施例3相同。

c1:诱导培养基为：以MS为基本培养基，并添加0.2mg/L 2,4-D、1.6mg/L NOA、0.16mg/L 2-IP、1mg/L KT、2mg/L 6-BA、蔗糖35g/L、琼脂6.5g/L，其余步骤与实施例3相同。

ck:均以MS为基本培养基，其余步骤与实施例3相同。

对比例组2-根据椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，区别在于：

a2:将外植体在由160mg/L的抗坏血酸和110mg/L柠檬酸混合的抗褐化剂中浸泡3小时，其余步骤与实施例3相同。

b2:将外植体在由140mg/L的抗坏血酸和90mg/L柠檬酸混合的抗褐化剂中浸泡3小时，其余步骤与实施例3相同。

c2：将外植体在抗褐化剂中遮光浸泡3.0小时后，直接进行外植体灭菌处理，其余步骤与实施例3相同。

ck:以无菌水替代浸泡，其余步骤与实施例3相同。

对比例组3-根据椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，区别在于：

a3:将外植体于80％的酒精中浸泡30秒，用无菌水冲洗2次；采用浓度为0.03g/L山梨酸钾水溶液中浸泡90秒，用无菌水冲洗2次；采用浓度为0.04％次氯酸钠溶液浸泡1.5分钟，用无菌水冲洗3次；再在浓度0.2％的升汞溶液中浸泡8分钟，每间隔30～40s进行轻微摇晃，用无菌水冲洗6次，其余步骤与实施例3相同。

b3:将外植体于70％的酒精中浸泡30秒，用无菌水冲洗2次；采用浓度为0.005g/L山梨酸钾水溶液中浸泡90秒，用无菌水冲洗2次；采用浓度为0.01％次氯酸钠溶液浸泡1.5分钟，用无菌水冲洗3次；再在浓度0.03％的升汞溶液中浸泡8分钟，每间隔30～40s进行轻微摇晃，用无菌水冲洗6次，其余步骤与实施例3相同。

c3:将外植体于75％的酒精中浸泡30秒，用无菌水冲洗2次后；在浓度0.2％的升汞溶液中浸泡8分钟，每间隔30～40s进行轻微摇晃，用无菌水冲洗6次，其余步骤与实施例3相同。

ck:以无菌水替代浸泡，其余步骤与实施例3相同。

二、椰枣种苗繁殖效果测定

实验设计为：将实施例1～3和对比例组1～3中的对比例作为处理实验，每个处理设3个重复，并统计和计算椰枣种苗繁殖的芽诱导率、增殖倍数、生长周期、污染率、褐化率和移栽成活率，统计数据如下：

(1)外植体的不定芽诱导效果

不定芽诱导率(％)＝(诱导芽外植体数/接种数)×100％；

不定芽增殖倍数＝增殖不定芽数/接种芽数

由上表可知，通过本发明的椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，可使不定芽的诱导率最高可达87％，1周期的不定芽增殖倍数最高为3.2。而在对比例组1～3中，其不定芽诱导率降低，1周期的不定芽增殖倍数明显降低。

(2)外植体的诱导至移栽的生长周期情况

由上表可知，通过本发明的椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，可使诱导至移栽周期的生长周期明显缩短，生长速度快。而在对比例组1～3中，在生长至同等苗高的椰枣幼苗所需的生长周期明显延长。

(3)外植体处理的污染、褐化情况和移栽成活情况

外植体处理污染率(％)＝(污染的外植体株数/接种数)×100％；

外植体处理褐化率(％)＝(褐化的外植体株数/接种数)×100％；

移栽成活率(％)＝(移栽成活株数/移栽数)×100％；

由上表可知，通过本发明的椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，外植体处理的污染率可低至13.4％、褐化率可低至11.6％，且移栽的成活率明显提高。而在对比例组1～3中，外植体处理的污染率、褐化率明显增加，而移栽成活率明显降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）配制培养基

改良MS基本培养基：在MS基本培养基中加入谷氨酸195~205mg/L、肌醇98~102mg/L、磷酸二氢钾0.16~0.18mg/L、腺嘌呤38~42mg/L、维生素B1 0.2~0.4mg/L、烟酸0.2~0.4mg/L；

诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.05~0.15mg/L 2,4-D、0.5~1.5mg/L NOA、0.05~0.15mg/L 2-IP、0.2~0.8mg/L KT、0.5~1.5mg/L 6-BA、33~38g/L蔗糖、6.0~7.0g/L琼脂，pH 5.5~5.9；

增殖培养基：在改良MS培养基中添加0.1~0.3mg/L 2,4-D、0.5~1.5mg/L NAA、0.05~0.15mg/L 2-ip、0.5~1.5mg/L 6-BA、蔗糖32~38g/L；

