CN105309315B - 一种胚状体途径的艾纳香组培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胚状体途径的艾纳香组培方法，其包括预处理、脱毒方法、胚性愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、丛生苗诱导、壮苗培养和生根培养等过程的优化，该方法的特征在于首次通过胚性愈伤组织途径的艾纳香组培方法，其特征培养基为艾纳香胚性愈伤组织的诱导培养基，包括含有10～30mg/L肌醇，0.1～2.0 mg/L 2,4‑D，0.1～2.0 mg/L NAA，0.2～0.5 mg/L 6‑BA和0.1～2.0 mg/L TDZ的3/4 MS培养基，其应用艾纳香种苗繁育中，具有增殖率高、成本低、生根率和移苗成活率高、生长周期不受季节限制等优点，此外，亦可用于多倍体诱导、突变诱导、转基因种质创新等艾纳香种质创新和新品种选育。

Description

一种胚状体途径的艾纳香组培方法

技术领域

本发明涉及组织培育技术领域，更具体地，涉及一种胚状体途径的艾纳香组培方法。

背景技术

艾纳香（Blumea balsamifera (L.) DC）隶属于菊科旋复花族，是我国海南、贵州、云南、广东等省区的特色道地药材，其提取物艾片、艾粉和艾油是“咽立爽滴丸”、“万金香气雾剂成分”、“金喉健喷雾剂”、“消炎止咳片”、“心胃丹胶囊”、“咽康含片（咽特佳）”等咽喉炎、咽喉肿疼、肠胃性疾病民族药的主要原料，疗效确切，市场前景好，年产值1.5～2.0亿元；此外，艾纳香还富含萜类和黄酮类化合物，其不仅含有l-龙脑、α-蒎烯、l-樟脑等单萜类化合物，还含有β-石竹烯等倍半萜类化合物，亦含有黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类等多种黄酮类化合物，是研究化合物积累的分子调控机制、合成代谢策略等的重要载体。

艾纳香的规范化种苗繁育技术及规范化种植技术是满足市场对艾纳香提取物需求的重要保证，但是长期以来，其种苗繁育一直依赖于分株繁殖或种子繁殖，繁殖效率低、种苗质量参差不齐、土传病虫害严重等严重影响了艾纳香种苗繁育和规范化种植。

现有技术中介绍了艾纳香种子苗繁育方法，其中涉及人工养蜂授粉、种子水槽营养液培养提高种子育性、苗床处理、基质配方和播种方式等种子苗繁育方法，但是其种子苗繁育受季节限制，繁育量及种苗质量等均受限制，且无法进行脱毒，无法解决艾纳香种苗繁育种的土传病虫害问题；现有技术中关于艾纳香组培苗生产方法主要包括外植体消毒、丛生苗的诱导、生根和炼苗移栽等环节，从技术而言，其都属于艾纳香组培脱毒快繁体系，其体系不经过愈伤组织诱导，存在脱毒率低、容易褐化（增殖率＜20%），变异率高，繁殖效率低、年繁殖种苗数量有限等问题。

植物转基因育种的前提是获得能够很好的耐受转基因的植株，愈伤组织是很好的转基因材料，现有技术中很少有通过胚状体途径的艾纳香组培方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，首先是提供一种胚状体途径的艾纳香愈伤组织的诱导培养基。

本发明的第二个目的是提供一种愈伤组织的增殖培养基。

本发明的第三个目的是提供一种丛生苗的诱导培养基。

本发明的第四个目的是提供一种艾纳香的生根培养基。

本发明的第五个目的提供一种胚状体途径的艾纳香组培方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种艾纳香愈伤组织的诱导培养基，包括含有10～30mg/L肌醇，0.1～2.0 mg/L2,4-D，0.1～2.0 mg/L NAA，0.2～0.5 mg/L 6-BA和0.1～2.0 mg/L TDZ的3/4 MS培养基。

发明人研究发现在3/4 MS培养基基础上额外添加肌醇能够显著诱导艾纳香愈伤组织的生成。

本发明所述生长激素和细胞分裂素的浓度对诱导获得的愈伤组织影响显著，现有对于艾纳香培育中，虽然也用到了NAA和6-BA，但都是NAA的浓度较低，6-BA的浓度反而较高，而在本发明中，发现必须控制6-BA在较低的浓度，NAA在较高的浓度，才更适合愈伤组织的诱导，其获得愈伤组织含水量高，处于松散状态，更利于实际在转基因育种等研究中。

优选地，所述肌醇的浓度为10～20mg/L。

更优选地，所述愈伤组织的诱导培养基中含有0.5mg/L 2,4-D，1.0mg/L NAA，0.2mg/L 6-BA和0.2 mg/L TDZ，其pH值为5.6～6.0。

本发明还提供一种艾纳香愈伤组织的增殖培养基，包括含有10～30mg/L肌醇，添加0.5 mg/L 2,4-D，0.5 mg/L NAA，0.5 mg/L 6-BA或者添加0.5 mg/L的2,4-D、1.0 mg/L的NAA，0.2 mg/L TDZ的3/4 MS培养基。

本发明还提供一种艾纳香丛生苗的诱导培养基，包括含有10～30mg/L肌醇，添加0.1～2.0 mg/L 6-BA，0.1～2.0 mg/L TDZ的3/4 MS培养基。

本发明还提供一种艾纳香的生根培养基，包括含有10～30mg/L肌醇，添加0.1%～1.0% 活性炭或0.05～0.1 mg/L NAA的3/4 MS培养基。

本发明还提供一种胚状体途径的艾纳香组培方法，包括以下步骤：

S1. 外植体消毒：将艾纳香叶片或茎尖外植体经预处理后，先用酒精消毒，后在含有吐温80、硝酸银的升汞中消毒5～20min；

S2. 愈伤组织诱导：消毒后的外植体接种于所述的愈伤组织的诱导培养基上培养至长出愈伤组织；

S3. 增殖培养：将愈伤组织接种于所述增殖培养基上增殖愈伤组织；

S4. 丛生苗诱导培养：将增殖后的愈伤组织接种于所述丛生苗诱导培养基上诱导丛生苗；

S5. 壮苗培养：将诱导出的丛生苗艾切割成带有1个顶芽或1～2个腋芽、且长度为1.0～2.0 cm的茎段然后接种于壮苗培养基进行壮苗；

S6. 生根培养：待艾纳香苗生长长度为2.0～3.0 cm，转接于所述生根培养基中进行生根培养；

S7. 将艾纳香苗进行室内炼苗后移栽至培养基质中完成组培。

优选地，上述方法中S5视种苗需求数量可壮苗25～30d；S6所述生根培养到艾纳香根的生长长度为1.5～2.0 cm；S7所述炼苗培养是将生根培养的艾纳香苗于隐蔽度为15%～20%的荫棚，炼苗7～10d；将经过炼苗后艾纳香苗移栽于含10%～15%蛭石，10%～15%牛粪，10%～15%椰糠和55%～70%土壤的育苗杯，即完成艾纳香的胚状体途径组培苗繁育方法。

优选地，S2～S6所述培养条件为温度25～28℃、湿度为70%～80%、光照强度为50～70 lx、光照8～10 h/d。

本发明是通过胚状体途径的一种艾纳香的组织培养方法，其首要目的是获得合适的愈伤组织，研究发现，愈伤组织诱导过程中光照对其影响显著，这里需要控制低光照。

优选地，S1所述吐温80的浓度为0.5～2.0 wt %，所述硝酸银的浓度为5～30 mg/L；更优选地，S1所述吐温80的浓度为1.0wt %，所述硝酸银的浓度为10 mg/L。