生根培养基：在改良MS培养中添加0.5~1.5mg/L NAA、0.3~0.8mg/L GA3、0.5~1.5mg/L6-BA、蔗糖28~32g/L；

将上述培养基在120~122℃，0.13~0.16MPa高温高压下灭菌18~22分钟，放置凝固后备用；

（2）选取外植体

取生长高度为18~22cm，树龄为10~14个月的椰枣幼苗，将幼苗的外部叶片剥离，取裸露出幼嫩的茎段部分作为外植体；

（3）外植体防褐化处理

将外植体在抗褐化剂中遮光浸泡3小时后，采用0.1~0.3%的海藻酸钠溶液中浸泡5~10min；所述抗褐化剂为150mg/L的抗坏血酸和100mg/L柠檬酸；

（4）外植体灭菌处理

将浸泡后的外植体进行消毒灭菌处理，消毒灭菌程序为：先将外植体于73~78%的酒精中浸泡25~35秒，用无菌水冲洗；采用浓度为0.01~0.02g/L山梨酸钾水溶液中浸泡1~2分钟，用无菌水冲洗；采用浓度为0.02~0.03%次氯酸钠溶液浸泡1~2分钟，用无菌水冲洗；再在浓度0.05~0.15%的升汞溶液中浸泡6~10分钟，用无菌水冲洗；

（5）接种

将消毒灭菌后的外植体用无菌滤纸吸干水分后，切成若干0.8~1.2cm小段，并根据植物形态学竖立放置于诱导培养基中，让外植体的基部充分接触培养基；

（6）培养

将接种后的培养基在温度25~30℃的黑暗条件下诱导培养18~22天；待嫩芽长至2.5~3.5cm，转至26~28℃，12h/d的光照下培养，光照强度1500lux～2000lux；

培养18~20天后，接种至增殖培养中进行继代增殖培养，在12h/d的光照下培养，光照强度为1800lux～2000lux；

培养10~15天后，接种至生根培养基中进行诱导生根，在16h/d的光照下培养，光照强度为2000lux~2500lux，直至获得9~12cm高的幼苗；

（7）移栽

将幼苗连瓶先放于控温大棚中20~23℃炼苗一周，再转移至常温下炼苗2~3天，再打开盖子炼苗1~2天，洗净根部后移栽至灭菌后的移栽基质中；

移栽基质为：泥炭土、椰糠、珍珠岩和蛭石按体积比为（1~2）:（3~5）:（3~5）:1混合而成，浇透水并覆盖薄膜保湿；移栽前，先对基质浅翻，耙平后用细木棍打孔，孔深为1~2cm，将幼苗根部放到孔中，并把周围的基质填充，稍压实，喷雾淋定根水；

（8）水分、施肥及防病管理

移栽一周前，基质湿度保持80%~85%，遮阴度为60%~70%；移栽一周后，基质湿度逐渐降低至75%，遮阴度逐渐减少至50%；空气湿度始终保持65~70%；移栽15~20天后，采用0.2%~0.3%尿素溶液喷雾，并用清水淋洗，每7~10d施肥1次；利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，每7~10天喷施一次。

2.根据权利要求1所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（1）中，改良MS基本培养基：在MS基本培养基中加入谷氨酸200mg/L、肌醇100mg/L、磷酸二氢钾0.17mg/L、腺嘌呤40mg/L、维生素B1 0.3mg/L、烟酸0.3mg/L；

诱导培养基：以MS为基本培养基，并添加0.1mg/L 2,4-D、1mg/L NOA、0.1mg/L 2-IP 、0.5mg/L KT、1mg/L 6-BA、蔗糖35g/L、琼脂6.5g/ L，pH 5.7；

增殖培养基：在改良MS培养基中添加0.2mg/L 2,4-D、1mg/L NAA、0.1mg/L 2-ip、1mg/L6-BA、蔗糖35g/L；

生根培养基：在改良MS培养中添加1mg/L NAA、0.5mg/L GA3、1mg/L 6-BA、蔗糖30g/L。

3.根据权利要求1所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（1）中，将培养基在温度121℃，0.15MPa的高温高压下灭菌20分钟。

4.根据权利要求1所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（2）中，椰枣幼苗的生长高度为20cm，树龄为12个月。

5.根据权利要求1所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（3）中，将外植体在抗褐化剂中浸泡后，采用0.2%的海藻酸钠溶液中浸泡8min。

6.根据权利要求1所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（4）中，将外植体于75%的酒精中浸泡30秒，用无菌水冲洗1~2次；采用浓度为0.01g/L山梨酸钾水溶液中浸泡90秒，用无菌水冲洗1~3次；采用浓度为0.02%次氯酸钠溶液浸泡1.5分钟，用无菌水冲洗2~3次，再在浓度0.1%的升汞溶液中浸泡8分钟，用无菌水冲洗4~6次。

7.根据权利要求6所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（4）中，外植体在升汞溶液中浸泡 时，每间隔30~40s进行轻微摇晃。

8.根据权利要求1所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（6）中，将接种后的培养基在温度28℃的黑暗条件下诱导培养20天；待嫩芽长至2.8~3.2cm，转至27℃，12h/d的光照下培养，光照强度1800lux；

培养19天后，接种至增殖培养中进行继代增殖培养，在12h/d的光照下培养，光照强度为1900lux；

培养13天后，接种至生根培养基中进行诱导生根，在16h/d的光照下培养，光照强度为2300lux，直至获得10cm高的幼苗。

9.根据权利要求1所述的一种椰枣的组织培养中快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述移栽基质中的泥炭土、椰糠、珍珠岩和蛭石按体积比为2:4:4:1混合。

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