优选地，S1所述预处理是：将艾纳香叶片或茎尖外植体至于含有0.5～2.0 wt %吐温80和5～30 mg/L硝酸银的溶液中15～30min。

优选地，S1是将经过预处理的艾纳香外植体用70%酒精消毒30s后，在含有1.0 wt%吐温80，10 mg/L硝酸银和0.1%升汞的溶液中消毒30 min。

这里，吐温80可以提高消毒效率，而硝酸银则可以一直乙烯的产生而减少褐化。本发明所述方法在要求高的移栽成活率的同时也要保证外植体高的消毒率和低的褐化率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首先提供了一种艾纳香愈伤组织的诱导培养基，包括含有10～30mg/L肌醇，0.1～2.0 mg/L 2,4-D，0.1～2.0 mg/L NAA，0.2～0.5 mg/L 6-BA和0.1～2.0 mg/LTDZ的3/4 MS培养基，并提供了一种胚状体途径的艾纳香组培方法，是通过预处理、优化脱毒方法、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、丛生苗诱导、壮苗培养和生根培养程序，与传统繁殖方法相比，具有省工省时省地，成本低，繁殖率高（增殖系数＞30代/年）、成活率高（＞95%），该方法通过愈伤组织途径，较适合多倍体诱导、突变诱导、转基因等种质创新，其不仅解决了艾纳香繁殖周期长、增殖效率低和成本高的问题，还是艾纳香多倍体育种、转基因育种的重要基础，还具有增殖率高、成本低、生根率和移苗成活率高、生长周期不受季节限制、可用于多倍体育种、转基因育种及种质创新等优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所用的艾纳香外植体为2013年6月份～2014年11月份在海南省儋州市艾纳香种质资源保存圃采集的艾纳香叶片或茎尖为实验材料。

实施例中污染率是指接种10d后被细菌或真菌污染的外植体瓶数占总接种瓶数的百分率；褐化率是指接种10d后外植体褐化变黑的瓶数占总接种瓶数的百分率；存活率是指接种10d后未褐化也未污染的外植体瓶数占总接种瓶数的百分率；增殖率是指接种10d后外植体开始生长的瓶数占总接种瓶数的百分率；增殖系数是指接种30d后，与原接种量相比，增殖的倍数百分率。

实施例1 艾纳香外植体消毒程序优化

一、渗透剂和保护剂对艾纳香外植体褐化的影响

1、实验方法：将艾纳香茎尖外植体或叶片外植体分为10组，首先用含有不同浓度的吐温80和硝酸银处理15～30min，再用70%酒精消毒30s和0.1%升汞消毒10 min，无菌水漂洗5次至pH=7，每组处理20瓶，重复3次，接种于不含激素的MS培养基上，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计污染率与增殖率；结果是：当艾纳香外植体不经预处理，直接用70%酒精和0.1%升汞消毒10min后，其外植体大多污染或褐化，推测其与升汞等消毒剂无法渗入组织内部和在消毒过程中乙烯产生而导致褐化有关。

2、以正交实验为实验优化方法，通过设置一系列吐温80浓度（0.5%～2.0%）和硝酸银浓度（5～30 mg/L），通过预处理降低艾纳香外植体高污染率和褐化率，结果如表1所示：（1）当控制吐温80浓度为0.5%～2.0wt%，硝酸银浓度为5～30 mg/L，处理时间为15～30min时， 均降低了艾纳香外植体的褐化率和污染率，增加了其存活率；（2）当控制吐温80浓度为1.0 wt %，硝酸银浓度为10 mg/L，处理时间为30min 时，显著降低了艾纳香外植体的褐化率和污染率，接种10d，其外植体存活率为35±3%。

二、消毒剂浓度和处理时间对艾纳香外植体消毒效果的影响

实验方法：将艾纳香茎尖外植体或叶片外植体分为10组，先用70%酒精消毒30s～150s，用无菌水冲洗3～5次，再用含有0.5%～2.0%（质量分数）吐温-80和5～30 mg/L硝酸银的0.1%升汞消毒5～20min，无菌水漂洗5次至pH=7，每组处理20瓶，重复3次，接种于不含激素的MS培养基上，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计污染率与增殖率。

结果如表2所示：（1）与CK相比，在0.1%升汞中添加0.5%～2.0%（质量分数）吐温80和5～30mg/L的硝酸银，均降低了艾纳香外植体的褐化率和污染率，增加了其存活率；（2）当控制70%酒精消毒30s，控制0.1%升汞消毒剂中的吐温80浓度为1.0%，硝酸银浓度为10 mg/L，消毒时间为10min 时，其消毒效果最佳，外植体存活率为60±4%，褐化率为15±3%。

实施例2 基础培养基的筛选及优化

将艾纳香茎尖外植体或叶片外植体分为20组，先用70%酒精消毒30s，用无菌水冲洗3～5次，再用含有0.5%～2.0%吐温80和5～30mg/L的硝酸银的0.1%升汞10min，无菌水漂洗5次至pH=7，每组处理20瓶，重复3次，接种于不同配方的改良MS培养基上，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计外植体生长状况。

为寻找适宜于艾纳香组织培养的最优培养基，通过设置一系列的盐浓度梯度（MS、3/4MS和1/2MS）和附加10～30mg/L的肌醇对艾纳香组织培养条件（外植体生长）进行了优化，结果如表3和表4所示，（1）与MS基本培养基相比，在MS基本培养基附加10～30mg/的肌醇对艾纳香外植体生长具有显著促进作用，其提高了艾纳香增殖率，改善了艾纳香外植体的生长状况；（2）适宜于艾纳香外植体生长培养的改良MS培养基为：3/4MS培养基为基础培养基，并附加20mg/L的肌醇作为营养物质，该方案为艾纳香外植体生长最佳基础培养基，下文所有的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、丛生苗诱导培养基、壮苗培养基和生根培养均以此改良培养基为基础培养基，并附加不同浓度的植物生长调节剂；（3）当以3/4MS培养基为基础培养基，并附加20mg/L的肌醇作为营养物质后再附加其它营养成分，对艾纳香外植体生长无显著促进作用。

实施例3 愈伤组织诱导培养基的筛选及优化

将艾纳香茎尖外植体或叶片外植体分为10组，先用70%酒精消毒30s，用无菌水冲洗3～5次，再用含有0.5%～2.0%吐温80和5～30mg/L的硝酸银的0.1%升汞10 min，无菌水漂洗5次至pH=7，接种于以改良MS培养基为基础，并附加不同浓度的植物生长调节剂的愈伤组织诱导培养基，每组处理20瓶，重复3次，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计外植体生长状况。

合适的生长素/细胞分裂素比例有利于愈伤组织的增殖，当比例过高，容易导致愈伤组织褐化；过低则会使得愈伤组织不增殖或增殖系数较低，为寻找适宜于艾纳香愈伤组织增殖培养基，通过设置一系列的生长素和细胞分裂素浓度对艾纳香愈伤组织增殖条件进行了优化，结果如表4所示：（1）上述实验设计均诱导出艾纳香愈伤组织，但不同浓度的培养基组合的愈伤组织褐化率、诱导率和增殖率差异较大；（2）艾纳香愈伤组织诱导的最适培养基为：改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的2,4-D、1.0mg/L的NAA、0.2 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的TDZ为最佳基础培养基，该培养基的诱导率为100%，增殖率800%，愈伤组织呈奶白色。

实施例4 愈伤组织增殖培养基的筛选及优化

将艾纳香愈伤组织分为10组，接种于以改良MS培养基为基础，并附加不同浓度的植物生长调节剂的愈伤组织增殖培养基上，每组处理20瓶，重复3次，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计愈伤组织增殖状况。

合适的生长素/细胞分裂素比例有利于愈伤组织的增殖，当比例过高，容易导致愈伤组织褐化；过低则会愈伤组织不增殖或增殖系数较低，为寻找适宜于艾纳香愈伤组织增殖培养基，本研究通过设置一系列的生长素和细胞分裂素浓度对艾纳香愈伤组织增殖条件进行了优化，结果如表5所示：（1）上述实验设计均诱导艾纳香愈伤组织增殖，但不同浓度的培养基组合的愈伤组织增殖率、褐化率及生长速度差异较大；（2）艾纳香愈伤组织增殖的最适培养基为：改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的2,4-D、0.5 mg/L的NAA和0.5mg/L的6-BA或者0.5 mg/L的2,4-D、1.0 mg/L的NAA，0.2 mg/L的TDZ为最佳培养基，这两种培养基的增殖率为100%，愈伤组织呈奶白色。

实施例5 丛生苗诱导培养基的筛选和优化

将经增殖的艾纳香愈伤组织分为10组，接种于以改良MS培养基为基础，并附加不同浓度的植物生长调节剂的丛生苗诱导培养基上，每组处理20瓶，重复3次，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计丛生苗诱导生长状况。

合适的细胞分裂素/生长素比例有利于丛生苗的诱导，当比例过高，容易导致丛生苗生长过密，苗株纤细；过低则会引起丛生苗繁殖系数过低，甚至愈伤组织化，为寻找适宜于艾纳香丛生苗诱导培养基，通过设置一系列的生长素和细胞分裂素浓度对艾纳香丛生苗诱导条件进行了优化，结果如表6所示：（1）上述实验设计均诱导艾纳香愈伤组织分化出丛生苗，但丛生苗生长状况差异较大；（2）艾纳香丛生苗诱导的最适培养基为：改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的6-BA和TDZ为最佳培养基，该培养基的丛生苗诱导率为100%，月增殖系数≥30，苗呈现粗壮。

实施例6 壮苗诱导培养基的筛选及优化

将诱导的艾纳香丛生苗分为11组，每组处理20瓶，重复3次，接种于以改良MS培养基为基础，并附加不同浓度的有机营养物质上，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计丛生苗生长状况。

经过丛生苗诱导培养基的艾纳香丛生苗呈现植株纤细、叶片小且薄，研究发现如果直接进行生根培养，其后期移栽成活率较低，本研究通过考察5%～20%浓度的椰子水、香蕉泥和土豆泥等营养物质对艾纳香组培条件进行了优化，结果如表7所示，（1）与不经过壮苗培养的艾纳香组培苗相比，经过壮苗培养的艾纳香组培苗均呈现茎粗壮、叶片厚且浓绿；（2）其中椰子水对艾纳香壮苗效果最为明显，但是本着经济因素考虑，适宜于艾纳香组培的最适壮苗培养基为：改良MS培养基，不附加其它营养物质。

实施例7 生根培养基的筛选及优化

将经过壮苗培养的艾纳香丛生苗分为10组，每组处理20瓶，重复3次，接种于以改良MS培养基为基础，并附加不同浓度的植物生长调节剂的生根培养基上，置于30℃恒温培养箱全光照培养，于10～12d后统计外植体生根状况。

生根培养是植物组织培养中的最后一个环节，其中根的生长状况如数目、粗细等对后期的炼苗移栽至关重要，本研究中考察了0.05～0.20mg/L的生长素（NAA和IAA）和0.1%～1.0%的活性炭对艾纳香生根的影响，结果见表8：（1）与对照相比，0.05～0.20 mg/L的生长素（NAA或IAA）或0.1%～1.0wt%的活性炭均提高了艾纳香的生根率和炼苗移栽的成活率，但对丛生苗生长状况无显著影响；（2）艾纳香丛生苗的最优生根培养基为改良培养基为基础，并附加0.1 mg/L的NAA，该培养方法下的艾纳香丛生苗生根效率高（100%），炼苗移栽成活率大于95%，且苗生长粗壮，分支多。

本发明中一种艾纳香胚状体途径完成后，可进行苗木移栽和大田定植，即生根后的艾纳香组培苗继续培养15～20天，然后移栽到塑料小钵中（小钵中的培养基质为草炭土和沙土的混合物），放到温室或大棚中进行培养，注意保持温室和大棚内良好的通风，移苗成活率达95%以上；待苗高15～40厘米时可供大田中生产定植。

实施例8

艾纳香胚状体途径的组培方法，包括以下步骤：

S1. 外植体预处理：将采集的艾纳香叶片在含有1.0%的吐温80和10mg/L硝酸银溶液中预处理30 min。

S2. 外植体消毒：将经过预处理的艾纳香叶片外植体首先用70%酒精消毒30s后，用无菌水冲洗5次；再在含有1.0%吐温80，10 mg/L硝酸银和0.1%升汞的复合消毒剂上消毒10 min，再用无菌水冲洗5次，即得到艾纳香无菌外植体。

S3. 愈伤组织诱导：将经过预处理和消毒的艾纳香外植体接种于以改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的2,4-D、1.0mg/L的NAA、0.2 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的TDZ、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0的愈伤组织诱导培养基，在温度为28℃、湿度为70%、光照强度为70 lx、光照8 h/d的条件下培养15～20d，即得艾纳香愈伤组织，该愈伤组织呈现奶白色、松散。

S4. 愈伤组织增殖：将增殖的艾纳香愈伤组织接种于以改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的2,4-D、0.5 mg/L的NAA和0.5 mg/L的6-BA、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0的愈伤组织增殖培养基，在温度为28℃、湿度为70%、光照强度为70 lx、光照8 h/d的条件下培养15～20d，即得增殖后艾纳香愈伤组织，该愈伤组织呈现奶白色、松散。

S5. 丛生苗诱导：将增殖后艾纳香愈伤组织接种于以改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的6-BA、0.5 mg/L的TDZ、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0为丛生苗诱导培养基，在温度为28℃、湿度为70%、光照强度为70 lx、光照8 h/d的条件下培养15～20d，即得艾纳香丛生苗，丛生苗高5～7 cm。

S6. 壮苗培养：将艾纳香丛生苗接种于以改良培养基为基础培养基，并附加3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0为壮苗培养基，在温度为28℃、湿度为70%、光照强度为70 lx、光照8 h/d的条件下培养15～20d，即得艾纳香单株壮苗，苗高5～7cm。

S7. 生根培养：将经过壮苗的艾纳香单苗接种于以改良培养基为基础培养基，并附加0.1mg/L的NAA、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0为生根培养基，在温度为28℃、湿度为70%、光照强度为70 lx、光照8 h/d的条件下培养15～20d，即得艾纳香组培苗，苗高5～7cm。

S8. 炼苗培养：将生根培养的艾纳香苗于隐蔽度为20%的荫棚炼苗8d；将经过炼苗后艾纳香组培苗移栽于含15%蛭石，15%牛粪，15%椰糠，55%土壤的育苗杯。

本实例中的艾纳香消毒率为67%，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织增殖率为100%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为40，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.5～0.7cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率95%，是艾纳香胚状体途径组培方法的最优方式。

实施例9

实验方法同实施例8，唯一不同的是：S2的消毒时间为5min。

本实例中的艾纳香消毒率为20 %，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织增殖率为100%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为40，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.5～0.7cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率75%，可用于艾纳香胚状体途径组培苗生产，但是其因消毒率较低，会加大艾纳香组培苗成本和增加育种时间。

实施例10

实验方法同实施例8，唯一不同的是，S3所用的愈伤组织诱导培养基为：以改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的2,4-D、0.5mg/L的NAA、0.2 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的TDZ、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0。

本实例中的艾纳香消毒率为67%，愈伤组织诱导率为60%，愈伤组织增殖率为80%，丛生苗诱导率为90%，月增殖系数为25，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.5～0.7cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率85%，可用于艾纳香胚状体途径组培苗生产，但是其因愈伤组织诱导率和增殖率较低，月增殖系数低，会加大艾纳香组培苗成本和增加育种时间。

实施例11

实验方法同实施例8，唯一不同的是，S3所用的愈伤组织诱导培养基为：以改良培养基为基础培养基，并附加0.5 mg/L的2,4-D、0.5 mg/L的NAA、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0。

本实例中的艾纳香消毒率为67%，愈伤组织诱导率为50%，愈伤组织增殖率为70%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为40，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.5～0.7cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率70%，本实例可用于艾纳香胚状体途径组培苗生产，但是其因愈伤组织诱导率和增殖率较低，会加大艾纳香组培苗成本和增加育种时间。

实施例12

实验方法同实施例8，唯一不同的是，S5所用的丛生苗诱导培养基为：以改良培养基为基础培养基，并附加0.2 mg/L的NAA、1.0 mg/L的6-BA、1.0 mg/L的TDZ、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0。

本实例中的艾纳香消毒率为67%，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织增殖率为100%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为50，壮苗培养后苗茎粗达到0.1～0.3cm，苗高5～7 cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5 cm，经炼苗后移栽成活率75%，本实例可用于艾纳香胚状体途径组培苗生产，但是其因组培苗纤细，会导致后期工人加工能力降低，后期移栽成活率也相对降低，增加艾纳香组培苗成本。

实施例13

实验方法同实施例8，唯一不同的是，其不经过壮苗培养，直接进入生根培养。

本实例中的艾纳香消毒率为67%，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织增殖率为100%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为40，壮苗培养后苗茎粗达到0.3～0.5cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率88%，本实例可用于艾纳香胚状体途径组培苗生产，但是其因不仅壮苗培养，其组培苗纤细，会导致后期移栽成活率也相对降低，增加艾纳香组培苗成本。

实施例14

实验方法同实施例8，唯一不同的是，S6所述壮苗培养基为：以改良培养基为基础培养基，并附加10%的土豆泥、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0。

本实例中的艾纳香消毒率为67%，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织增殖率为100%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为40，壮苗培养后苗茎粗达到0.3～0.5cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率95%，本实例可用于艾纳香胚状体途径组培苗生产，但是与实施例1相比，其需要额外增加土豆泥，会增加艾纳香组培苗成本。

实施例15

实验方法同实施例8，唯一不同的是，S7所述生根培养基为：以改良培养基为基础培养基，并附加0.1mg/L的IAA、3.0%的蔗糖，pH值为5.6～6.0。

本实例中的艾纳香消毒率为67%，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织增殖率为100%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为40，壮苗培养后苗茎粗达到0.3～0.5cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率92%，本实例可用于艾纳香胚状体途径组培苗生产，会增加艾纳香组培苗成本。

Claims (5)

1.一种艾纳香愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基是含有10～30mg/L肌醇，0.1～2.0 mg/L 2,4-D，0.1～2.0 mg/L NAA，0.2～0.5 mg/L 6-BA和0.1～2.0 mg/LTDZ的3/4 MS培养基。

2.一种胚状体途径的艾纳香组培方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 外植体消毒：将艾纳香叶片或茎尖外植体经预处理后，先用酒精消毒，后在含有吐温80、硝酸银的升汞中消毒5～20min；

S2. 愈伤组织诱导：消毒后的外植体接种于权利要求1所述的愈伤组织的诱导培养基上培养至长出愈伤组织；

S3. 增殖培养：将愈伤组织接种于增殖培养基上增殖愈伤组织；所述增殖培养基是含有10～30mg/L肌醇，添加0.5 mg/L 2,4-D，0.5 mg/L NAA，0.5 mg/L 6-BA的3/4 MS培养基或者是含有10～30mg/L肌醇，添加0.5 mg/L的2,4-D、1.0 mg/L的NAA，0.2 mg/L TDZ的3/4MS培养基；

S4. 丛生苗诱导培养：将增殖后的愈伤组织接种于丛生苗诱导培养基上诱导丛生苗；所述丛生苗诱导培养基是含有10～30mg/L肌醇，添加0.1～2.0 mg/L 6-BA，0.1～2.0 mg/LTDZ的3/4 MS培养基；

S5. 壮苗培养：将诱导出的丛生苗艾切割成带有1个顶芽或1～2个腋芽、且长度为1.0～2.0 cm的茎段然后接种于壮苗培养基进行壮苗；

S6. 生根培养：待艾纳香苗生长长度为2.0～3.0 cm，转接于生根培养基中进行生根培养；所述生根培养基是含有10～30mg/L肌醇，添加0.1%～1.0% 活性炭或0.05～0.1 mg/LNAA的3/4 MS培养基。

S7. 将艾纳香苗进行室内炼苗后移栽至培养基质中完成组培。

3.根据权利要求2所述的艾纳香组培方法，其特征在于，S2～S6所述培养条件为温度25～28℃、湿度为70%～80%、光照强度为50～70 lx、光照8～10 h/d。

4.根据权利要求2所述的艾纳香组培方法，其特征在于，S1所述吐温80的浓度为0.5～2.0 wt %，所述硝酸银的浓度为5～30 mg/L。

5.根据权利要求2所述的艾纳香组培方法，其特征在于，S1所述预处理是：将艾纳香叶片或茎尖外植体至于含有0.5～2.0 wt %吐温80和5～30 mg/L硝酸银的溶液中15～30min。